Técnicas Separativas

ELECTROFORESIS
Las electroforesis es una técnica de separación que se basa en migración diferencial (en
sentido y velocidad) de partículas cargadas (analitos) en un campo eléctrico establecido al
efecto, es decir en un gradiente de potencial. Estas partículas cargadas pueden ser muy
variadas: iones simples, complejos, macromoléculas, coloides, o materia corpuscular, bien
células vivas como bacterias o hematíes, o materia inerte como arcillas.

A pesar de que la más utilizada de las técnicas electroforéticas tiene algunas semejanzas
con la cromatografía plana, la electroforesis no puede considerarse como una alternativa
cromatográfica. No obstante, muchos libros de textos y monografías sobre esta temática,
incluyen capítulos dedicados a las separaciones electroforéticas, llamadas indebidamente
por algunos autores "electro cromatografía". También ha recibido otros nombres como
ionografía, electro migración, aunque son menos usados.

El principal campo de aplicación de la electroforesis es la separación (e

identificación y, en su caso, cuantificación) de macromoléculas biológicas, en especial, las
proteínas. Aunque puede ser utilizado para diferentes tipos de partículas cargadas que
pueden ser muy variadas: iones simples, complejos, macromoléculas, coloides, o materia
corpuscular, células vivas como bacterias o hematíes, o materia inerte como arcillas.
El químico sueco, Arne Tiselius, investigó por primera vez esta técnica de
separación en los años treinta para estudiar las proteínas séricas logrando separar cuatro
proteínas claves en el suero (albumina, ,  y  globulina). En 1948 fue galardonado con
el Premio Nobel de Química por estos trabajos.

Un sistema electroforético consta de tres partes:

(a) Una fase líquida, generalmente constituida por un líquido que contiene
electrolitos que facilitan su conductividad eléctrica; en la misma se insertan las especies a
separar. En algunos casos se introducen sustancias (por ejemplo, geles), que retrasan el
movimiento iónico y que pueden estar en reposo o en movimiento.

(b) Una fase sólida (soporte) que se encuentra en contacto (embebida) con la fase
líquida. Puede ser un papel, una membrana, un material pulverizado, un gel, etc. Esta fase
no existe en la modalidad conocida como electroforesis libre.

(c) Una fase gaseosa (atmósfera de la cámara donde se realiza la separación) en

equilibrio con la fase líquida. En algunas alternativas no existe esta cámara (ej.
electroforesis capilar).

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Antes de iniciarse la separación, es decir, antes de la adición de la muestra, el sistema

electroforético debe encontrarse en equilibrio termodinámico, lo que implica que

1. La temperatura sea uniforme,

2. Los potenciales químicos y eléctrico sean los mismos en todo el sistema, y
3. las fuerzas mecánicas estén equilibradas.

Cuando los analitos cargados son introducidos en el sistema, se rompe este equilibrio:
además del transporte debido a la atracción electrostática, se producen otros fenómenos
dinámicos, como el transporte por difusión al alterarse el potencial químico. El resultado
final es un desplazamiento diferencial, según carga, y a diferente velocidad, según las
características de las especies cargadas, que provoca la separación, objetivo primordial de
la electroforesis.

Modalidades
Existen dos formas básicas de electroforesis que se distinguen por la presencia o no
de un medio estabilizante en la zona donde se mueven las partículas cargadas:
 Electroforesis libre: es aquella en que el medio de migración es totalmente líquido,
de elevada viscosidad a fin de prevenir, en lo posible, los fenómenos de difusión.
Tiene un campo de aplicación limitada por las dificultades de mantener una
separación nítida entre los componentes de la muestra (ej. Electroforesis capilar).
 Electroforesis sobre soporte: la migración de las especies cargadas se puede realizar
a través de un medio estabilizante que está impregnado de la disolución electrolítica
que contiene a la muestra. Este medio estabilizante puede estar en forma plana
(papel de filtro, una membrana, capa fina), o bien una columna conteniendo
material pulverizado poco compacto o gel homogéneo o con gradiente de porosidad,
soporte sólido, etc.) que dificultan el movimiento iónico libre. Dependiendo del
soporte que se utilice se pueden separar hasta 25 fracciones proteicas de suero
humano; en el caso de emplearse acetato de celulosa, se obtienen 5 fracciones:
albuminas, 1--globulina, 2globulina, globulina y globulina.

Fenómenos de transporte de disolución.

En el sistema electroforético pueden originarse diversos fenómenos que se traducen en un

transporte de materia: difusión, migración, convección y flujo calorífico que afectan de
manera decisiva a la separación electroforética.

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La Migración se define por migración al movimiento de las especies producida por una
fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.
Algunos autores la denominan electrodifusón. Cuando se impone un potencial eléctrico a
través de una disolución, el movimiento de una especie cargada vendrá definido por la
denominada movilidad iónica, , que es un factor de proporcionalidad entre la velocidad de
desplazamiento, v, y el campo eléctrico aplicado (el campo eléctrico es una función del
gradiente de voltaje aplicado entre los electrodos).

