UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

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FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
QUÍMICA
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3° PRÁCTICA DE LABORATORIO
Tema: Tinción de gram

Integrantes:

➔ Arrieta Arrieta, Shandall

➔ Pacheco Mendoza, Abner

➔ Ramos Huaya, Adriana

➔ Reyes Córdova, Mayk

Grupo: 91G (grupo 2)

Curso: Laboratorio Microbiología

Profesor(a): Sonia Herrera Sanchez

Callao, 12 de setiembre del 2022

 Tabla de contenido
I. INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 3
II. OBJETIVOS.................................................................................................................... 4
III. MARCO TEÓRICO......................................................................................................5
IV. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.........................................................8
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL..............................................................................9
VI. RESULTADOS..........................................................................................................14
VII. DISCUSIÓN............................................................................................................... 15
VIII. RECOMENDACIONES..............................................................................................16
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................17
X. ANEXO.......................................................................................................................... 18
XI. CUESTIONARIO.......................................................................................................19
 I. INTRODUCCIÓN

Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El

mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se
vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la
retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de
tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo, donde
forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona
empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos
Gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no
puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más
abundantes que en las células Gram positivas) se disuelven por este
tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.
Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general
de la pared celular. Varias son las teorías emitidas para explicar el
mecanismo de la tinción de Gram.
Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la
facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y
carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones
alcalinas lo hacen con las bases. La tinción de Gram o coloración Gram es un
tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de
bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que
desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.
En este informe realizaremos una prueba de tinción gram y veremos las
diferencias entre los microorganismos gram positivos y negativos según la
coloración que estos presenten en el experimento.
 II. OBJETIVOS

● Introducir a los estudiantes en los fundamentos, utilidades y

procedimientos aplicados a las tinciones bacterianas, para la
observación de las principales estructuras.
● Dar a conocer que las diferencias que poseen las bacterias
gramnegativas y grampositivas.
● Aprender el uso de cada colorante por separado y su función en la
tinción Gram.
 III. MARCO TEÓRICO

Las bacterias son microorganismos unicelulares que conviven habitualmente

con el ser humano. En muchos casos forman parte de nuestra flora habitual y
la de nuestro entorno sin ocasionar ningún peligro para la salud. En otras
situaciones, las bacterias pueden ser patógenas, es decir, producen
infecciones de diversos tipos: cutáneas, abdominales, óseas, etc.
Para poder identificarlas y tratarlas es necesario clasificarlas. Las diferentes
clasificaciones atienden a diversos criterios y características bacterianas:
morfología, metabolismo, presencia de pared celular, etc.
Una de las maneras de diferenciar a las bacterias es en base a la presencia
de una pared celular. Así, hay bacterias con una pared gruesa (formada por
peptidoglicanos) y otras con una pared mucho más delgada.

¿En qué consiste la tinción de Gram?

La tinción de Gram se utiliza en microbiología desde finales del siglo XIX. Es

una técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante (tinción) y
que tiene una gran utilidad en medicina.
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias
para observarlas mejor bajo el microscopio. Según la distribución del
peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u
otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan
Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos
capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele
la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.
Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por
un gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la
tinción Gram, dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican
como Gram +.
La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar
el tipo de antibiótico así como su eficacia. El antibiótico de elección ha de ser
capaz de atravesar la pared bacteriana, en función de si la bacteriana es
gram positiva o negativa se seleccionará el antibiótico más eficaz.

Fuente: Castellanos A. (2021). Diferencias entre bacterias gram positivas y

gram negativas.

Nota: Diferencia de coloración entre gram positivas y gram negativas.

¿Cómo se realiza la tinción de Gram?

La primera parte es recoger la muestra, la cual debe ser líquida o, al menos,

viscosa, por lo que en caso de que el tejido sea sólido, deberá pasar por
algún procesado previo para diluir en solución líquida. Sea como sea, se
debe extender la muestra en un portaobjetos de cristal. En este punto,
debemos dejar que la muestra se seque en el propio aire. Como será muy
fina, tardará poco tiempo en hacerlo.

