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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

GUÍA DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA

Por: Luz Dary Caicedo Bejarano

Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Básicas
Programa de Química
2018
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

De: RIASCOS, M. NAVIA, C.G. Prácticas de laboratorio de química general. Universidad

del Valle, Departamento de Química. 2000.

NORMAS DE SEGURIDAD:

A l llegar al laboratorio, conozca donde se localiza la fuente de agua, la ducha, los

extintores y las salidas de emergencia. Aprenda a usarlos adecuadamente y no dude en
utilizar este equipo si es necesario. Es importante reiterar al iniciar la practica de
laboratorio los seguros de las puertas que son acceso a las salidas de emergencia.

Utilice la ducha de seguridad si su ropa se incendia o si sobre su ropa se derrama gran

cantidad de un reactivo corrosivo. Quítese de inmediato la prenda afectada. El pudor no
cuenta en ese momento, solo cuenta la rapidez con la cual usted enfrente el problema.

2. Antes de entrar al laboratorio además de tener presente las normas de seguridad es

importante que lea muy bien la guía, realice un diagrama de flujo y consulte la
peligrosidad y modo de empleo de los reactivos a utilizar. Sea consciente de los riesgos
que corre al realizar determinados procedimientos en el laboratorio, sea prevenido y
actué con cautela. Destine una libreta para el curso del laboratorio en la cual consignara
toda la información que debe conocer y manejar antes, durante y después de las
practicas de laboratorio.

3. Vístase adecuada y cómodamente el día de laboratorio. Evite ropa inflamable. Use

pantalón largo y preferiblemente de algodón. No lleve anillos ni pulseras durante el
tiempo que dure el laboratorio. Póngase calzado con suela antideslizante, no utilice
sandalias que dejen los dedos destapados. Si su cabello es largo utilice un gancho para
sujetarlo. En todo momento utilice bata de laboratorio completamente abotonada, esta
puede protegerlo de algunas quemaduras y evitar que sus ropas se deterioren por
salpicaduras de reactivos. Mantenga y lave su bata de laboratorio aparte de la ropa que
usa normalmente.

4. Proteja siempre en forma adecuada sus ojos. El riesgo de una lesión grave en los
ojos, obliga a que todos (estudiantes, profesores y visitantes) en el laboratorio lleven
siempre una protección adecuada, desde el inicio hasta el final de la practica. Los ojos
pueden sufrir daños irreversibles por salpicaduras de reactivos o esquirlas de vidrio que
vuelan en un accidente. MANTENGA PUESTAS LAS GAFAS DE SEGURIDAD aun
cuando usted no este realizando algo peligroso; sus vecinos pueden tener un accidente y
afectarlo a usted. Recuerde una pequeña gotica de reactivo concentrado puede
ocasionarle la perdida de la visión.

En caso de que lleguen salpicaduras de reactivos lave inmediatamente con abundante

agua. Si solo un ojo es afectado, proteja el sano durante el lavado. Abra bien los
párpados y mueva el ojo afectado en diferentes sentidos, Avise a su instructor de
inmediato y acuda al médico lo antes posible.
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Nunca use lentes de contacto ya que las sustancias químicas pueden penetrar por
capilaridad debajo de ellos por lo que no será fácil de enjuagarlos.

5. Nunca trabaje solo sin supervisión en el laboratorio. No realice ningún experimento sin
previa autorización.

6. Mantenga su área de trabajo limpia, seca y ordenada. Siga cuidadosamente las

instrucciones para el ensamble de equipo y antes de ponerlo en funcionamiento haga
que su instructor lo revise. Mantenga libros y objetos personales retirados del sitio de
trabajo. Ellos pueden interferir su labor y resultar peligrosos, si usted salpica o riega un
reactivo límpielo rápidamente. Provéase de un pedazo de dulce abrigo para la limpieza
de las mesas de trabajo.

7. Lea los rótulos de los reactivos cuidadosamente. El uso erróneo de sustancias puede
causar serios accidentes. Evite contaminar los reactivos puros. Nunca devuelva el
exceso de reactivo a los frascos tome solo la cantidad que usted va a necesitar.

Rotule correctamente los envases de las soluciones preparadas para las practicas y de
los desechos producidos en las mismas. El rotulo debe contener en el caso de las
soluciones: Nombre, formula, concentración, fecha de preparación y persona
responsable. Y en el caso de los desechos: Nombre practica, fecha, composición,
concentración, persona responsable.

Los procedimientos para la recuperación de desechos o su eliminación previamente

inocuos serán realizados en un trabajo coordinado por su instructor.

8.La mayoría de los productos químicos del laboratorio son tóxicos; algunos más tóxicos
que otros como soluciones concentradas de ácidos y bases fuertes, corrosivos para la
piel. En el manejo de los productos químicos, evite el contacto con la piel, ojos y mucosa
en todos los casos. Si ocurren salpicaduras sobre la piel elimínelas previamente con un
trapo seco y seguidamente lave inmediatamente el área afectada con bastante agua fría;
en el caso de soluciones corrosivas la rapidez con que usted actué es factor importante
para evitar daño en la piel. Debido al peligro de reabsorción, no use nunca solventes
orgánicos en el lavado

9. Evite las chanzas, juegos y manifestaciones de cariño y visitas de sus amigos hasta
que termine la practica de laboratorio. No permita bajo ningún motivo la presencia de
niños en los laboratorios.

10. NUNCA INGIERA COMIDAS O BEBIDAS Y NUNCA FUME EN EL

LABORATORIO. Lave sus manos antes y después de terminada la practica

11. Las lesiones más comunes en un laboratorio de química son las cortaduras y
quemaduras. Descarte el material de vidrio que se ha resentido o quebrado y deposítelo
en el lugar indicado para tal propósito. Pula con fuego las puntas cortantes de tubos y
varillas de vidrio. Nunca intente forzar la entrada de un tubo de vidrio o termómetro por el
agujero de un tapón. Previamente asegúrese de lubricar con glicerina o agua jabonosa,
tubo y agujero. Proteja sus manos con varias capas de toalla o unos guantes resistentes
mientras inserta el vidrio o el material cortante en el tapón. Nunca toque con su piel
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mallas de calentamiento, material de vidrio, aros y materiales de laboratorio que

previamente hayan sido sometidos a calentamiento. Si es necesario hacerlo usted
deberá ser extremadamente cuidadoso de lo contrario podría ocasionarle quemaduras
muy graves.

12. Muchos químicos que usted utiliza son tóxicos y pueden ocasionarle severas
quemaduras en las mucosas si usted los ingiere. Siempre utilice una pera de caucho
para succionar o extraer los líquidos con una pipeta, NUNCA UTILICE LA BOCA NI
PRUEBE UN REACTIVO.

13. Cualquier experimento en el cual se puedan producir humos tóxicos o irritantes,

deberá realizarse dentro de la campana extractora (revisar su funcionamiento antes de
iniciar el procedimiento). Para probar el olor de una sustancia, coloque la boca del
recipiente alejada de su nariz, y con su mano ventilen poco los vapores hacia su nariz.
No inhale profundamente, olfatee suavemente.

14. Nunca agregue agua a un ácido concentrado. Diluya el ácido lentamente adicionando
el ácido al agua con agitación constante. Las bases deberán ser diluidas en forma
análoga. Nunca mezcle los ácidos concentrados con bases concentradas sin tomar las
precauciones del caso. Recuerde que se produce una reacción fuertemente exotérmica.

15. Los mecheros pueden causar serias quemaduras. Enciéndalo solo cuando vaya a
utilizarlo. Previamente percátese que no hayan líquidos inflamables como alcohol,
benceno, éter o acetona. Estos deberán encontrarse a una distancia prudencial. Nunca
use mechero para calentar líquidos inflamables. Use una malla de calentamiento
eléctrico, una plancha o un baño maría.

16. Cuando caliente un liquido en un tubo de ensayo, coloque la boca del tubo lejos de
usted y de sus vecinos, hágalo en forma suave. Nunca caliente un liquido en un
recipiente completamente cerrado.

17. No agregue residuos químicos a las canecas destinadas para desechos domésticos.
No emplee los vertederos para eliminar todo tipo de desechos como papel, pedazos de
vidrio, algodón, etc. Nunca arroje en el vertedero líquidos inflamables o volátiles,
sustancias corrosivas o compuestos que puedan producir vapores tóxicos mucho menos
sustancias sólidas.

18. Al finalizar la practica de laboratorio, devuelva todo el equipo desarmado, limpio y

seco. Revise que las instalaciones hidráulicas y de gas estén cerradas. Equipos,
campanas de extracción y extractores de pared estén apagadas.

PLAN DE EVACUACIÓN

R econocimiento del lugar: Consiste en identificar los pasillos que conducen a las
salidas de emergencia, revisar que los seguros que tengan se puedan retirar fácilmente y
a cual lugar conducen.

2. Trazar la ruta de evacuación desde la primera puerta hasta el lugar donde las
personas no corran riesgos.
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3. Identificar en el grupo los lideres, estos deben ser personas que no sean nerviosas,
requiere personal que actúe con calma pero rápido e inteligentemente. Ellos ayudaran a
calmar al resto de personas, y a conducirlas en orden por la ruta establecida.

4. Informar el plan al grupo de estudiantes y recomendarles:

Caminar rápido pero NO CORRER.