Fundamentos teóricos
Si se considera una partícula cargada de geometría esférica sometida a la acción de
un campo eléctrico, se puede establecer el valor de la resistencia a desplazarse en un medio,
siguiendo la ley de Stokes que postula que: “toda partícula que se mueve a través de un
medio de viscosidad  con velocidad, v, relativamente pequeña, experimenta una fuerza
contraria al movimiento, o fuerza de resistencia, debida a la viscosidad del fluido.”. Luego
la fuerza resistiva es:

Fr = 6  r v Ec 1
Donde
viscosidad del medio
r: radio de la partícula
v: velocidad con que se mueve la partícula

La fuerza impulsora o fuerza con que es atraída la partícula cargado bajo la acción del
campo eléctrico es :
Fe = H.q Ec 2
Donde
H: intensidad de campo eléctrico
q: carga de la partícula

Cuando se igualan ambas fuerzas, la partícula adquiere movimiento uniforme

Fr = Fe Ec 3

6 r v = q.H Ec 4
De aquí podemos despejar la velocidad de migración, v, con que se mueve la partícula
hacia el ánodo o cátodo durante la electroforesis, la cual depende de la molécula y del
campo eléctrico aplicado.

v = H.q / 6 r Ec 5

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y definir la movilidad como la velocidad de migración por unidad de campo eléctrico:

v q
μ=  Ec 6
H 6πrη
A partir de esta ecuación es evidente que la movilidad es mayor al aumentar la carga
y al disminuir el radio iónico. La relación con la viscosidad de la disolución es también
inversa.
Cuando se impone el potencial eléctrico a través de una disolución, el movimiento de
una especie cargada vendrá definido por la denominada movilidad iónica, , que es un
factor de proporcionalidad entre la velocidad de desplazamiento, v, y el campo eléctrico
aplicado (el campo eléctrico es una función del gradiente de voltaje aplicado entre los
electrodos).

La movilidad, µ (cm2 V-1 s-1) es pues la relación entre la velocidad del ión, v (cm.s-1), y la
intensidad del campo eléctrico o el gradiente de voltaje E/L impuesto (E=voltaje o
diferencia de potencial; L=longitud del soporte - cm).

Ec 7
Como el ión avanza una distancia d en un tiempo t, sustituyendo la velocidad v por
su equivalente d/t, se obtiene una expresión que relaciona el tramo recorrido, d, por el
analito con la movilidad (µ) , el potencial aplicado (E), longitud de soporte electroforético
(l) y tiempo (t):

Ec 8

Ec 9

La separación de dos partículas será posible solo en aquellos casos en que las movilidades
que presenten dichas partículas sean suficientemente distintas.
Así pues, la separación electroforética está relacionada directamente con:

a. La diferencia en movilidad iónica (carga y radio iónico),

b. El gradiente de potencial y
c. El tiempo que dura la aplicación del potencial.

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ELECTROFORESIS SOBRE SOPORTE

Factores que influyen en la migración electroforética
Existe una serie de factores esenciales que afectan a la velocidad de desplazamiento
de las especies químicas durante la separación electroforética. Pueden distinguirse dos
grupos: factores inherentes a las partículas y factores inherentes al medio.

Factores inherentes a las partículas

a) Carga, signo y radio iónico: de las ecuaciones matemáticas enunciadas se deduce que
cuanto mayor sea la carga de la partícula, mayor será su movilidad; además, su carácter
catiónico o aniónico determinará la dirección de desplazamiento. El radio iónico es también
representa un factor decisivo: a igualdad de cargas, cuanto menor radio posea el ión,
mayor será su movilidad. Estos factores están menos diferenciados en las proteínas, ya que
pueden tener muchas cargas y sus pesos moleculares son muy elevados y diversos. En este
caso se utiliza la relación carga/masa para predecir la movilidad iónica.
b) Anfoterismo: cuando se trabaja con electrolitos débiles que presentan comportamiento
ácido – base, las modificaciones de pH de corrida electroforética, favorecerá o reprimirá la
disociación. En el primer caso, la especie estará como ion y difundirá hacia el electrodo con
signo de carga opuesta. Por el contario, si la disociación se reprime completamente, la
molécula indisociada y carente de carga, no experimentará desplazamiento alguno debido a
la fuerza ejercida por la acción del campo eléctrico.
Basado en esta propiedad es que se determinan en la práctica los puntos
isoeléctricos de los aminoácidos. El punto isoeléctrico, llamado PI, es el valor de pH para el
cual el aminoácido en cuestión carece de carga neta (contiene igual número de cargas
positivas y negativas).

El valor del PI, se determina observando la migración durante la electroforesis en

una serie de soluciones reguladoras de diferentes pH.
En la separación de aminoácidos, el pH es de suma importancia en la separación
electroforética. En el denominado punto isoeléctrico, pH = pKa, el aminoácido está como
"zwitterion", sin carga neta, por lo que carece de movilidad iónica. Cuando el pH < pK1,
existe como catión y se desplazará hacia el electrodo negativo o cátodo. A pH > pK2,
existirá como anión y se desplazará hacia el electrodo positivo o ánodo.

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Figura 1: Anfoterismo

La influencia tan marcada del pH permite la separación electroforética de una mezcla

compleja de aminoácidos. Por ejemplo, si se considera la separación de dos de ellos: el
ácido glutámico e histidina. Los puntos PI respectivos son muy distintos (7,7 y 3,3). Una
corrida electroforética llevada a cabo empleando un buffer de corrida de pH 3,4 la histidina
estará completamente protonada y se desplazará hacia el cátodo; el ácido glutámico a ese
valor de pH próximo a su PI, se encontrará parcialmente disociado y por ello, se moverá
sólo lentamente en dirección opuesta hacia el ánodo. Si ahora la electroforesis se realizara a
pH 7,2, próximo al PI de la histidina, ésta se mueverá muy lentamente hacia el cátodo,
mientras que el ácido glutámico se encontrará en forma totalmente aniónica y se dirigirá a
mayor velocidad hacia el ánodo.