Una vez seca, es decir, cuando ya no quede agua, aplicamos metanol al

portaobjetos, directamente encima de la muestra. Este compuesto químico es
un alcohol, por lo que, si las bacterias estaban vivas, morirán al instante. Esto
no es ningún problema, pues pueden visualizarse perfectamente estando
muertas. Este paso es imprescindible ya que así quedan pegadas a la
superficie del portaobjetos y no las perderemos en los siguientes pasos.
Ahora es el momento de añadir el primer colorante (recordemos que, al ser
una tinción diferencial, se utilizan dos), que es el violeta de genciana, también
conocido como cristal violeta. Este primer colorante teñirá todas las bacterias
de color púrpura, después de dejar que actúe durante unos minutos. Se
añade también un compuesto conocido como Lugol, que sirve para impedir la
salida del colorante de las células en las que ha entrado.

Pasado este tiempo, se lava la muestra para retirar el exceso de colorante y

se añade una mezcla de alcohol y acetona. Este es el punto clave, pues esta
sustancia química desteñirá aquellas bacterias que no han absorbido el
primer colorante. Al poco tiempo, para evitar que las destiña todas, debe
retirarse el alcohol-acetona con agua. En este momento ya podríamos
visualizar las gram positivas (si es que las hay). Pero faltan las gram
negativas. Y aquí entra en juego el segundo colorante: la safranina o fucsina.
Con este paso conseguimos que las bacterias que han perdido el primer
colorante (de color púrpura) se tiñan de color rosa o rojo. Ahora ya tenemos
las gram negativas (si es que las hay).

Factores que alteran la tinción de Gram

● Edad de la bacteria.
● Errores del operador.
 ● Uso de antibióticos

IV. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO

PORTAOBJETOS MECHERO BUNSEN ASA DE SIEMBRA

PLACAS PETRI CON CUBETAS DE COLORANTES PARA LAS

CULTIVO DE TINCIÓN O TINCIONES: CRISTAL
BACTERIAS GRAM LAVADERO VIOLETA, LUGOL,
POSITIVAS Y GRAN ALCOHOL-ACETONA (1:1)
NEGATIVAS Y SAFRANINA
 V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1 Limpiamos y secamos el vidrio portaobjetos, al mismo tiempo calentamos en el

mechero el asa de siembra hasta que se note una coloración anaranjada.

Fig. 1 Fig. 2
portaobjetos limpios Calentamiento del asa
y secos de siembra

Autor: El equipo Autor: El equipo

5.2 Con el asa de siembra calentada, se tomará una pequeña muestra de bacterias
de la caja Petri para luego colocarlas en un portaobjeto. Para el primer tipo de
bacterias, la muestra usada fue de una placa Petri que contenía un cultivo de color
fucsia.

Fig. 3
Colocación de la muestra al portaobjeto

Autor: El equipo
5.3 Se prepara el frotis, para ello se fija al portaobjeto mediante un calentamiento
suave sobre el mechero y a la vez triturando con el asa de siembra, con el fin de
reducir el tamaño de la muestra haciéndolas más pequeñas.

Fig. 4
Preparación del frotis mediante el proceso de fijación y trituración .

Autor: El equipo

5.4 Una vez fijada, cubrimos todo el frotis con cristal violeta durante 1 minuto Luego,
lo lavamos con mucho cuidado hasta eliminar exceso de colorante.

Fig. 5
Cubrimiento del frotis con el cristal violeta

Autor: El equipo
5.5 Ahora se traza con Lugol por 1 minuto, con el fin de que aumente la afinidad del
colorante por la bacteria, luego se lava hasta retirar los rastros de Lugol.

Fig. 6
Agregado de Lugol y lavado con agua destilada.

Autor: El equipo

5.6 Ahora se coloca gota a gota de alcohol-acetona, hasta que deje de perder color
(aprox. 4-5 gotas), luego lavar con abundante agua.

Fig. 7
Agregado de alcohol-acetona y lavado con agua destilada .
Autor: El equipo

5.7 Finalmente, se cubre con un colorante de contraste como la safranina durante 1

minuto, luego se quita el exceso de colorante con agua destilada y se deja secar al
ambiente.

Fig. 8
Agregado de la safranina y lavado con agua destilada..

Autor: El equipo

OBSERVACIÓN:
La coloración final que adquirió esta bacteria fue de color violeta.