No empujar, ni armar desorden.
No gritar, el pánico lo siembra una sola persona y por lo general es contagioso.
Bajar con cuidado las escaleras de evacuación.
No cargar implementos innecesarios en el momento de la evacuación. Estos
pueden entorpecer el desplazamiento normal.
No devolverse por objetos u otras personas. De las personas que quedan se
encargan los lideres. El devolverse puede ocasionarle lesiones físicas
irreversibles incluso pérdida de la vida.
Personas inexpertas no pueden colaborar, en lugar de ayudar entorpecen la
labor. La mejor ayuda que cada persona puede aportar es evacuar en silencio
rápida y ordenadamente.
En caso de incendios evacuar de la siguiente manera: De ser posible humedecer
un pañuelo o trapo y ponérselo en la nariz. Despejar el lugar arrastrándose por el
piso ya que a esta altura hay una capa de oxígeno(esta cantidad de oxígeno está
entre el piso y el humo).

REGLAMENTO PARA LA EVALUACIÓN DEL LABORATORIO

L a calificación correspondiente al trabajo en el laboratorio es individual. Esta

calificación debe ser emitida al final de cada sesión de laboratorio, el estudiante tiene
derecho a conocerla inmediatamente y a efectuar reclamaciones en caso de no estar de
acuerdo con ella. Para colocar esta nota se debe tener en cuenta los siguientes factores:

El estudiante debe conocer, antes de iniciar el curso, el peso que el instructor le dará a
cada uno de estos factores.

Para emitir la nota de trabajo en laboratorio es indispensable que el instructor

interaccione fuertemente con el estudiante desde la primera sesión de laboratorio. Sin
una fuerte interacción entre el instructor y el estudiante no se podrá emitir una
calificación correcta.

2. El informe de la práctica de laboratorio debe ser entregado por el estudiante a los

siete(7) días calendario siguiente a su realización. Es obligación del instructor de
laboratorio dar a conocer a sus estudiantes la calificación del informe y las
correspondientes correcciones dentro de los ocho (8) días hábiles siguiente a la entrega
por parte del estudiante.

3. Es obligación del instructor de laboratorio hacer conocer a sus estudiantes, antes de

iniciar el curso, el tipo de informe de laboratorio que exigirá y las pautas que seguirá en
su calificación.
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4. El incumplimiento sin causa justificada con las prácticas o no entrega de los trabajos
académicos exigidos(informes de laboratorio en este caso), dentro de las fechas
establecidas, se sanciona con una calificación de cero.

5. La copia de un informe de laboratorio de otro del mismo semestre o semestres

anteriores, es considerada como fraude y se sanciona con una calificación de cero, en
ese informe.

FORMATO DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA

LABORATORIO # ___ TEMA: _______________________ GRUPO No. ____

FACTORES DE NOMBRES DE LOS ESTUDIANTES QUE ASISTIERON A

EVALUACIÓN LA PRÀCTICA

Destreza experimental
1.5 PUNTOS
Respuestas orales en
clase
Orden y aseo
0.5 PUNTOS
Cumplimiento del
horario
0.5 PUNTOS
Diagrama de flujo
1.5 PUNTOS
Iniciativa y creatividad

medidas de seguridad
1.0 PUNTO
Bata de laboratorio

Gafas

Otras observaciones

PAUTAS A SEGUIR EN LA PRESENTACIÓN DE INFORMES DE

LABORATORIO

B uena redacción, ortografía, normas generales en cuanto a unidades, abreviaturas

entre otras.

1. El informe se presentará en hojas de tamaño carta con márgenes según las

normas técnicas de ICONTEC.
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2. El texto se copiará a doble espacio, iniciando los párrafos en el margen

izquierdo; las tablas y/o figuras irán numeradas en forma consecutiva con
número arábicos y llevarán un titulo lo más breve posible. Ej: Figura 1

3. El contenido debe ser claro y conciso con respecto a la explicación y análisis de

los resultados obtenidos.

4. Todo informe debe incluir:

a. INTRODUCCIÓN: Comprende el planteamiento del problema, sin

desarrollar el tema ni dar conclusiones. Debe destacarse bases teóricas
o prácticas del trabajo, objetivos, importancia. (vale 0.5/5)

b. PARTE EXPERIMENTAL: Publicar lo realizado, expresando en sus

propias palabras (Se aclara que no es transcribir el procedimiento que
aparece en las guías de laboratorio), indicando las variaciones a las
guías que se hayan tenido que hacer en el proceso. Los datos deben
presentarse en forma tabular donde sea permitido y tener en cuenta las
unidades SI para las mediciones. (Vale 1.0/5)

c. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Esta es la parte más crítica de su

informe. Recuerde que cada supuesto realizado debe ser explicado.
Deben aparecer las ecuaciones que haya aplicado. Recuerde que los
datos y resultados deben ir acompañados de sus unidades y reportarse
en forma tabular o gráfica donde sea necesario. (Debe escoger la mejor
representación). La discusión debe realizarse de acuerdo a los
resultados obtenidos en la práctica, haciendo un análisis y dando las
posibles fuentes de error. (Vale 2.0/5)

d. CONCLUSIÓN: Será el balance final de las práctica o investigación. Se

presentaran en forma lógica, clara y concisa los resultados de la misma.
Un último punto son las causas de error analizando su efecto sobre los
resultados obtenidos. (Vale 0.5/5)

e. ANEXO: Generalmente los informes tienen preguntas de consulta, aquí

deben aparecer estas respuestas. (Vale 1.0/5)

f. NOTA: Durante todo su informe deben aparecer las llamadas para sus
citas bibliográficas con números arábigos en forma exponencial con lo
que dará los créditos respectivos en la sección de bibliografía, que es la
última parte de su informe, la cual es obligatoria.

g. BIBLIOGRAFÍA: Según las normas de ICONTEC para libros con autor,

libros con editor, publicaciones seriadas y normas técnicas.
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COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA

De: PRIETO, S., AMICH, S., SALVE, M.L. Laboratorio clínico, principios generales. McGraw-
Hill, Interamericana. 1ª. edición. 1997.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

1. INTRODUCCIÓN

1.1.1 Naturaleza de la radiación electromagnética

L a radiación electromagnética es una forma de energía radiante. Tiene propiedades

ondulatorias, propagándose en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se
definen:

Longitud de Onda (): Se define como la distancia entre dos máximos de un ciclo
completo del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, según el Sistema
Internacional de Unidades (SI), en nanómetros (nm, 10-9 m). Se pueden encontrar
otras unidades, ya obsoletas, que serian ángstroms (A) y milimicras(mµ). La relación
entre estas medidas es:

1nm =1mµ = 10 A = 10 –9 m

Frecuencia (): Es el numero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de

onda:

c
 =

Siendo c = velocidad de la luz.

La luz esta formada de fotones, paquetes discontinuos de energía. La energía de un

foto depende de su frecuencia y de su longitud de onda:

h*C
E = h * =

Siendo h = constante de Plank (6,62* 10 –27 erg/seg)

Como se puede observar en la relación anterior, la relación entre la longitud de onda

y la energía de una adición electromagnética es inversa, de manera que cuanto
mayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energía.
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El espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante,

incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta ondas de radio,
de longitud de onda larga.

El espectro electromagnético se divide en regiones que abarcan intervalos de

longitudes de onda más estrechos

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

Rayos Rayos X Ultravioleta Visible Infrarrojo Microondas

Gamma (UV) (IR)
(R8)
Longitud de 0,1 1 180 390 750 400*103
Onda (nm)

Longitud de Onda Nombre de la región Color absorbido Color complementario

180-220 UV corto No visible -------------
220-340 UV No visible ------------
340-430 Visible Violeta Amarillo-verdoso
430-475 Visible Azul Amarillo
475-495 Visible Verde-azul Naranja
495-505 Visible Azul-verde Rojo
505-555 Visible Verde Púrpura
555-575 Visible Verde-amarillo Violeta
575-600 Visible Amarillo Azul
600-620 Visible Naranja Azul-verde
620-700 Visible Rojo Verde-azul

1.1.2 Descomposición del espectro en colores y sus complementarios.

El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y 750 nm

aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra
limitación. y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y
menores (UV).

La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones
de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como “blanca”.

En la región visible, la luz se descompone en colores y sus colores complementarios. Si

hacemos incidir un haz de luz blanca sobre una solución que absorbe luz a una longitud
de onda determinada, esta transmitirá todas las demás longitudes de onda, apareciendo
a la vista del color complementario al que corresponde a la longitud de onda absorbida.

En consecuencia, una luz que se observa de un color determinado al ojo humano,

deberá ser iluminada para las mediciones fotométricas con un haz de luz de longitud de
onda del color que absorbe, es decir, el complementario.

Ejemplo: una solución de color rojo se irradia con una luz de aproximadamente 500 nm.
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1.2 Fenómenos de interacción entre luz y materia

Cuando se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, entre
otros, fenómenos de absorción o emisión energética.

1.2.1 Proceso de absorción. Cuando una película, que se encuentra en “estado de

reposo” o “estado fundamental” interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa
a lo que se denomina “estado excitado”.

En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia

partícula (tipo de enlaces, etc.)y de la energía (longitud de onda) de la luz que
interacciona.

La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado

fundamental, desprendiendo la energía absorbida en forma de calor:

A0 + h *  → A* → A0 + calor

Siendo A0 = absorbente en estado fundamental

A*= absorbente en estado excitado
h*  =energía del fotón absorbido
h= constante de Plank
 = frecuencia de la radiación

1.2.2 Espectro de absorción. Cada especie absorbente(cromógeno) tiene lo que se

llama un espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación entre
la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solución de la especie,
en condiciones definidas de trabajo. Al grafico que resulta de representar en un eje de
coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a excitación de onda (abscisas) es a lo que
llamamos espectro de absorción.

Los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda
más adecuada para una medida cuantitativa (excitación de onda a la que la excitación es
máxima), como para fines de excitación cualitativa.

Proceso de emisión. Algunos compuestos tienen la excitación, tras ser excitados, de

retornar a su estado fundamental, excitación una emisión de energía radiante. La luz
emitida se puede medir, y ello consiste el principio de algunas técnicas, como la
Fotometría de llama, o la Fluorescencia.