Factores inherentes al medio

a) Voltaje y tiempo: a > E y a > t, la partícula recorre una distancia mayor,

Se puede trabajar con bajo voltaje (0 -500V) o a voltaje elevado (500 – 1500 V). El primer
modo de operación es el más usado y presenta escasas complicaciones. Si bien a alto
voltaje se producen separaciones más rápidas, el calor generado por efecto joule puede
llegar a dañar el soporte.

b) Fuerza ionica ( µi):

q 1
μ Ec 10
6 π r η 1  rA  i

Teniendo en cuenta la Ec. 10 se infiere que en la corrida electroforética la fuerza
iónica (µi) debe ser mantenida lo más baja posible. Sin embargo, puede suceder que los
frentes electroforéticos obtenidos en esta condición resulten pocos nítidos. Por otro lado, un
aumento de este parámetro experimental aumentará la conductividad del medio migrante;
como consecuencia de esto, se elevara la intensidad de corriente y por efecto Joule

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producirá un aumento de temperatura del medio, pudiendo deteriorar el soporte por

quemado y/o desnaturalizar las proteínas.
Por lo antedicho, este parámetro debe ser controlado a los fines de obtener
separaciones eficientes sin producir daños en la muestra.

c) Flujo electroendosmótico: como consecuencia de fenómenos superficiales de contacto, el

soporte en contacto con el buffer de corrida, adquiere carga eléctrica. Generalmente se
carga negativamente, pero puede cargarse positivamente o no hacerlo, lo cual depende del
tipo de soporte, de los iones y de la fuerza iónica. Como el soporte es una estructura rígida
que no puede migrar, pero si puede hacerlo la solución del buffer de corrida en la que se
encuentra embebido el soporte, generando una circulación de la solución hacia el cátodo,
denominado Flujo Electroendosmótico (Fo, FEO o sus siglas en inglés EOF). La
magnitud del Fo depende del potencial aplicado (a > E, > Fo), del buffer empleado en la
corrida y del soporte. Es decir, si aplicamos una diferencia de potencial a los extremos del
soporte, existe un flujo de liquido hacia el electrodo de carga opuesta a la solución, el que
denominamos Flujo electroendosmótico (Fo).

Figura 2: Flujo electroendosmótico

d) Temperatura. Flujo Hidrodinámico: el pasaje de corriente eléctrica a través de un

electrolito por efecto Joule genera calor. Como consecuencia se produce evaporación del
solvente en el medio migrante, resultando máxima en el centro y mínima en los extremos
del soporte. Esta evaporación produce un gradiente de concentración que provoca la
succión, por parte del soporte del buffer, desde los compartimentos electródicos hacia el
centro del mismo, este flujo se denomina Flujo Hidrodinámico (Fh) que es máximo en
los extremos y 0 en el centro. Si el Fh es elevado puede producir frentes electroforéticos
difusos.
Se concluye que existen fundamentalmente 3 tipos de fuerzas que actúan sobre las
partículas en un campo electroforético:

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1. Campo eléctrico, H.

2. Flujo electroendosmótico, Fo.

3. Flujo hidrodinámico, Fh.

Una partícula cargada negativamente sembrada en una tira electroforética y

sometida a la acción del campo eléctrico actuarán las siguientes fuerzas:
-Desde el punto de siembra hasta el centro de la tira, el Fh actuará a favor de la movilidad
electroforética (hacia el ánodo) y el Fo en contra.
- Sobrepasado el centro del sopote, la partícula encuentra cada vez mayor resistencia
cuando se aproxima al ánodo (izquierda).

Figura 3: Fuerzas que actúan sobre las partículas móviles en un campo electroforético

e) Desniveles entre las cubas: Si la solución reguladora en los dos compartimentos de la

cuba no se encuentra nivelada, por el principio de los vasos comunicantes, se producirá un
flujo grosero de líquido desde el compartimento de mayor nivel al de menor, lo que
provocará una difusión excesiva en los frentes.
f) Viscosidad del medio: si la viscosidad del medio electroforético aumenta, la movilidad
de la partícula (µ) disminuye, pero con el beneficio de que la difusión resulta mínima.

g) Tortuosidad del camino

En electroforesis sobre soporte, si se considera esta ecuación, los resultados serán

inexactos porque esa distancia (d) no es la que recorre realmente la partícula. Las partículas,

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por ejemplo en soporte de papel, sigue una trayectoria tortuosa, entre los intersticios que dejan las
fibras de celulosa inmóviles, y en consecuencia su recorrido real, (d´), será mayor que el aparente.