NOTA: De la misma manera que se trabajó con la primera muestra, se aplicará el

mismo procedimiento con la otra muestra de bacteria, que a comparación con la
primera que era color fucsia, ahora se trabajará con la de color amarillo casi
incoloro, siguiendo la misma secuencia de pasos y estrategias que se realizó para la
primera.
Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11
Cubrimiento del frotis Lavado para retirar el Agregado del Lugol y
con el cristal violeta exceso de colorante lavado con agua destilada

Autor: El equipo Autor: El equipo Autor: El equipo

Fig. 12 Fig. 13 Fig. 14

Agregando alcohol- Agregado de la safranina Resultado del segundo
acetona y lavado con y lavado con agua proceso con el tipo de
destilada. destilada bacteria N° 2
 VI. RESULTADOS

Mediante la tinción de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram

negativas gracias al color que tornan después de ser teñidas. las Gram
positivas se tiñen de color violeta mientras que las Gram negativas se tiñen
de color rosa o rojo.
En nuestro caso nuestra primera muestra se tiñe de color violeta de la cual
eso quiere decir que es una GRAM + y la segunda muestra se tiñe de color
rojo de la cual quiere decir que es una GRAM -.

GRAM + GRAM -
 VII. DISCUSIÓN

En esta experiencia pudimos observar que con la de tinción de gram facilita la

diferencia de una bacteria gram positiva y gram negativa realizando cada unos de
los pasos fundamentales que nos facilitan tener un buen resultado teniendo en
cuenta que para que se de este tipo de tinción la pared bacteriana de
peptidoglucano de las bacterias juega un papel importante ya que esta nos permite
diferenciar el tipo de bacteria al momento de teñir la célula utilizadas en el
laboratorio ya que en el momento de teñir su estructura gruesa y delgada de la
pared permite que la célula quede incolora o con color.
Comparando con otros autores:
(Linder 1995) nos dice que los microorganismos del género Salmonella son bacilos,
Gram negativos, anaerobios facultativos, pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae.
(Popoff 1992) también nos confirma que Salmonella pertenece a la familia
Enterobacteriaceae. Los miembros de esta familia, son bacilos Gram negativos de 2
a 3 x 0.4 a 0.6 micras de tamaño.
 VIII. RECOMENDACIONES

● Después de colocar los colorantes se debe dejar actuar por 1 min y lavar
después del minuto el exceso de colorante con agua hasta incoloro.
● Luego del último reactivo que es la safranina y lavar el exceso dejamos que
las muestras sequen para luego poder observar en el microscopio.
● Podemos reconocer mediante el microscopio la forma, estructura de las
bacterias que se encuentran.
● Colocar en una hoja en blanco para diferenciar el tipo de bacteria. Si tienen
una coloración violeta se tratará de bacterias grampositivas, por el contrario,
si son de color rojo o rosadas de tratará de las bacterias gramnegativas.
 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Cerra, H. et al (2013). Manual de Microbiología Aplicada a las Industrias

Farmacéutica, Cosmética y de Productos Médicos. Buenos Aires. Argentina.
Morales, M. et al (2012). Manual de Microbiología. Departamento de ciencias
básicas académicas de Biología
Cuervo, A. (2010). Manual de Protocolos de Microbiología General. Universidad
de San Buenaventuraseleccional Cali.
Fernández. E; Santacruz. I. 2012.Manual de prácticas de laboratorio de
microbiología general – Universidad Autónoma Metropolitana
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD Manual de Bioseguridad en el
Laboratorio Ginebra, OMS. 1983
X. ANEXO
 XI. CUESTIONARIO

1. Explique el mecanismo químico de la tinción de Gram, refiriendo la

reacción entre los reactivos y los componentes de la pared celular.

1° El primer reactivo que se utiliza es el cristal violeta que se le denomina reactivo

primario, este reactivo se deja actuar por 1 minuto, este colorante se adhiere a la
pared celular bacteriana, ya que tiene afinidad por el peptidoglucano de la pared
bacteriana Y TIÑE TODAS LAS CÉLULAS. Las bacterias grampositivas absorben
este colorante porque tienen un mayor porcentaje de ácido teicoico en su estructura.
Por lo tanto, este colorante primario permite la identificación de bacterias cuya
estructura y composición de pared celular se encuentre en mayor proporción y
distribución de ácido teicoico.

2° Antes de añadir el segundo reactivo, se lava el exceso del primer reactivo hasta
incoloro. El segundo reactivo es el Lugol que actúa como MORDIENTE para
reforzar la unión entre el colorante y el sustrato formando un complejo violeta
ribonucleato de magnesio yodo, este complejo también llamado complejo cristal
violeta yodo satura los espacios del peptidoglucano de la pared bacteriana e
IMPIDE LA SALIDA DEL CRISTAL VIOLETA.