A0 + h *  1 → A* → A0 + h *  2

Siendo A0= absorbente en estado fundamental

A*= absorbente en estado excitado
h *  1 = energía de excitación
h *  2 = energía de emisión
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1.3 Espectrofotometría de absorción

La espectrofotometría de absorción consiste en la medida de la radiación que llega a un

detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia
absorbente. En química clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y
las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y
800nm

La expresión “determinación fotométrica” se definió originalmente como la medida de

una intensidad de luz, sin tener en cuenta la longitud de onda; por otro lado, se
denominaron “determinaciones espectrofotométricas” a aquellas que median la
intensidad de la luz en un espectro de longitudes de onda mucho más estrecho.

Hoy día, ya no constituyen una base valida para la distinción entre “fotómetro” y
“espectrofotómetro” la longitud de onda de medida: ambos aparatos se distinguen por el
sistema que poseen para seleccionar la longitud de onda medida; así, se conoce como
“fotómetro o colorímetro” a aquel que emplea filtros, mientras que el “espectrofotómetro”
es aquel que emplea prismas o redes de difracción.

Las determinaciones espectrofotométricas han tenido un gran auge en los últimos años.
Sus principales ventajas son la sensibilidad relativamente elevada, la facilidad con que
permiten realizar determinaciones rápidas, y un grado de especificidad relativamente
alto. Todo esto, unido a su adaptación en los auto analizadores, la hacen técnica
imprescindible hoy por hoy en el laboratorio clínico.

2. LEYES DE ABSORCIÓN

C uando un haz de luz de intensidad lo incide sobre una cubeta cuadrada que
contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se
produce en la solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de
atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is:

Se define como transmitancia la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T= Is/Io

En la practica se define el porcentaje de transmitancia:

% T= Is/Io *100

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar así solo la
absorción del compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una
“solución de referencia” o “blanco”, que contiene todos los posibles compuestos que
participan en la lectura, menos el compuesto a medir.

Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a que esta medida
inicial, y se deben hacer en la misma cubeta que se utilizo para la medida del blanco.
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El valor experimental de la transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la relación entre

la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica y
concentración mientras que la relación entre la absorbancia y la concentración es
directamente proporcional:

A =− log Is / Io = − log %T = log 1 / T

100
=log = log 100 − log T
%T
A = 2 − log %T

De esta relación matemática se deduce que la relación logarítmica entre A y %T se

traduce en dos escalas:

%T → va de 0 a 100.... Si %T = 100 → A = 2 − log 100 = 0

A → va de  a 0.... Si %T = 0 → A = 2 − log 0 = 

En los aparatos que se usan hoy en día, las lecturas de %T son transformadas en
absorbancia y presentadas así al operador, pero conviene no olvidar que la absorbancia
no es en si misma una cantidad medible, sino que se obtiene por cálculo matemático a
partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotométrico.

Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas la relación entre absorbancia y

concentración, observamos una línea recta, y la proporción es directa; la gráfica
resultante de representar %T frente a concentración es una curva, y la proporción es
inversa; si empleamos papel semilogarítmico, la gráfica de %T frente a concentración se
convierte en una recta.

Como hemos dicho, al aumentar la concentración del compuesto absorbente en solución,

más luz es absorbida y menos transmitida, lo que se observa en las gráficas.

La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta
solución absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorción.

La Ley de Beer establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y

otras dos variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el
haz de luz recorre a través de la solución. Según esta ley, la absorbancia de una
solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz:

A=a x b x c

Siendo: A = Absorbancia
a = coeficiente de absorción
b = longitud del paso de luz en centímetros
c= concentración de absorbente

Esta ecuación constituye la base de análisis cuantitativo de las determinaciones

espectrofotométricas.
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Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorción es una

constante, relacionada con la naturaleza química del soluto, y tiene unidades recíprocas
a, b, c.

El coeficiente de absorción a se denomina coeficiente de extinción molar,

representado con el símbolo  cuando las unidades de b son centímetros y las de c son
moles / litro. El coeficiente de extinción molar es constante para un compuesto dado
cuando se fijan condiciones de longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otros
factores. Sus unidades son 1/mol x cm.

En la práctica, el significado del coeficiente de extinción molar es el siguiente: cuanto

mayor sea  en una sustancia(cromóforo) para unas condiciones de trabajo
determinadas, mayor será la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de
trabajo y, por tanto, mayor será la sensibilidad del método que lo emplea. (Para una
misma concentración de cromógeno, si  aumenta, A aumenta.)

La ley de Beer tiene una aplicación práctica: determina los métodos experimentales para
averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución. Basándonos en
la relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración
de una solución problema de dos maneras:

a. Por comparación con una solución conocida:

Si tenemos dos soluciones, P(problema) y S(estándar de concentración conocida),

podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

As Cs Ap
= → Cp = Cs x
Ap Cp As

Siendo:

Cp= concentraciones del problema;

Ap= absorbancia del problema;
Cs= concentración de la solución estándar
As= absorbancia la solución estándar

Conocemos el valor de Cs, y para la serie de análisis determinamos experimentalmente

el valor de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs/As, estableciendo
así el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbencias de
sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las
concentraciones de estas soluciones problema.

Cs
Cp = x Ap = F x Ap siendo : F = Factor
As
b. Curva de calibración:

Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia(ordenadas) frente

a concentración(abscisas).
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El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de

concentraciones conocidas, y determinar absorbancias; a continuación, se construye la
curva de calibración(que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a
sus absorbancias gráficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su
concentración se averigua por interpolación de las absorbancias de las soluciones
problema en la recta de calibración.

Estas dos formas de trabajo sólo son válidas si el cromógeno obedece la ley de Beer, y
tanto las soluciones estándar como los problemas son leídas en idénticas condiciones.

En las determinaciones fotométricas se deben conocer la linearidad que es el intervalo

de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre
concentración y absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la
concentración de cromógeno en la solución sobrepasa los limites de linearidad, la Ley
de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de
ese punto de concentración. La lectura de una absorbancia fuera de los limites de
linearidad, se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta
situación, hay que diluir la muestra, para que su concentración entre dentro de los limites
de linearidad.

3. INSTRUMENTACION

T odos los fotómetros y espectrofotómetros constan esencialmente de:

Fuente estable de energía radiante.

Rendijas de entrada y salida.
Selector de longitud de onda.
Cubeta destinada a contener la muestra.
Detector de energía radiante.
Presentación de datos.

3.1 TIPOS DE APARATOS:

En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos:

Fotómetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromática a longitudes de onda

discretas.

Espectrofotómetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes de

difracción, obteniendo luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de
onda.

Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en

espectrofotómetros de haz simple o de doble haz.

Espectrofotómetros de haz simple:

Constan esquemáticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasa

a través de un monocromador que seleccionará la longitud de onda deseada; unas
rendijas de entrada y salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz
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difusa; la luz pasa a través de la cubeta, donde no se produce el proceso de absorción;

la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energía radiante en
energía eléctrica, que es registrada en un lector.

Al trabajar con estos aparatos, es necesario un ajuste inicial a 0 por100 de transmitancia,

que se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta el
detector. A continuación se hace un blanco, colocando una cubeta con todos los
componentes de la solución de trabajo exceptuando el cromógeno, y haciendo un ajuste
a 100 por 100 de transmitancia (o de absorbancia). Se hacen lecturas de
estándares(soluciones de concentración conocida), y a continuación las de las
soluciones problema(concentración desconocida), y se averigua la concentración de los
problemas por comparación con los estándares.

Espectrofotómetros de doble haz:

Se clasifican tales en el espacio y en el tiempo.

1. Espectrofotómetros de doble haz en el espacio:

Todos los componentes están duplicados menos la lámpara. Dos haces de luz pasan al
mismo tiempo a través de los diversos componentes separados en el espacio. Esta
disposición compensa las variaciones de intensidad de la fuente de energía radiante y
también las variaciones de absorbancia a medida que se varía la longitud de onda de
lectura en una operación de barrido.

2. Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo:

Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos
haces de luz pasan a través de los mismos componentes, pero no en el tiempo. Emplean
un “chopper”, consiste en un interruptor rotativo del haz luminoso(es una rueda giratoria
con secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuación de la rendija de
salida. Un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el chopper a través de
una cubeta de referencia y de ahí al detector común. El detector ve alternativamente el
haz de luz procedente de la muestra y el de referencia. Esta disposición compensa la
variación de la fuente de energía radiante, así como las variaciones de sensibilidad del
detector.

3.2 COMPONENTES

Fuente de energía radiante

La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz

visible o no visible.

Existen distintas lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y UV.

Lámparas de filamento de tungsteno:

Se utiliza habitualmente como fuentes de radiación para longitudes de onda del
espectro visible y UV próximo; son fuente de un espectro continuo de energía
radiante entre 360 y 950 nm.

Lámparas de filamento de haluros de tungsteno:

Son de mayor duración, producen mayor luz a longitudes de onda cortas, y
emiten energía radiante de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno.
Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.
 16

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Lámparas de hidrógeno y deuterio:

Producen un espectro continuo en la región UV(220 a 360 nm). Se emplean para
medidas en esta región del espectro, siendo más usada la de deuterio, de mayor
intensidad que la de hidrógeno.

Lámparas de vapores de mercurio:

Emiten un espectro discontinuo o “espectro de líneas”(313, 365, 405, 436 y
546 nm). Son muy útiles para propósitos de calibración de longitudes de onda,
pero no son utilizadas en muchos espectrofotómetros. Se emplean en
espectrofotómetros para cromatografía HPLC.