Figura 4: Camino recorrido por las partículas

h) Reacciones de Electrodos
Los procesos que ocurren en los electrodos, son relativamente independiente de los
que ocurren en el soporte. Estos procesos son:
En el cátodo se produce la descarga de H2 y la formación de HO-, por lo tanto
existe una alcalinización.
2H2O  2 HO- + H2
En el ánodo se produce la formación de O2 y H+, por lo tanto existe una
acidificación.
2 HO-  2H+ + O2
Como consecuencia de estos fenómenos resulta necesaria la utilización de
soluciones reguladoras para mantener el constante el pH en la cuba durante la totalidad de
la corrida electroforética.
Es conveniente también, el uso de dispositivos laberinticos en los compartimentos
electródicos para que los productos que se forman cerca de los electrodos tarden suficiente
tiempo en llegar al soporte y no pongan en peligro el poder regulador del buffer. Lo que se
intenta es mantener los electrodos generalmente de platino o de carbón, en recipientes con
un volumen amplio de electrolito, en lugar de ponerlos directamente en contacto con la
zona de separación electroforética. En algunos casos se usan membranas semipermeables
para evitar una entrada de estos productos redox en el sistema de separación.
Se puede usar también la solución reguladora varias veces sin riesgo, cambiando la
polaridad de los electrodos entre una corrida y otra, así las reacciones que se producen en
un sentido, luego lo hacen en otro, produciendo de este modo su neutralización.
Se puede usar también la solución reguladora varias veces sin riesgo, cambiando la
polaridad de los electrodos entre una corrida y otra, así las reacciones que se producen en
un sentido, luego lo hacen en otro.

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i) Fenómenos de difusión
La difusión se produce por la existencia de gradientes de concentración que
favorecen el transporte de una especie desde zonas de mayor concentración hacia zonas de
menor concentración. Los fenómenos de difusión se deben evitar siempre que sea posible.
La difusión depende:
 Tamaño de la partícula: a mayor tamaño, menor difusión.
 Tipo de soporte: el soporte aumenta la viscosidad del medio migratorio por lo
tanto, a mayor viscosidad del soporte, menor difusión.
 Temperatura: a mayor temperatura, mayor difusión.
 Concentración de la sustancia separar.
 Tiempo de corrida electroforética: a mayor tiempo, mayor difusión.

Instrumentación
Un instrumento para electroforesis destinado a efectuar la separación y el estudio del
comportamiento de los componentes de mezclas electroforéticamente activas están
constituidos por dos elementos fundamentales:
1.- La fuente de poder que suministra energía eléctrica (diferencia de potencial, voltaje,
V) para el desplazamiento y subsiguiente separación de las distintas fracciones de las
mezclas.
2.- Cubas o celdas electroforéticas de separación, diseñadas en distintas formas y
tamaños, que poseen electrodos (generalmente de platino o de carbón) a los que se les
aplica la diferencia de potencial.
Se han realizado muchas modificaciones a los instrumentos de electroforesis, y las
posibilidades de variación de los distintos tipos de celdas son prácticamente ilimitadas,
celdas sin cámara de vapor y celdas con cámara de vapor. En la Fig. 5 se muestra un
esquema de una cuba electroforética.

Papel

Buffer

Figura 5: Cuba electroforética

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Procedimiento para realizar una electroforesis convencional sobre soporte

1) Selección del medio ó soporte.
2) Colocación del soporte y del buffer en los compartimentos electródicos.
3) Siembra de la muestra.
4) Aplicación de una diferencia de potencial (∆E 220-240 V, i= 1-2 mA por tira).
5) Tiempo de corrida.
6) Revelado: coloración y decoloración con reactivos adecuados, para revelar las
proteínas separadas por electroforesis.
7) Transparentación de la tira: Las bandas de proteínas adsorben el colorante más
intensamente que el soporte, de forma que se puede eluir el exceso de colorante del
soporte mientras que las especies (por ejemplo: proteínas) quedan teñidas con el
colorante.
8) Cuantificación: Se determina densitométricamente, integrando las áreas
correspondientes a cada fracción proteíca y calculando el porcentaje de cada
fracción sobre el total de proteínas.

Aplicaciones
El principal campo de aplicación de la electroforesis es la separación (e
identificación y, en su caso, cuantificación) de macromoléculas biológicas, en especial, las
proteínas, También es aplicado a especies bioquímicas más simples, y en menor extensión,
a especies inorgánicas.
Es una técnica muy utilizada por químicos y bioquímicos, y es importante su uso en
el campo de la salud, análisis de alimentos, controles de contaminantes, análisis de agua e
investigaciones forenses. En química clínica, su uso es muy frecuente (lípidogramas,
proteinogramas).

Proteinograma
Es un examen que determina aproximadamente los tipos de proteína en la parte
líquida (suero) de una muestra de sangre. Las proteínas son moléculas anfóteras: su carga
neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se
hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global
negativa. Como medio de soporte se puede usar acetato de celulosa. La muestra cuyas
proteínas se quieren separar se siembra en el soporte y se aplica una diferencia de potencial
durante un tiempo determinado para la separación. Cada proteína migrará más o menos en
función de su carga que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (-)
o cátodo (+) y su tamaño.

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Figura 6: Proteínograma.

La electroforesis común permite separar las proteínas plasmáticas en seis fracciones:

albúmina, alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gammaglobulinas. Estos grupos de globulinas
involucran dentro de cada uno de ellos una gran cantidad de otras proteínas de migración
electroforética similar.
Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en investigación y en clínica,
tanto humana como animal. Además es una técnica muy empleada para el análisis de
proteínas alimentarias. Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes fluidos
biológicos: sangre, plasma, suero, orina, LCR, líquido sinovial, saliva, lágrimas. Así como
alimentos, especialmente lácteos y cereales.
Distintas patologías (inflamación aguda y crónica, síndrome nefrótico,
gammapatías, hipogammaglobulinemias) modifican el trazado electroforético normal,
encontrándose una asociación diagnóstica en estas modificaciones.

