Microscopia de Fluorescencia:
La microscopia de fluorescencia hace uso de un microscopio óptico convencional al que se
le añade un adaptador de fluorescencia, este adaptador permite realizar la observación de
la muestra con contraste con fluorescencia.
Los microscopios con este adaptador pueden, usar una intensidad de luz mayor que los
microscopios ópticos convencionales, los cuales usan luz visible la cual está entre 400-700
nanómetros 1. Esta intensidad de luz mayor, excita las especies marcadas con
fluorescencia en la muestra, las especies que se encuentran marcadas emiten una luz de
menor energía con una longitud de onda mayor que genera que permite ver la imagen
magnificada.
Imagen 1: Explica de forma básica como
funciona el microscopio de fluorescencia. La
luz blanca emitida por la fuente de luz es
filtrada dejando pasar, en este caso, solo la
luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de
cierta longitud de onda, pero deja pasar
otras. Filtra la luz azul que excita al
fluorocromo (fluoresceína) pero, por el
contrario, deja pasar la luz verde emitida.
Tomada de:
[Link]
El adaptador se inserta sobre el sistema óptico, y este trabaja por reflexión lumínica.
La microscopia de fluorescencia requiere que la muestra de interés sea marcada con una
sustancia fluorescente llamada fluoroforo (es un marcador colorante fluorescente que es
empleado en investigación, y se encarga de crear contrastes en zonas determinadas de los
especímenes 2). Existen diversos tipos de fluoroforo, como 3:
Moléculas orgánicas
Puntos cuánticos (son nano cristales 2-50 nanómetros)
Proteicos
Extraído de:
[Link]
El proceso por el que pasan las muestras para emitir fluorescencia, se muestra en este
diagrama de Zablonski:
Tomado de: [Link]
2017/BioCel/[Link]
1. Al absorber luz las moléculas del fluorocromo se elevan a un estado de excitación
con un mayor contenido de energía, en el diagrama se representa como S1.
2. Este estado de excitación se mantiene durante un tiempo determinado, durante
ese tiempo la molécula sufre cambios conformacionales e interacciona con su
entorno, debido a esto, la energía que había en el estado S1 se disipa, y se pasa a
un estado de menor energía, S1’.
3. Luego del tiempo de excitación la molécula continúa emitiendo luz de menor
energía y eventualmente vuelve a su estado inicial, S0.
Una de las ventajas que ofrece el uso de la microscopia de fluorescencia es que la
molécula fluorescente, incluso siendo muy pequeña aun puede ser observada, gracias a la
luz que emite, la cual es de un cierto color.
Las desventajas que posee la microscopia de fluorescencia son 4:
Los fluoroforos pueden perder su capacidad de fluorescencia, como resultado del proceso
de fotoblanqueo (este proceso hace referencia a la destrucción fotoquímica de un
fluoroforo, este proceso se da porque los electrones sufren daños químicos debido a la
excitación que toman durante la fluorescencia), las células vivas son propensas a sufrir de
fototoxicidad (esto se da cuando las células reaccionan de forma negativa a la luz, en este
caso se da principalmente con luz de longitud de onda corta, como luz violeta).
Referencias:
1: Brajovic, F. (2021, 13 enero). Así funciona un microscopio de fluorescencia. Cromtek.
[Link]
2: Narvaez Armas, D. J. (s. f.-a). Microscopía. LA MICROSCOPÍA: HERRAMIENTA PARA
ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS. Recuperado 2 de septiembre de 2022, de
[Link]
3: Monteleone, M. (2017). Fluorescencia.
[Link]
BioCel/[Link]
4: Chakraborty, S. (2022, 26 julio). Fluorescence Microscopy: 5 Important Facts You Should
Know. Lambda Geeks. [Link]