Consideración práctica:
Es importante tener en cuenta que la cantidad de luz emitida por una lámpara no es
constante en un intervalo continuo de longitudes de onda, presentado máximos y
mínimos, propiedad que varía en los diferentes tipos de lámparas, e incluso con los
diferentes fabricantes; esto nos llevará a buscar siempre el tipo de lámpara que resulte
más adecuado en la práctica para los análisis que queremos realizar. Conviene tener
también en cuenta que las lámparas sufren con las subidas y bajadas bruscas de
tensión, que se traducen en cambios en las lecturas de absorbancias, y que la lámpara
tiene una vida limitada, haciéndose necesaria su vigilancia para el buen funcionamiento
del instrumento.
Rendijas:
La función de las rendijas de entrada es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre el sistema de selección de longitud de onda.

Las rendijas de salida tienen como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta,
lo que generaría desviaciones a la Ley de Beer.

Sistemas de selección de longitud de onda

Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda
deseados para el análisis. Se clasifican en filtros y monocromadores.

Filtros:
Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una
longitud de onda y absorbe todas las demás. Existen dos tipos:

Filtros de vidrio y filtros Wratten:

Basados en la transmisión selectiva de la luz. Los filtros Wratten consisten en una capa
de gelatina coloreada entre dos laminas de vidrio transparente. Los filtros de vidrio están
compuestos por una o más capas de vidrio coloreados. Ambos tipos transmiten más
energía radiante en una parte del espectro que en otras. Son preferibles los filtros de
vidrios por ser más duraderos, y menos susceptibles de daño por el calor y la luz solar.

Filtros de interferencia:
Basados en el principio de interferencia. Cuando la luz choca con una fina película, una
parte es reflejada en la superficie frontal de la película mientras que la que penetra en
ella es reflejada por la cara interior. Este último rayo de luz ha viajado más que el
primero, y la diferencia de recorrido viene dada por el espesor de la película. Si ambos
rayos reflejados(en la cara frontal y en la cara interior de la película) están en fase, su
intensidad queda duplicada, mientras que si están fuera de fase se anulan entre sí. De
esta forma, cuando la luz blanca incide sobre una película de este tipo, algunas de sus
 17

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

longitudes de onda quedan aumentadas, mientras que otras se anulan. Los filtros de
interferencia separan intervalos más estrechos de longitud de onda que los de vidrio.

Monocromadores:
Los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas que
los filtros, y tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una
amplia zona del espectro. El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o una
red de difracción.

Prismas:
Son fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro
material que permita la transmisión de la luz. Debido a la variación del índice de
refracción en función de la longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa
en mayor o menor medida según la longitud de onda de la luz. La dispersión de la luz no
es lineal, es decir, se hace cada vez menor a medida que se acortan las longitudes de
onda. Cuando se pretende trabajar en la zona visible del espectro y en la UV próxima, se
pueden utilizar prismas de vidrio, pero para trabajar en el UV lejano, han de ser de
cuarzo.

Redes de difracción:
Consisten en un gran número de líneas(hendiduras) paralelas, situadas a distancias
iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cuando incide la luz
blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; la luz se refleja
o atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores.

Parámetros de los sistemas de selección de longitud de onda:

Con excepción de los mecanismos ópticos láser, la luz obtenida con cualquier sistema
selector de longitud de onda no es verdaderamente monocromática, sino que comprende
un intervalo de longitudes de onda.

Es un sistema selector de longitudes de onda con una anchura igual para las rendijas de
entrada y salida, la luz que emerja de la rendija de salida se representa por un triángulo
isósceles y se definen varios parámetros:

Ancho de banda:
Es el intervalo de longitudes de onda que pasan a través de la rendija de salida
de un mecanismo selector de longitudes de onda.

Longitud de onda nominal de un haz de luz:Es la longitud de onda en la que se

halla el máximo de intensidad de luz. Se emplea para definir los filtros.

Anchos de banda nominal:

Corresponde a aquellas longitudes de onda centradas sobre la longitud de onda
máxima, que transmite el 75 por el 100 del total de la luz presente en el haz
emergente. Describe el grado de monocromaticidad de un monocromador.

El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En los

monocromadores, la rendija de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difracción
sobre la cual será dispersada. La rendija de salida determina el ancho de banda de la luz
que será seleccionada del espectro de dispersión. Aumentando el ancho de la rendija de
 18

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace más amplio, con lo cual aumenta
la intensidad de la energía, pero disminuye la pureza espectral.

En los monocromadores de red de difracción, la rendija de salida puede ser fija, lo que
resulta en un paso de banda constante. Por el contrario, en los monocromadores de
prisma, la rendija de salida es variable.

Cubetas:
Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición espectrofotométrica.

Formas:
Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamaño menor o mayor.
Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando
con las cubetas de lados paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Las
de forma redonda se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma
posición.

Materiales:
La mayoría están fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre
longitudes de onda que van de 320 a 950 nm. También existen cubetas de plástico. Para
medidas por debajo de 320 nm(UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que
también se podrían emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero su
costo lo desaconseja.

Sistemas de detección:
Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV:
células fotovoltaicas y fototubos. La elección de uno u otro sistema depende
fundamentalmente de la energía radiante de que se disponga. Si se han empleado como
selectores filtros o monocromadores de baja dispersión, éstos proporcionarán un haz de
luz de suficiente energía como para emplear células fotovoltaicas. Si se emplean
monocromadores de elevado poder resolutivo, hay que recurrir a fotomultiplicadores para
la detección.

Fotocélulas o células fotovoltaicas semiconductoras, o células con capa de

barrera:
Consisten en una lámina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material
semiconductor, como selenio u óxido cuproso. Esta capa está cubierta por una capa de
metal transparente que sirve como electrodo colector. Al iluminarse a través del electrodo
transparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un
amperímetro. Estos detectores son resistentes, relativamente económicos, y sensibles
desde el UV hasta los 1000 nm. No se requiere ningún aporte externo de energía, y la
corriente producida es directamente proporcional a la energía que llega.

Las fotocélulas muestran el llamado “efecto de fatiga”, consistente en que presentan una
subida inicial de corriente que luego decrece gradualmente hasta el equilibrio. Por ello,
conviene esperar unos 30-60 segundos entre lecturas.

Fototubos multiplicadores:
Es un tubo que contiene en su interior un cátodo consistente en una placa de metal que
emite electrones de forma proporcional a la energía que incide sobre ella.

Contiene además un ánodo, que recoge los electrones, y de 9 a dinodos o niveles de

energía.
 19

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Los electrones producidos en el primer choque contra el cátodo pasan a chocar contra
una superficie secundaria, donde cada electrón produce entre 4 y 6 electrones
adicionales que van a otro nivel(dinodos), y así sucesivamente, multiplicándose de este
modo el efecto del primer choque de la luz contra el cátodo, hasta que los electrones
llegan al ánodo, y la señal se amplifica en cientos o miles de veces.

Los fototubos tienen un rápido tiempo de respuesta, no muestran efectos de fatiga tan
altos como otros detectores, y son muy sensibles.

Sistemas de presentación de datos:

La energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de
datos. Estos pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir amplificados a
aparatos con detectores del tipo fotocélulas, o bien pueden introducir amplificadores de
señal, como ocurre en los aparatos con fototubos.

Hoy en día todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida también a la
introducción de microprocesadores, permite cálculos directos de concentración con
arreglo a factores de calibración prefijados, y lectura contra estándares, o curvas de
calibración en memoria.

A esta presentación digital de resultados se une también la posibilidad de conexión de

registradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinéticas, y en la realización
de barridos a través de intervalos de longitudes de onda del espectro.

4. ASPECTOS PRACTICOS
4.1 Empleos de blancos

A ntes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un “blanco”: esta maniobra
eliminará las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia
cubeta o el solvente de cromógeno.

Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se
establecerá una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las
condiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restará de las
absorbancias que se midan para los problemas.

Hay distintos tipos de blancos:

“Blanco de suero”:
La lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporción en un solvente
inerte, con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que puede producir la
propia muestra(p. ej.: hemólisis, lipemia, bilirrubinemia, color de la orina, etc.), antes de
que se produzca la reacción.

“Blanco de reactivos”:
Elimina las posibles interferencias que pueda introducir el reactivo. La lectura inicial se
hace con el reactivo, antes de adicionarle la muestra.
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4.2 Desviaciones de la Ley de Beer:

Son desviaciones producidas en la linearidad de la relación entre concentración y

absorbancias. La recta se curva antes de su limite de linearidad. Pueden causarlas
varios factores.

Se miden concentraciones muy elevadas de cromógeno.

La radiación incidente no es monocromática.

La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto.

La luz es transmitida por otros mecanismos(luz errática, o luz monocromática

que llega al detector).

Los lados de la cubeta no son paralelos.

Si hay interferentes(otros cromógenos absorben también a esa longitud de

onda).

Si existe fenómeno de fluorescencia.

4.3 Curvas de calibración:

La curva de calibración relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se

construye ensayando soluciones de distintas concentraciones, y estableciendo para cada
una de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda.

Para construir una curva de calibración, se deben estudiar concentraciones que cubran
el rango que se va a encontrar en la práctica, siempre que sea posible.
Las unidades de concentración empleadas en la curva deben ser las mismas que se
vayan a utilizar luego para expresar los resultados.

En la construcción de la curva se emplean un mínimo de tres puntos, que se representan

en la gráfica, y a continuación se traza una línea recta que se aproxime a ellos lo más
posible. Generalmente, a una concentración de 0 corresponde a una absorbancia de 0.
La curva debe abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del límite
de linealidad, para que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolación de
cualquier resultado en esta gráfica ofrezca un resultado fiable.

4.4 Empleo de factores de calibración:

Otra forma de trabajo consiste en utilizar lo que se llama factor de calibración; este factor
es el resultante de la aplicación de la ecuación básica de la espectrofotometría, y se halla
por una simple regla de tres, tras el ensayo de un estándar(comparando concentraciones
y absorbancias de estándar y problema).