CLASIFICACION DE LAS TECNICAS ELECTROFORÉTICAS

Como se mencionó anteriormente las técnicas electroforéticas las podemos clasificar en:

1) ELECTROFORESIS LIBRE: se caracteriza por estar separados los electrodos

únicamente por una solución.
2) ELECTROFORESIS DE ZONA: Se caracteriza por existencia de un medio
estabilizante que interviene de alguna forma el desplazamiento de la especie iónica al
establecerse el potencial eléctrico. Dentro de esta clasificación podemos encontrar:

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a) Electroforesis zonal con soporte sólido.

El medio estabilizante es un sólido poroso que tiene impregnada la fase líquida electrolítica.
En este caso, además de las consideraciones sobre la electromigración pura alterada por
equilibrios iónicos y difusión, deben considerarse las interacciones ion móvil-soporte, la
más importante de las cuales son:

 fenómenos de adsorción y
 fenómenos de "filtración" o exclusión iónica por el tamaño de las partículas.

El primero es de carácter más general, y el segundo provocado para facilitar ciertas

separaciones.

En este tipo de electroforesis, la fase líquida se impregna a un papel de filtro especia; ya sea
a una membrana de acetato de celulosa o una capa fina de material pulverulento compacto,
o de un gel. Tiene un parecido formal con la cromatografía plana: y además de la forma
convencional existen otras alternativas tales como la electrocromatografía y la
inmunoelectroforesis.

Dentro de la electroforesis zonal con soporte sólido podemos mencionar:

Electroforesis sobre papel. El soporte material es un papel de filtro poroso de calidad

cromatográfica impregnado de la fase líquida electrolítica. Las tiras de papel se colocan
sobre una plancha de vidrio o de plástico, o se mantienen tensas de alguna manera; sus
extremos se sumergen en los dos depósitos que contienen los electrodos y el electrolito.
Existen varias configuraciones pero todos los montajes tienen en común la existencia de la
cámara cerrada termoestatizada o no, para mantener una fase gaseosa de composición
constante, al objeto de obtener resultados reproducibles. Generalmente, la localización del
punto de siembra varía según los objetivos:

 Si los analitos son iones de cargas opuestas (cationes y aniones), se

encuentra en el centro geométrico, y
 Si sólo se separan especies catiónicas o aniónicas, entonces el punto de
aplicación se sitúa próximo al electrodo hacia el que no migran los
electrolitos.

Las ventajas más sustanciales de la electroforesis sobre papel son:

Aparatos simples, baratos y de manejo sencillo.

Amplia variedad comercial de los mismos.

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Facilidad de revelado, al igual que en el cromatografía plana.

Separaciones completas.

Amplio campo de aplicación: en especial hay que destacar su aplicación a

determinación de proteínas, lípidos, y carbohidratos en suero sanguíneo.

El inconveniente más importante de la electroforesis sobre papel es su difícil adaptación a

mediciones cuantitativas debido a la falta de transparencia del soporte, otros inconvenientes
son los que fenómenos parásitos de adsorción, la evaporación de agua y los efectos
electroendosmóticos.

Desventajas del papel como soporte electroforético.

o Si el papel es demasiado fino puede romperse fácilmente, especialmente

cuando está seco; si es demasiado grueso los límites entre las zonas aparecen
distorsionados.
o muchas moléculas biológicas, particularmente proteínas, interactúan con los
grupos hidroxilo de la celulosa del papel, de tal forma que la migración de
las moléculas es impedida. Esto puede producir asimetría en las zonas de las
proteínas individuales. Puesto que diferentes proteínas interactúan de forma
diferente con la celulosa, esto puede alterar la separación característica de
las proteínas componentes de una mezcla.
o La calidad del papel es importante. Debe contener al menos un 96% de alfa
celulosa, puesto que la capacidad de papel para absorber agua y retener su
conductividad eléctrica depende del contenido de ese compuesto.
o Otro problema significativo es el fenómeno conocido como electroósmosis.

El papel puede tomar cargas negativas cuando se lo humedece con agua, probablemente
debido a la presencia de un pequeño número de grupos carboxílicos y sulfonilos en la
matriz de celulosa. Puesto que la celulosa se mantiene fija durante las electroforesis el ion
hidronio resultante de la disociación de los grupos carboxílico se mueven hacia el cátodo
cuando se aplica un campo eléctrico al sistema; dando lugar así al efecto electrosmótico o
electroendosmótico.

Electroforesis sobre tiras de acetato de celulosa: Tiene todas las ventajas del empleo de
papel como soporte material y, además, reducen considerablemente los inconvenientes
antes mencionados. Su uso es muy amplio en química clínica. Puede ser utilizada
exitosamente con pequeñas cantidades de muestra (en el rango de microlitro), con tiempos
de separación cortos (generalmente menos de 1 hora).
La eliminación de los dos principales grupos cargados de la celulosa, ácidos carboxílicos y
sulfónicos, se hace por acetilación del grupo -COOH y por esterificación del grupo -SO3H,
usando trifloruro de boro en metanol (este último tratamiento sólo es necesario para
separaciones especialmente difíciles). De esta manera se reduce drásticamente el efecto

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electroendoosmótico producido por las cargas residuales en estructura de soporte sólido.