3° Se lava el exceso de Lugol con agua, y el siguiente paso es la decoloración que

es el punto crítico en la técnica de Gram, porque es aquí donde se diferencian las
bacterias grampositivas de las gramnegativas y para ello usaremos el alcohol
acetona hasta que escurra incoloro y se lava el exceso inmediatamente. El alcohol
acetona deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también
destruye la membrana externa de las bacterias gramnegativas debido a que esta es
soluble a la acción de solventes orgánicos, como lo es la mezcla alcohol – acetona,
las bacterias grampositivas al contener una gran cantidad de péptidoglicano retienen
con mayor fuerza este complejo, mientras que las gramnegativas no lo pueden
retener por poseer menos cantidad de peptidoglucano.

ESTO QUIERE DECIR QUE AL DECOLORAR SE ARRASTRA EL CRISTAL

VIOLETA DE LAS CÉLULAS GRAMNEGATIVAS Y QUEDAN INCOLORAS,
MIENTRAS QUE EN LAS GRAMPOSITIVAS LA PARED SE DESHIDRATA
IMPIDIENDO LA SALIDA DEL CRISTAL VIOLETA YODO Y ESTAS CÉLULAS
PERMANECEN TEÑIDAS DE COLOR MORADO.

4° Una vez lavado la acetona, se agrega el último reactivo que es la safranina, se le

llama el colorante de contraste y es el último reactivo, se deja actuar por 1 minuto,
este reactivo tiñe las bacterias que no lograron retener el complejo cristal violeta,
debido a su baja composición de ácido teicoico y alta composición lipídica en la
pared, que en este caso son las gramnegativas, que al reaccionar con la safranina,
que es un colorante rojizo, las bacterias gramnegativas absorben este colorante y se
tornan de un color rosado o rojizo. Es decir que este colorante de contraste nos
ayuda a identificar las bacterias grampositivas y gramnegativas y visualizar mejor la
diferenciación bacteriana.

2. Investigue a qué se debe la afinidad de los colorantes básicos por las

bacterias, y a qué la de los ácidos.

Colorantes básicos: la acción colorante está a cargo del catión, mientras que el
anión no tiene esa propiedad. Un ejemplo es el azul de metileno (cloruro de
metiltionina). El grupo amino (básico) es el grupo funcional activo en la molécula.

Colorantes ácidos: la sustancia colorante está a cargo del anión, mientras que el
catión no tiene esa propiedad. Un ejemplo es la Eosina o Eosinato de sodio. El
grupo carboxilo (ácido) es el grupo funcional activo en la molécula.

Al momento de la coloración, ocurre una combinación de procesos físicos y

reacciones químicas: la solubilidad y las interacciones moleculares son claves para
explicar el fenómeno de tinción.

• Procesos Físicos: Al contacto con el colorante ocurre un fenómeno de absorción,

similar al que tiene lugar en las materias porosas, dicho compuesto penetra al
interior del sustrato aprovechando los espacios intersticiales y la cohesión
molecular, sin que ocurra enlace químico. Es un proceso que se explica similar a la
solubilidad de una sustancia en otra

• Reacción Química: Las células microbianas contienen compuestos entre los cuales
se encuentran los ácidos nucleicos. Debido a la presencia de los grupos fosfato en
dichos ácidos, se concentran en las moléculas cargas negativas, las cuales facilitan
combinaciones con los colorantes de tipo básico catiónicos. De otra parte, los
colorantes ácidos, aniónicos, no tiñen la célula y por esto, se emplean como
colorantes de contraste, como, por ejemplo: el azul de metileno o la eosina que no
colorean al microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico.

3. ¿Por qué los colorantes negativos no penetran a la bacteria?

MECANISMO DE ACCIÓN DEL COLORANTE En la tinción negativa se utilizan

tintes ácidos, Los tintes ácidos poseen un cromógeno negativo que no penetra la
célula de la bacteria debido a la carga negativa en la pared celular. Por esta razón la
tinción lucirá como una noche estrellada. La bacteria se verá transparente y el fondo
de la laminilla del color del tinte, que, en este caso, es negro. El colorante no tiñe los
microorganismos, se queda alrededor de ellos, Se usa tinta china (suspensión de
partículas de carbón coloidal) o nigrosina (colorante negro insoluble en agua) para
encontrar presencia de cápsulas alrededor de las células microbianas y micóticas,
ya que este elemento no se tiñe con bases.