Cs/Cp = As/Ap Cp = Cs/As x Ap Cp = F x Ap

Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener
constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la
absorbancia resultante por el factor, para conocer la concentración.
 21

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc.)
requiere el cálculo de un nuevo factor de calibración.

De igual manera, cuando se trabaje con una curva de calibración, cualquier ajuste en el
aparato, o cambio en los reactivos con que se fabricó, requieren la construcción de una
nueva curva.

Los aparatos deben mantenerse limpios y evitar agentes que produzcan cualquier
interferencia en el sistema fotométrico(polvo, suciedad de líquidos derramados, etc.). Las
fluctuaciones bruscas de luz afectan al sistema óptico del aparato, que sufre con ellas;
por otro lado, hay que vigilar el estado de la lámpara, puesto que experimenta un
desgaste con el tiempo.

Las cubetas a usar deben estar perfectamente limpias, y su superficie no debe presentar
ralladura alguna. No se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las que
haya de incidir el rayo de luz.

RECUERDA:
La radiación electromagnética es una forma de energía radiante, formada por
paquetes discontinuos de energía llamados fotones. Puede ser descrita en función
de sus propiedades ondulatorias: longitud de onda y frecuencia de la radiación

c h*C
 = E = h * E =
 
El espectro electromagnético comprende un amplio intervalo de longitudes de
onda, desde rayos gamma hasta microondas.

De las interacciones entre la luz y la materia se derivan de fenómenos de

absorción o emisión energética.

Proceso de absorción: un átomo, molécula o ion absorben la energía de un fotón

que incide sobre ellos.

Proceso de emisión: un elemento es excitado, y desprende su energía en forma

de energía radiante(luz medible).

Cuando se mide la absorción de luz por una solución, se definen los conceptos
de transmitancia y absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a
la concentración. La relación entre transmitancia y concentración es inversa y
logarítmica.

La Ley de Beer-Lambert rige la relación entre la absorbancia de una solución y

su concentración: A=a x b x c
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Basándonos en la Ley de Beer, podemos comparar las absorbancias y

concentraciones de dos soluciones, y calcular así la concentración de cualquier
solución problema.

Para calcular la concentración de una solución problema, podemos recurrir al

uso de factores o curvas de calibración.

Tipos de aparatos con arreglo al sistema selector de longitud de onda:

fotómetros(filtros) y espectrofotómetros(monocromadores).

Tipos de aparatos según la disposición de los sistemas fotométricos:

Espectrofotómetros de haz simple y Espectrofotómetros de doble haz(en el
espacio y en el tiempo).

Componentes esenciales; fuente de energía radiante, rendijas, sistema selector

de longitudes de onda, cubeta, sistemas de detección.

Se emplean blancos que marcan las condiciones iniciales de trabajo: blanco de

suero y blanco de reactivos.

Se pueden producir desviaciones a la Ley de Beer, que hacen que la relación

entre absorbancia y concentración deje de ser lineal.

El empleo de las curvas de calibración y factores exige que las condiciones de

trabajo sean estándar, y mantengan las mismas cuando se calcularon.

La práctica correcta de la espectrofotometría requiere el uso de aparatos

sometidos a un mantenimiento adecuado, así como de elementos
accesorios(cubetas, etc.)en perfecto estado.
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRÁCTICA DE LABORATORIO 1

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

ESPECTROFOTOMETRÍA
de Educación. Química.

ESPECTROFOTOMETRÍA

L a espectrofotometría es una de las técnicas de estudio más importantes en la

Biología celular y en la molecular. Se basa, esencialmente, en la propiedad de la gran
mayoría de las sustancias de importancia biológica de absorber la energía radiante de
una a otra frecuencia. Esta absorción es específica, haciendo posible su uso como
método para la identificación y cuantificación de tales sustancias.

ESPECTROFOTÓMETRO

LECTURA

GALVANÓMETRO
PRISMA

MUESTRA
FOTOCELDA
FUENTE DE LUZ

DIAFRAGMA COLIMADOR

Objetivos:
1. Efectuar el espectro de absorción de luz visible de varias sustancias.

2. Determinar la longitud de onda de máxima absorción de cada una de las sustancias.

3. Comprobar la relación entre la absorbancia y la concentración de la sustancia. (Ley

de Beer-Lambert).

4. Aplicar la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentración de una sustancia.

5. Aprender el manejo del espectrofotómetro.

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Materiales: Reactivos:
10 tubos de ensayo Azul de bromotimol (100 mg/litro)
1 gradilla Rojo Congo (100 mg/litro)
2 pipetas de 1 ml Permanganato de potasio (100 mg/litro)
2 pipetas de 2 ml Ácido acético al 5%(V/V)
2 pipetas de 5 ml Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.5
3 tubos para espectrofotometría
Espectrofotómetro

Procedimientos:

Cada grupo de estudiantes trabajará con una sustancia diferente. Los resultados
de los espectros y de la Ley de Beer-Lambert se deberán comparar en la discusión
de la práctica.

Solicite al profesor la explicación sobre el manejo del espectrofotómetro que

usará el grupo. No tiene que operarlo hasta que no se tenga la información necesaria
para hacerlo.

1. Determinación de los espectros de absorción:

1.1 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH 7.5.

Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol (100 mg/l), más 1 ml de amortiguador de
fosfatos y 8 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.2 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH ácido.

Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, más 9 ml de agua destilada y una gota de
ácido acético al 5%. Mezcle bien.

1.3 Determinar el espectro del rojo Congo.

Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como
blanco y otro con 1 ml de rojo Congo (100 mg/l), y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.4 Determinar el espectro de una mezcla de bromotimol y rojo Congo, a pH 7.5

Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, más 1 ml de amortiguador de fosfatos pH
7.5 más 1 ml de rojo Congo y 7 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.5 Determinar el espectro del permanganato de potasio.

Prepare dos tubos de ensayo así: uno con 10 ml de agua destilada que servirá como
blanco y otro con 1 ml de KmnO4(100 mg/l) y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1. Realice el espectro de cada sustancia midiendo la absorción de luz cada 30 nm,

desde 400 hasta 700 nm. Cada lectura debe efectuarse con una calibración previa
con el blanco a 100% de transmitancia.

2. Realice las graficas correspondientes de absorbancia vs. longitud de onda, en nm.

3. ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción para cada sustancia?

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

4. Determine la correspondencia entre el espectro de absorción y el color de cada una

de las sustancias.

5. ¿Qué características tiene el espectro de la mezcla del azul de bromotimol y el rojo

congo?

2. Comprobación de la Ley de Beer-Lambert:

Aquí se analizará la variación de la absorción con respecto a la concentración de la

sustancia que absorbe.

Cada tubo, con una concentración diferente de la sustancia, se lee a la longitud

de onda de máxima absorción obtenida en el experimento anterior.

Se operará así: se colocará el botón de longitud de onda en el valor

correspondiente a la longitud de máxima absorción, se calibra con el blanco a 100%
de transmitancia. Se reemplaza el blanco por las soluciones de diferente
concentración de la sustancia. Aquí no es necesario calibrar con el blanco de nuevo,
antes de cada medición, a menos que se sospeche que ha sucedido alteración de la
calibración.

Para cada una de las sustancias se deben preparar las siguientes diluciones,
partiendo de la solución original de 100 mg/l:

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7 8 Problema

Solución de la 0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0

sustancia (en ml.)

Agua destilada 9.75 9.5 9.0 8.5 8.0 7.0 6.0 10

(en ml.)

Concentración(mg/l)

El tubo problema contendrá una concentración de sustancia que deberá ser encontrada
por medio de la gráfica de absorbancia vs. concentración.

2.1 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul de bromotimol a pH 7.5

Para esto se preparan los tubos como se indica en la tabla pero debe
remplazarse 1 ml de agua destilada por 1 ml de amortiguador de fosfato pH 7.5,
en cada uno de los tubos. Mezclar bien.

2.1 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul bromotimol a pH ácido

Prepare las diluciones como se indica en la tabla y agregue a cada tubo 1 gota
de ácido acético al 5%. Mezclar bien.

2.3 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con rojo congo.

Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

2.4 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con permanganato de potasio.

Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.

En cada caso, tabule sus datos, elabore una gráfica de absorbancia vs. concentración en
mg/l y establezca la concentración del problema.

Preguntas:

1. ¿Cuáles son los fundamentos en los que se basan las técnicas espectrofotométricas?

2. ¿Qué relación existe entre los espectros de absorción de las sustancias y el color
que poseen?

3. ¿Qué aplicaciones tienen las técnicas espectrofotométricas?

4. ¿Qué factores pueden producir desviaciones al aplicar la Ley de Beer Lambert?

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

LABORATORIO 1: ESPECTROFOTOMETRÍA

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Qué es un espectrofotometro?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

2. Cuáles son los pasos que deben seguir para el manejo del espectrofotometro
análogo y el digital.

a) Análogo:
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

b) Digital:
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

DETERMINACIÓN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN

Nombre de la sustancia: A: ______________________________________

LONGITUD DE TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

ONDA ‫גּ‬
400
430
460
490
520
550
580
610
640
670
700

Nombre de la sustancia: B: Azul de bromotimol y rojo congo pH 7.5

LONGITUD DE TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

ONDA ‫גּ‬
400
430
460
490
520
550
580
610
640
670
700
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Realice la gráfica del espectro de absorción de las sustancias A y B

Grafica 1.

Gráfica 2:
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

COMPROBACIÓN DE LA LEY DE BEER-LAMBERT: Variación de la

absorción con relación a la concentración.

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7 8 Problema

Solución de la 0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0

sustancia (en ml.)