Otra ventaja importante es el aumento de la porosidad así como su uniformidad, lo que
provoca una mejor resolución (bandas más estrechas) y una disminución del tiempo de
migración. El revelado permite una cuantificación fácil debido a que las membranas quedan
transparentes después del teñido. Esta cuantificación se realiza frecuentemente con un
fotodensitómetro el cual proporciona, después del tratamiento adecuado de las señales, la
integración automática de las áreas de cada pico y ofrece un porcentaje asignable a cada
analito.
Las membranas de acetato de celulosa pura tienen ciertas dificultades mecánicas. Son
delicadas de manipular, se vuelven quebradizas cuando se secan y flácidas cuando se
humedecen, por ello, han sido sustituidas por unas tiras de material plástico duro y
transparente que tienen el polvo de acetato de celulosa compactado y uniformemente
distribuido en una de sus caras. El revelado, así como su inclusión en el fotodensitómetro,
es más cómodo de esta forma.

Electrocromatografía: Se utiliza un soporte que es activo cromatográficamente. Se

producen, de forma secuencial o simultánea, fenómenos electroforéticos y cromatográficos,
lográndose en algunos casos separaciones interesantes. Generalmente el soporte es un papel
o una capa fina. En la modalidad discontinua se utiliza una doble separación secuencial
cromatográfica en un sentido de la zona plana y posteriormente se aplica un campo
eléctrico perpendicular al desarrollo cromatográfico, o viceversa. Generalmente se usan
capas finas soportadas, de celulosa o gel de sílice como soportes.

Inmunoelectroforesis: La inmunoelectroforesis es una metodología que tiene lugar en dos

etapas en las que los antígenos (proteínas o cualquier sustancia con capacidad
inmunogénica) son caracterizadas mediante el uso de dos propiedades:

 migración electroforética
 reacción inmunológica

Las proteínas se separan mediante electroforesis zonal y después se dejan difundir en el

medio estabilizante en el que se ha introducido una banda (línea) de anticuerpos, formando
líneas características de precipitación antígeno-anticuerpo. La distancia de siembra entre la
zona electroforética y la de anticuerpos es crítica ya que depende de que toda relación
antígeno/anticuerpo sea la óptima. Aunque se ha llevado a cabo en diversos medios
estabilizantes, las capas finas de agar-agar o de agarosa de bajo flujo electroendosmótico
son las más usadas. Generalmente se preparan extendiendo una capa de gel diluido en agua
en un soporte de vidrio (portaobjetos), dejándose secar posteriormente en una estufa de
temperatura controlada; se obtienen así una capa de 1-2 mm de espesor.

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b) Electroforesis zonal en Gel

La distinción hecha en los tipos de medios estabilizantes es algo sutil ya que un gel puede
considerarse un sólido. No obstante, se ha mantenido la distinción teniendo en cuenta que
este tipo de "sólido" está disperso en la fase líquida con un diámetro de partícula
notablemente inferior al de un sólido como el papel, polvo de celulosa, membranas,
etcétera.

Los geles empleados son muy diversos: agar-agar, almidón, poliacrilamida, etc. En cada
caso y para cada tipo de aplicación se requiere una preparación específica para lograr la
densidad adecuada, lo que origina una porosidad controlada. Un aspecto clave de la
electroforesis en gel es el efecto tamiz que ejerce el gel. En su seno existen poros de
tamaño controlable, de tal manera que sean del mismo orden de magnitud que el diámetro
de los analitos a separar. En el seno de un gel, los iones de menor tamaño están sometidos a
la electromigración sin impedimentos, aunque ésta no es totalmente libre. Cuanto mayor es
el tamaño iónico y cuanto más asimétricos sean los iones, mayor dificultad tendrán en su
desplazamiento, sufriendo un retraso directamente relacionado con su tamaño. Incluso
puede darse el fenómeno de filtración: los iones más voluminosos no avanzan al ser su
diámetro superior al del poro. Se combina así la separación electroforética con el efecto
tamiz, incrementándose notablemente el poder de resolución, en especial con las proteínas
que son de tamaños muy diferentes, así como de cargas asimétricamente distribuidas.

Los geles de poliacrilamida son los más usados porque ofrecen ventajas importantes tales
como posibilidad de controlar con precisión la porosidad del medio y su transparencia y
claridad, que los hacen muy aptos para la identificación y cuantificación.

Geles de poliacrilamida: Los geles de poliacrilamida son preparados polimerizando la

acrilamida en presencia de cantidades variables N,N´-metilenebisacrilamina, quien actúa
como agente de entrecruzamiento. La reacción requiere un iniciador y un catalizador. Los
iniciadores más comúnmente utilizados son persulfato de amonio o de potasio. El
catalizador más comúnmente utilizado es la N,N,N´N´- tetrametiletilendiamina. La reacción
tiene lugar vía polimerización vinílica iniciada por radicales libres, y produce un gel de
estructura espiralada. En las fabricación de geles de poliacrilamida, la relación entre el
agente entrecruzante y acrilamida es un factor crítico ya que esa relación determina el
tamaño de poro del gel e influye sobre sus propiedades mecánicas.