Agua destilada 9.75 9.5 9.0 8.5 8.0 7.0 6.0 10

(en ml.)

Transmitancia

Absorbancia

Concentración (mg/l)

Realice la gráfica de la Absorbancia vs Concentración y determine la

concentración de la solución problema mediante la ecuación de la recta y curva de
calibración.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 25.

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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_________________________________________________________________
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
2. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
3. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRÁCTICA DE LABORATORIO 2

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

MACROMOLECULAS DE LA LEVADURA

O bjetivos:
1. Separar por centrifugación las principales macromoléculas de la
levadura.(Saccharomyces ssp).

2. Identificar cualitativamente dichas macromoléculas: proteínas, ácidos núcleicos y

glucógeno.

Materiales: Reactivos:

4 tubos de centrífuga Levadura de panadería

Mortero Ácido tricloroacético al 5 %
2 pipetas de 10 ml
2 pipetas de 1 ml Arena lavada y seca
1 probeta de 50 ml Alcohol etílico
1 vaso de 400 ml Reactivo de yodo (lugol)
1 cubeta de hielo Cloruro de sodio al 10 %
1 agitador Cloruro de sodio 0.15 M
1 gradilla Reactivo de Orcinol
15 tubos de ensayo Sulfato de cobre 0.1 M
Plancha de calentamiento Hidróxido de Sodio 10 M
Centrífuga refrigerada Amortiguador salino (citrato de sodio 0.015 M
y NaCl 0.15 M en volúmenes iguales).

Procedimiento:

1. En un mortero coloque el equivalente a una cucharadita de levadura de panadería,

lavada y seca. Agregue una cucharadita de arena lavada y seca y triture
cuidadosamente por 5 minutos.

Agregue 15 ml de ácido tricloroacético al 5 % y macere cuidadosamente por tres minutos

más.

Deje que la arena se asiente y decante la suspensión lechosa vertiéndola a un tubo de

centrífuga.

Centrifugue a 3000 revoluciones durante 5 minutos.

 33

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Usted obtendrá un precipitado que contiene ácidos nucléicos y un sobrenadante que

contiene glucógeno.

2. Pase el sobrenadante a un tubo de ensayo y el tubo de centrífuga con el precipitado

colóquelo en un baño de hielo.

Precipite el glucógeno añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico, agitando y enfriando en

el baño de hielo.

Pase este medio a un tubo de centrífuga y centrifugue a 3000 r.p.m.

Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 1 ml de agua destilada.

Para utilizar como control coloque otro tubo de ensayo 1 ml de agua destilada y a ambos
agregue 1 ml del reactivo de yodo, el cual tiñe el glucógeno de pardo rojizo.

T enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

3. Ahora, tome el precipitado de ácidos nucléicos y proteínas y agréguele 15 ml de

cloruro de sodio al 10 %, agitando cuidadosamente.

Como tenía este medio con el tubo de centrífuga, páselo a un tubo de ensayo y
colóquelo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.

Enfríe luego cuidadosamente y pase el medio a un tubo de centrífuga, centrifugando a

3000 r.p.m., durante 3 minutos.

El sobrenadante contiene ácidos nucléicos, páselo a un tubo de ensayo, y deje el

precipitado protéico en un baño de hielo.

Tome el tubo que contiene los ácidos nucléicos y precipítelos añadiendo 2 volúmenes de
etanol frío, lentamente y agitando sobre un baño de hielo y déjelo por unos 3 minutos.

Vierta el contenido a un tubo de centrífuga y centrifugue durante 3 minutos a 3000 r.p.m.

Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 2 ml de amortiguador salino.

Coloque en otro tubo como control 2 ml de amortiguador salino, y a ambos agregue 3 ml

del reactivo de orcinol; coloque los tubos en un baño de agua hirviendo durante algunos
minutos.

Una coloración verde indica la presencia de ARN.

T enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

 34

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

4. Tome el precipitado de proteínas coaguladas y disuélvalo con 2 ml de solución salina

0.15M.

En otro tubo de ensayo, como control coloque 2 ml de la solución salina.

Añada a cada tubo 1 ml de la solución de sulfato de cobre, luego 2 ml de hidróxido de

sodio 10 M. Mezcle y observe.

La aparición de un color violeta indica la positividad de la prueba (Prueba del Biuret).

T enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.

Preguntas:
1. Cuáles son los fundamentos de las técnicas de extracción (Cuál es la utilidad de cada
uno de los pasos que se sigue y de cada uno de los reactivos que se utiliza para purificar
las macromoléculas y de las pruebas de identificación empleadas en esta práctica.

2. Escriba las reacciones químicas correspondientes de las diferentes pruebas de

identificación utilizadas.

Preparación de reactivos:

Reactivo de Orcinol:
Se disuelven 0.1 g de FeCl3 en 100 ml de HCl y se mezclan con 3.5 ml de etanol que
llevan disueltos 0.3 g de Orcinol.

Amortiguador salino:
Se mezclan citrato de sodio 0.015 M y NaCl 0.15 M en volúmenes iguales.

Lugol:
Para 500 ml, pesar 0.83 g de KI y disolver en agua. Agregar 1.3 g de Yodo metálico.
Agitar fuertemente.
 35

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

LABORATORIO 2: MACROMOLECULAS DE LEVADURA

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE: _________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Describa la apariencia del macerado inicial?

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

2. ¿Cuál es la apariencia y el color del precipitado y del sobrenadante obtenido

después de la primera centrifugación?

____________________________________________________________

_____________________________________________________________

3. Qué sucede con el sobrenadante cuando se le agregan los volúmenes de

etanol frío? ¿Color?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

4. Cuál es la apariencia del precipitado después de la segunda centrifugación?

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

5. Que observan cuando agregan el reactivo de yodo (lugol)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________
 36

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

6. Cómo interpretan este resultado?

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

7. Cómo interpretan lo que sucede al calentar el tubo que contiene ácidos

nucleicos y proteínas?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

8. ¿Describa el precipitado y el sobrenadante, productos de la tercera

centrifugación?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

9. Qué apariencia presenta el sedimento después de la cuarta centrifugación?

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

10. ¿Cómo reaccionan las muestras de los diferentes tubos con el reactivo de
orcinol?
_____________________________________________________________

______________________________________________________________

______________________________________________________________

11. Qué aspecto presenta la solución de proteínas después de disolverlas con la

solución salina 0.15M?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

12. Qué observan al realizar el ensayo con NaOH y CuSO4 con ambas
muestras?
_____________________________________________________________

_____________________________________________________________
 37

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

13. Qué otros aspectos desean destacar de la práctica realizada?

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

14. Anexar las fichas técnicas de los reactivos y sustancias empleadas en

esta práctica.

15. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 33

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRÁCTICA DE LABORATORIO 3

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

AMINOÁCIDOS

O bjetivos:

1. Separar los componentes de una mezcla de aminoácidos por medio de la

cromatografía de papel.

2. Determinar el Rf de algunos aminoácidos en el sistema empleado.

3. Establecer la influencia de la estructura de la cadena lateral R de los aminoácidos en

el Rf.

4. Analizar la reacción de algunos aminoácidos con ciertos agentes químicos que

permiten su reconocen cualitativo y cuantitativo.

Materiales: Reactivos:
30 tubos de ensayo Nitrito de sodio (10 g/l)
3 gradillas Reactivo de ninhidrina
4 pipetas de 5 ml Ácido nítrico concentrado
2 pinzas para tubos Solvente: Etanol + Agua + Amoniaco
Plancha de calentamiento (80-10-10 en volumen)
NaOH 10 M
1 vaso de precipitados de 500 ml Ácido acético glacial
2 tubos capilares Fenol (1 g/l)
2 “clips” (debe traer el grupo) Nitroprusiato de sodio (20 g/l)
1 papel para cromatografía Reactivo de Millón
1 erlenmeyer de 500 ml con tapón Papel indicador de pH
1 estufa a 110º C Mezcla de aminoácidos (1 g/l) de
1 rociador alanina, leucina y ácido aspártico.
1 secador de pelo (debe traer el grupo) Soluciones (1 g/l) de los aminoácidos:
prolina, ácido aspártico, leucina,
glicina, alanina, tirosina, fenilalanina,
triptófano, cisteína, metionina, lisina
y asparagina.

Procedimiento:

1. Separación de aminoácido por medio de cromatografía de papel

En el trozo de papel para cromatografía trace una línea con lápiz, a 2 cm del borde
inferior (Maneje el papel por los bordes para no contaminarlo).
 40

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Sobre esta línea y a una distancia de 2 cm de separación, coloque 3 aplicaciones de las

soluciones siguientes (en puntos separados):

a. Alanina b. Ácido aspártico c. Leucina

d. Mezcla de alanina, leucina y ácido aspártico.

Deje secar bien cada muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto (Utilice el
aire caliente de un secador de pelo).

Cuando termine las aplicaciones y las muestras estén bien secas, enrolle el papel
tratando de formar un cilindro, de modo que las muestras queden hacia fuera. Sujete el
cilindro con un clip en el borde contrario al de las muestras.

Coloque el papel de filtro enrollado en el centro del erlenmeyer que contiene el solvente,
de tal modo que el borde con las muestras quede sumergido en él, y tratando de que el
papel no quede inclinado y que no toque las paredes con el recipiente. Tápelo y deje
desarrollar el cromatograma sin mover el recipiente, hasta que el frente del solvente
llegue a unos dos centímetros del borde superior. Cuando esto ocurra, saque el papel
del erlenmeyer con unas pinzas y colóquelo en un sitio ventilado para que se seque.

Una vez seco solicite al profesor el rociamiento con ninhidrina (Evite respirar estos
vapores) y déjelo en la oscuridad por media hora o a una temperatura de 110º C en la
estufa, durante 5 minutos.

Saque el papel y observe las manchas. Rodee su perímetro con una línea hecha a lápiz
y determine el centro de la mancha.

Preguntas:
1. ¿En qué consisten las manchas observadas?

2. Determine los Rf de los aminoácidos en el cromatograma.

3. ¿Qué explicaciones pueden darse a las diferencias de migración observadas?

2. Algunas reacciones químicas con aminoácidos:

Reacción con ninhidrina:

En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solución de los siguientes aminoácidos:
prolina, ácido aspártico, arginina, leucina, asparagina, metionina y tirosina. Añada a cada
tubo 0.5 ml de ninhidrina en acetona al 1 %. Coloque los tubos en un baño de agua
hirviendo por 5 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y observe la coloración de
cada tubo. Un color azul, violeta o marrón se considera positivo. La prolina debe dar un
color amarillo.

Reacción xantoproteica:
En sendos tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solución de cada uno de los siguientes
aminoácidos: glicina, tirosina, triptófano, fenilalanina, y fenol. Agregue a cada tubo 0.5 ml
de ácido nítrico concentrado. Como la reacción es exotérmica, deje enfriar y observe los
cambios de color. Agregue luego a cada tubo 2 ml de NaOH 10 M.
El cambio de coloración amarilla en medio ácido, a anaranjado en solución alcalina,
constituye un resultado positivo.
 41

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Prueba con nitroprusiato de sodio:

Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, cisteína, tirosina, triptófano,
fenilalanina, metionina, ácido aspártico, arginina. Agregue 0.5 ml de nitroprusiato y luego
0.5 ml de hidróxido de amonio. La aparición de un color rojo se considera positivo.

Reacción con ácido glioxílico:

Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, tirosina, triptófano, fenilalanina,
metionina y añada 2 ml de ácido acético glacial que haya sido expuesto a la luz (contiene
ácido glioxílico). Inclinando cada tubo y sin agitar deje caer lentamente por las paredes 2
ml de ácido sulfúrico concentrado. Observe que se forman dos capas y en su interfase
hay un cambio de color. Un anillo de color violeta se considera positivo.

C UESTIONARIO: Para todos los casos explique el fundamento químico de las

reacciones y escriba las ecuaciones correspondientes. En la hoja de reporte, después de
analizar sus resultados, indique cuales reacciones son generales y cuales son
específicas.

Preparación de reactivos:

Ninhidrina:
Ninhidrina 0.6 g y disolver en 300 ml, de acetona.
La acetona puede reemplazarse por etanol, etanol o isopropanol.

Solvente para la cromatografía:

Para 800 ml, se mezclan 640 ml de etanol, 80 ml de agua destilada y 80 ml de amoniaco.
 42

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

LABORATORIO 3: AMINOACIDOS

HOJA DE REPORTE

Asistentes: (sólo los que han PARTICIPAD0 de la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Separación de aminoácidos por cromatografía de papel

Realicen un esquema del cromatograma después de haber sido revelado con

nihidrina (Adhieran el cromatograma realizado)
 43

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

2. Cromatografía de aminoácidos:
Fase estacionaria: _________________________ Fase móvil: ______________
Revelador: _______________________________________________________
Patrones: ________________________________________________________

3. Calculen el Rf para cada uno de los aminoácidos?

a) Alanina: _________________

b) Ácido aspártico: _________________

c) Leucina: _________________

d) Mezcla: _____________________________________

4. Qué concluyen con respecto a lo observado.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
 44

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

2. Algunas reacciones de los aminoácidos.

En la siguiente tabla indique el color u otra característica sobresaliente de la

reacción positiva de los aminoácidos, con las diferentes pruebas realizadas:

Aminoácido Ninhidrina Xantoproteica Nitroprusiato Ácido

de sodio glioxílico
PROLINA

A. ASPARTICO

ARGININA

ASPARAGINA

CISTEINA

FENILALANINA

FENOL

GLICINA

LEUCINA

METIONINA

TIROSINA

TRIPTOFANO

5. Cuáles son las pruebas generales y cuáles son específicas para determinados

aminoácidos?

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado en
esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 39 y 40.

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:______________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________
 46

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRÁCTICA DE LABORATORIO 4

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

PROTEÍNAS

O bjetivos:
1. Determinar el efecto de la temperatura, los solventes orgánicos, los pH
extremos, la concentración salina y los iones metálicos pesados, sobre la
estabilidad de una proteína en solución.

2. Analizar algunas de las reacciones para la determinación de la presencia de

proteínas.

3. Separar una proteína en solución por medio de insolubilización reversible e

irreversible.

Materiales: Reactivos:
15 tubos de ensayo Solución de albúmina al 2 %
2 gradillas Acetona
1 termómetro HCl 9 N
1 vaso de 250 ml NaCl al 20 %
4 pipetas de 5 ml Sulfato de amonio
4 tubos de centrífuga Ácido tricloroacético al 50 %
1 centrifuga NaOH 5 M
1balanza Sulfato cúprico 0.1 M
1 probeta de 50 ml
papel filtro Hidróxido de amonio
HNO3 20%
acetato de plomo 0.005 M
etilendiaminotetracético (EDTA) 0.05 M

Plancha de calentamiento 1 huevo (debe traerlo cada grupo)

1 pinza de madera

Procedimiento:

1. Coagulación de una proteína:

Coloque 7 tubos de ensayo en una gradilla y numérelos. (De la clara de huevo obtenida
separe 5 ml, para el tubo, el resto se le agrega agua, se agita y se completan 100 ml.
Luego se filtra y se hacen con esta solución todos los ensayos). Vierta en cada tubo 3 ml
de la solución de albúmina, excepto al No 1 que lleva los 5 ml de clara.
Realice lo siguiente:
 47

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Tubo No. 1: Se calienta suavemente y poco a poco en un baño de agua,

controlando la temperatura mediante un termómetro colocado en el interior del tubo.
Determine la temperatura a la cual se insolubiliza la proteína.

Tubo No. 2: Agregue 2 ml de acetona. Deje en reposo y observe que pasa al

cabo de algunos minutos.
Tubo No. 3: Añada 1 ml de HCl 9 N. Observe.

Tubo No. 4: Agregue 2 ml de NaCl al 20 %. Observe

Tubo No. 5: Añada 2 ml de HNO3 al 20%. Observe

Tubo No. 6: Agregue 4 ml de NaOH 5 M. Observe

Tubo No. 7: Control

Preguntas:

1. ¿Qué explicación puede dar en cada caso?

2. ¿Cuáles factores pueden causar la coagulación de una proteína?

2. Precipitación de la proteína por iones metálicos pesados

Deposite en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina, y añádale 1 ml de

acetato de plomo 0.005 M. Espere algunos minutos y observe.

Preguntas:

1. ¿En qué consiste la reacción observada?

2. ¿Qué otras sustancias la pueden producir?

Agregue ahora 1 ml de ácido etilendiaminotetracético(EDTA) 0.05 M. Agite y observe.

Preguntas:

1. ¿Porque ocurre la reacción observada?

3. Insolubilización reversible e irreversible

En un tubo de ensayo coloque 5 ml de la solución de albúmina, agregue en porciones

pequeñas y agitando para que se disuelva bien, 2.36 g de sulfato de amonio. Observe.
En otro tubo de ensayo, coloque 5 ml de la solución de albúmina y añada 1 ml de ácido
tricloroacético al 50 %. Observe.
Centrifugue las suspensiones de ambos tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos.
Separe el sobrenadante de ambos tubos por decantación, deséchelo y conserve el
sedimento de ambos tubos.

Preguntas:
 48

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

1. ¿En qué consisten los sedimentos?

Agregue a cada tubo 4 ml de agua destilada y agite bien. Observe y anote los resultados.

Preguntas:

2. Compare ambos resultados. ¿Qué concluye?

4. Reacción xantoproteica:

Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina y agréguele 3 ml de ácido

nítrico al 20 %. Observe.
Caliente en un baño de agua por algunos minutos. Observe.
Enfríe el tubo y posteriormente añada 3 ml de hidróxido de amonio. Anote los resultados.

Preguntas:

1. Cuál es el fundamento químico de esta reacción?

5. Reacción de Biuret:
Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina. Añada el mismo
volumen de hidróxido de sodio 5 M, y 5 gotas de sulfato cúprico 0.1 M. Observe.

Preguntas:

1. Cuál es el fundamento químico de esta reacción?

2. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína?

3. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret?

RECUERDA QUE DEBES:

Interpretar todos estos resultados y elaborar las conclusiones correspondientes.

 49

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PROTEÍNAS

FECHA: ___________ SEMESTRE: ____________ GRUPO: ________

ASISTENTES: (Sólo los asistentes a la clase)

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

1. Coagulación de proteínas:
Tubo Observaciones

1. Calor

2. Acetona

3. HCl 9N

4. NaCl 20%

5. HNO3 20%

6. NaOH 5M

7. CONTROL

OBSERVACIONES
2. Precipitación de proteínas por iones metálicos pesados
Solución de albúmina + acetato de
plomo:__________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
 50

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

________________________________________________________________
________________________________________________________________

Qué ocurre al agregar EDTA?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

3. Insolubilización reversible e irreversible:

Solución de albúmina + sulfato de amonio: _____________________________

________________________________________________________________
________________________________________________________________

Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada:

________________________________________________________________
________________________________________________________________
_________________________________________________

Solución de albúmina + ácido tricloroacético:

________________________________________________________________
________________________________________________________________
_________________________________________________

Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada:

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

Cuál de los tratamientos causó insolubilización reversible de la albúmina de

huevo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

¿Porqué? ________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

Cuál de los tratamientos causó insolubilización irreversible de la albúmina de

huevo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
 51

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

¿Porqué? ________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

4. Reacción xantoproteíca:

Solución de albúmina + HNO3 al 20%

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

________________________________________________________________

¿Qué observa después de calentar suavemente?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

________________________________________________________________

5. Reacción de Biuret:

¿Qué cambios observa al utilizar los reactivos del proceso?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

________________________________________________________________

¿Qué observaciones tienen de la práctica en general?:

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

14. Anexar las fichas técnicas de los reactivos y sustancias empleadas en esta
práctica.

15. Anexar las respuestas del cuestionario de la página 46 y 47

16. Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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Conclusiones:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

_________________________________________________________________
PRÁCTICA DE LABORATORIO 5

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

AMILASA SALIVAL

I ntroducción:

La saliva, secretada por las glándulas salivales en cantidad aproximada de un litro diario,
contiene una enzima que cataliza la hidrólisis(digestión) del almidón a través de una
serie de intermediarios más pequeños(dextrinas) hasta que el producto final que es la
maltosa.