Los geles de poliacrilamida pueden ser fabricados como columnas o láminas. En el primer
caso, el gel es polimerizado en un tubo cilíndrico de vidrio o plástico de 5 mm de diámetro
interno y con una longitud de 70-100 mm. Para la separación de componentes que poseen
movilidades similares, pueden utilizarse tubos más largos, pero la separación lleva varias
horas, lo cual permite que se produzca una considerable difusión en las zonas separadas.

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Las láminas de gel de poliacrilamida son preparadas en forma similar que los tubos de gel,
pero en este caso la polimerización se realiza colocando los reactivos entre dos láminas de
vidrio separadas entre sí entre 0,5 – 2 cm. Aunque existen otras posibilidades técnicas, la
situación más frecuente es la formación del gel dentro de tubos de vidrio de dimensiones
reducidas. Cada uno de ellos sirve sólo para una única separación electroforética.
Aplicando el campo eléctrico entre los extremos del tubo una vez introducida la muestra,
los componentes de la misma se separan en forma de discos apilados. Es una alternativa
electroforética con un gran poder de resolución, sólo superada por las técnicas de enfoque.

Figura 7. Reacción de obtención de la poliacrilamida

Geles de agarosa: La agarosa es un polímero lineal de D-galactosa y 3,6-anhidrogalactosa,

la cual contiene alrededor de 0,04% de iones sulfonato. La agarosa se disuelve en agua
hirviente, y cuando se enfría a alrededor de 38 °C forma un gel que se mantiene unido por
uniones puente hidrógeno. La concentración de agarosa determina el tamaño del poro del
gel; cuanto mayor es su concentración menor es el tamaño medio del poro. Los poros son
relativamente más grandes comparados con los de los geles de poliacrilamida, lo cual hace
a la agarosa un soporte adecuado para el análisis de proteínas o ácidos nucleicos, que son
demasiado largos para entrar en los poros de los geles de poliacrilamida. El principal
problema que ha sido encontrado con el uso de la agarosa en electroforesis en gel, es que
usualmente contiene grupos cargados, principalmente grupos sulfónico y carboxílico. Esos
grupos pueden interactuar con los grupos cargados de las macromoléculas ionizadas bajo
estudio, especialmente proteínas, y evitar su migración electroforética.

Electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio: En las moléculas de

proteínas con diferente carga neta, la diferencia en carga puede ser eliminada
complejándolas con el detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS) CH3-(CH2)10-
CH2OSO-3Na+.

En soluciones de pH neutro, en presencia de 1% de dodecil sulfato de sodio y 0,1 M de 2-

mercaptoetanol, la mayoría de las proteínas se disocian en cadenas de polipéptidos

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individuales debido a que el 2-mercaptoetanol destruye las uniones disulfuro. El dodecil

sulfonato se une a las cadenas de polipéptidos a través de interacciones hidrofóbicas. Se
forman complejos proteína-dodecil sulfonato los cuales tienen una conformación helicoidal
ordenadas al azar, los iones sodio sirven como contraiones de esos complejos

Las proteínas tratadas de esta manera tienen todas una relación carga/tamaño idéntica
debido a que la cantidad de dodecil sulfato unido por unidad de masa de proteína es
constante. Cuando se las somete a una separación electroforética sobre geles de
poliacrilamida que contienen dodecil sulfato de sodio, tales complejos polipéptidos-dodecil
sulfato migran con una velocidad que está relacionada solamente a su tamaño. Esta variante
es utilizada para la determinación de pesos moleculares de moléculas por técnicas
electroforéticas.

Electroforesis en gel con gradiente de porosidad: Usando un sistema mezclador

programable automático es posible preparar tubos o placas con geles de densidad
uniformemente variable, de tal forma que se obtenga un gradiente negativo de porosidad.
La electromigración de las proteínas se ve alterada e interrumpida por el tamaño de los
poros. Así, una proteína dada se para en un punto o una zona determinada en la que ya no
puede penetrar por su tamaño superior al de los poros del gel. Se refuerza así la influencia
de tamaño en la separación.

Dentro de las ELECTROFORESIS LIBRE; además de encontrar la electroforesis capilar,

que desarrollaremos en otro apunto; encontramos:

ENFOQUE ISOELÉCTRICO: Se basa en la formación de un gradiente de pH (lineal,

cóncavo, convexo, por etapas) en el medio estabilizante, donde al colocar la mezcla de
sustancias a separar, que necesariamente deben ser anfolitos, estos se mueven hacia el
cátodo o el ánodo hasta llegar a la zona de pH en que se alcanza su punto isoeléctrico. En
este momento se encuentran en forma molecular y, por tanto, no activa
electroforéticamente, por lo que se detienen. En definitiva, la separación de los a analitos se
produce gracias a las diferencias en los puntos isoeléctricos; de ahí su nombre: enfocar la
especie hasta encontrar a la situación isoeléctrica.

ISOTACOFORESIS: Se trata de una alternativa de la electroforesis cuyo interés y

aplicabilidad son cada vez más crecientes. Las ventajas más sustanciales son:

 elevado poder de resolución

 alta frecuencia de muestreo

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 precisión elevada
 gran flexibilidad

En la mayor parte de las aplicaciones analíticas de la isotacoforesis se usa un tubo estrecho

de 0,5 a 1 mm de diámetro interno de un material aislante, por ejemplo teflón, relleno de
disolución electrolítica sin ningún medio de estabilizante. Por ello, puede considerarse
como una modalidad de la electroforesis libre. Así, se emplea para separar sustancias
iónicas de peso molecular no muy elevado. No obstante, también se han descrito variantes
isotacoforéticas empleando diversos medios que estabilizantes (geles en columna o capa
fina), que se aplican a trabajos preparativos, o bien a la determinación analítica de
sustancias de peso molecular elevado (proteínas).

La isotacoforesis sólo es apta para separación de especies iónicas con cargas del mismo
signo (separación de aniones entre sí o separación de cationes entre sí). Este aspecto
diferencia de las otras alternativas electroforéticas, debido a la posibilidad de separación de
cationes y aniones entre sí. En la figura 8 se muestra un esquema básico de un montaje
isotacoforético con fines analíticos. Consta de un tubo estrecho de teflón que tiene en sus
extremos:

Figura 8: Diagrama de una unidad de isotacoforesis.

a.- un bloque de inyección, análogo al usado en cromatografía en columna y que

sirve para insertar una banda estrecha de muestra, y

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b.- un detector continuo que puede ser de naturaleza muy diversa; es frecuente en
empleo de dos detectores en serie.

Dos recipientes de electrolitos (EF y ET) de naturaleza diferente, en los que están
sumergidos los electrodos, completan el sistema; en el caso del electrolito ET, existe una
membrana semipermeable acoplada a la entrada del depósito.

A través del esquema de separación de cuatro analitos (A, B, C, D) por ejemplo aniones
que migran hacia el ánodo, se podrá discutir brevemente el fundamento de separación
isotacoforética. La elección de los dos electrolitos: electrolito frontal, y electrolito
terminal, es la clave para la separación ya que las movilidades iónicas de los diferentes
componentes de la muestra deben tener valores intermedios entre las de ambos electrolitos
es decir: EF> A> B>C>D ET.

Por tanto, el EF y el ET deben tener iones con movilidades iónicas efectivas mayores y
menores, respectivamente, a los de la mezcla problema.

Cuando se establece el campo eléctrico entre los dos electrodos a través del tubo, y al
efectuarse la inyección de la mezcla de las sustancias iónicas a separar, se origina un
movimiento electroforético hacia el electrodo correspondiente (el que tiene el depósito de
EF). La migración se efectúa, según las movilidades iónicas respectivas, viajando los iones
a diferente velocidad. Si las movilidades iónicas son lo suficientemente diferentes entre sí,
los analitos se separan por zonas dentro del tubo, antes de llegar al detector. Se alcanza el
estado estacionario cuando en virtud a su distancia relativa al electrodo, todos los iones
viajan a igual velocidad. En ningún caso se produce la separación entre sí de las zonas, ya
sean puras o con mezcla de analitos, ya que se interrumpiría el paso de corriente. El nombre
de la técnica describe esta situación iso = igual, taco = velocidad. Así si v es la velocidad
lineal de migración y Ea, Eb,... los gradiente de potenciales puntuales (V/L) a lo largo del
tubo en un tiempo t, en estado estacionario se cumple que:

v = va = vb = vc = vd

v = aEaEbcEc = dEd

Según la definición de movilidad iónica indicada anteriormente. Así pues, el gradiente de

potencial es variable y distinto en cada punto del lecho electroforético, lo que distingue a la
isotacoforesis de la mayoría de las técnicas electroforéticas.
La representación de gradiente de potencial en función del tiempo a su paso por el detector
se muestra en la figura 9. Se obtiene una señal escalonada; los tramos horizontales
corresponden a las zonas del analito y los escalones a las zonas de mezcla que deben ser
estrechas. En dicha figura se encuentran también a la representación de la variación de

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gradiente diferencial función del tiempo; se obtiene en picos agudos corresponden a cada
interzona. Cuando se usa un detector conductimétrico pueden obtenerse ambos tipos de
representaciones según como se programe el tratamiento de la señal continua. La ventaja de
este tipo de detector es su respuesta universal estrechamente relacionada con la movilidad
iónica. Si el detector es fotométrico la señal transitoria tiene otro perfil: cada escalón o zona
entre picos origina una meseta cuya altura depende de la concentración y absortividad de
cada analito. Al no tener una respuesta universal es posible que algunos analitos sean
ópticamente transparentes a una determinada longitud de onda, y la meseta correspondiente
no aparezca. El uso conjunto de dos detectores facilita la identificación cuando se trata de
una mezcla compleja.

Las características cualitativas de la isotacoforesis pueden relacionarse con las alturas

relativas de cada escalón cuando se utiliza un detector de respuesta universal. Así, los
valores absolutos hA y hB pueden identificar a los analitos A y B, pero estos valores
dependen fuertemente de las condiciones experimentales y no pueden ser usados para
comparar el comportamiento de los analitos, por ejemplo, en diferentes instrumentos.

Figura 9.
BIBLIOGRAFÍA
 Valcarcel C, Gomez Hens. Técnicas Analíticas de Separación. Ed. Reverté S.A.
1988.
 Maureen Melvin. ELECTROPHORESIS. Analytical Chemistry by Open Learning.
Ed John Wiley & Sons. 1987.

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 D. Skoog, A. Douglas, F. Holler,F. James, Crouch, Principio del Análisis

Instrumental 6ª Ed. Cencage Learning, 2011.

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