Esta enzima se llama Amilasa Salival, la que en la actualidad ha sido purificada y

sintetizada en forma cristalina.

La reacción enzimática de la amilasa salival puede seguirse fácilmente con la prueba de

yodo.

El yodo produce un color intensamente azul con el almidón.(Realmente sólo con el

componente llamado amilosa).

Cuando se hidroliza el almidón, las pruebas repetidas con yodo van desde un color azul,
pasando luego al violeta, luego al rojo o pardo rojizo (dextrinas), y finalmente
incoloro(dextrinas más pequeñas: maltosa), indicándose así el curso de la reacción.

Objetivos:

1. Determinar algunas características de la reacción de hidrólisis del almidón por

medio de la catálisis con la amilasa salival.

2. Medir el efecto de la concentración de la enzima con respecto a la velocidad de

reacción.

3. Analizar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima.

4. Seguir las características cinéticas de la reacción de hidrólisis del almidón,

mediante la aplicación de la prueba de yodo.

5. Deducir algunos factores que pueden afectar la velocidad de las reacciones

catalizadas por enzimas.
 54

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Velocidad de la reacción vs. Concentración de la enzima:

Materiales: Reactivos:
12 tubos de ensayo Saliva (traer frasco para toma
de muestra de orina)
2 gradilla Suspensión de almidón
Lugol
2 laminas de vidrio Parafina
4 goteros (Traerlos) Buffer pH 6.8
3 pipetas de 5 ml
1 hoja de papel milimetrado (traerla)
1 probeta de 100 ml
1 cronómetro o reloj con segundero (traerlo)

Procedimiento:

Estimule su flujo salival masticando suavemente un pedazo de parafina y deposite en un

tubo de ensayo unos 5 ml de saliva.

Prepare las siguientes diluciones de saliva utilizando agua de la llave, así:

Dilución Concentración de saliva

ml de saliva: ml de agua %(V/V)
1 : 9 10
0.5 : 9.5 5
0.2 : 9.8 2
0.1 : 9.9 1

Mide la actividad de las 4 diluciones de saliva, de la siguiente manera:

1. En un tubo de ensayo coloque 2 ml de la suspensión de almidón y añada 2 ml de

amortiguador de pH 6.8 y agite.

2. Coloque una gota de la mezcla anterior sobre la lámina de vidrio y agréguele una
gota de la solución de yodo, para comprobar la reacción de almidón. (Debe
aparecer un color azul intenso).

3. Coloque en tubo de ensayo 1 ml de saliva de la del 10 % y vierta sobre el

contenido del tubo anterior(mezcla de almidón y amortiguador). En este
momento se inicia la reacción y es el tiempo CERO. Agite.

4. Saque una gota de esta mezcla cada 20 segundos y colóquela sobre la lámina
de vidrio y agréguele una gota de yodo.

5. Suspenda las pruebas, cuando al añadir la solución de yodo, la mezcla quede

del mismo color que la solución yodada.

6. Anote el color que resulte, cada vez que haga las pruebas.

7. Explique las coloraciones presentadas.

 55

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

8. Sobre la base del número de muestras determine el tiempo transcurrido.

9. Repita los pasos de 1 hasta 5, utilizando cada vez la saliva de las otras
concentraciones. En estos casos ustedes pueden alargar los intervalos de
tiempo dependiendo de la velocidad que observen en el desarrollo de la
reacción.

10. Compare la actividad de la saliva usada por ustedes, con la de otros grupos, en
termino de los tiempos requeridos para llegar al punto final, en los tubos en los
que agregó saliva al 2 %.

11. Compare el resultado de su propio experimento con los valores mínimo, máximo
y promedio del curso.

12. ¿Qué explicación podrían proponer a las diferencias observadas?

13. Realice una gráfica del recíproco del tiempo requerido para llegar a su punto
final(1/min) y su concentración.

Para preparar el buffer pH 6.8:

NaH2PO4 H2O 0.2 M 13.8 g/500 ml
Na2HPO4 0.2 M 14.2 g/500 ml
122.5 ml de Na2HPO4 + 127.5 ml de NaH2PO4 y se completa la solución a 500 ml de

Diluciones de la saliva

10%
5% 2% 1%
9 ml agua
9.5 ml agua 9.8 ml agua 9.9 ml agua

1 ml saliva 0.5 ml saliva 0.2 ml saliva 0.1 ml saliva

Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la

reacción frente a concentración de enzima

2 ml Buffer 6.8 2 ml Buffer 6.8

2 ml Buffer 6.8 2 ml Buffer 6.8

2 ml almidón 2 ml almidón
2 ml almidón 2 ml almidón

1%
10% 5% 2%

1 ml saliva 1 ml saliva 1 ml saliva

1 ml saliva

solución.
 56

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

AMILASA SALIVAL PRIMERA PARTE

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Velocidad de la reacción (1/t) frente a concentración de la enzima (V/V)

Concentración de la saliva Tiempo de la reacción Velocidad de la reacción

% (V/V) (t en segundos) (1/t en minutos -1)
10
5
2
1

Tiempo COLOR
segundos
10% 5% 2% 1%
 57

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe esta gráfica 1.

Gráfica 1.

¿Cómo interpreta la gráfica realizada? _______________________________________

_______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________

Compare sus datos con los resultados obtenidos por los otros grupos:

Grupo No. PH de la saliva Tiempo de la reacción Velocidad de la reacción

empleada en la práctica (t en segundos) (1/t en minutos -1)
1
2
3
4
5

¿Al analizar los datos que pueden concluir?

_______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
 58

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 54.

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
 59

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Velocidad de la reacción de la enzima con relación al pH y la

temperatura.

M ateriales:
14 tubos de ensayo Saliva
Reactivos:

2 gradillas Suspensión de almidón

1 vaso de 500 ml Solución de yodo
1 lamina de vidrio Parafina
2 goteros(Traerlos) Amortiguadores de pH: 3.4,
3 pipetas de 5 ml 5.0, 6.8, 8.0, 10.0
1 hoja de papel milimetrado
1 probeta de 100 ml Otros:
1 termómetro(traerlo) Baño de agua a 37º C
Plancha de calentamiento Baño con hielo
Baño de agua hirviendo
Papel milimetrado
Papel indicador de pH

Procedimiento:

Velocidad de Reacción vs. Temperatura

1. Prepare una dilución de saliva de concentración del 2 %.

2. En 4 tubos de ensayo de 2 ml de la suspensión de almidón y 2 ml del

amortiguador de pH 6.8.

3. Vierta en 4 tubos de ensayo diferentes 1 ml de la saliva del 2 %.

4. En orden trabaje con cada par de tubos(mezcla de almidón y amortiguador y el

de saliva) dejándolos durante unos 3 minutos en cada uno de los medios para
que adquieran la temperatura del sistema, así:

1 par en baño de hielo 1 par a temperatura ambiente

1 par en baño a 37º C 1 par en baño de agua hirviendo

5. Una hora el contenido de cada par de tubos.(Recuerde que es el tiempo CERO),

y proceda a realizar las pruebas con yodo tal como en la práctica anterior.

Se recomienda que para los medios de temperatura ambiente y 37º C, se hagan ensayos
cada 20 segundos; y para los baños en hielo y agua hirviendo cada 3 a 5 minutos según
la actividad que haya mostrado la enzima.
 60

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Preguntas:

1. ¿De las temperaturas utilizadas, cuál es la óptima para la acción de la amilasa

salival?

2. ¿Porqué disminuye la actividad de la enzima a temperaturas extremas?

3. Relacione el experimento con la temperatura del cuerpo humano.

4. Realice una gráfica en papel milimetrado del 1/ tiempo vs. temperatura.

2. Velocidad de la Reacción vs. pH

1. Vierta en 5 tubos de ensayo 1 ml de la saliva del 2 %

2. En otros tubos de ensayo eche en cada uno 2 ml de la suspensión de almidón y

amortigüe uno con 2 ml del buffer pH 3.4; otro con pH 5; otro con pH 6.8; el
siguiente con pH 8 y finalmente el último con pH 10.

3. Realice los ensayos correspondientes con yodo como en los casos anteriores,
utilizando intervalos de 20 segundos para los pH 6.8 y 8 y de 3 a 5 minutos para
los otros casos.
 61

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la reacción

frente a temperatura
Dilución de la muestra de saliva escogida

2 ml
2 ml 2 ml
Buffer 6.8
Buffer 6.8 Buffer 6.8
2 ml
2 ml 2 ml
almidón
almidón almidón

37ºC
Baño de hielo
Ebullición

1 ml saliva 1 ml saliva
1 ml saliva

Preparación de las muestras para la prueba de velocidad de la reacción

frente a pH
Dilución de la muestra de saliva escogida

2 ml 2 ml
2 ml 2 ml
Buffer 3.4 Buffer 10
Buffer 5.0 Buffer 8
2 ml 2 ml
2 ml 2 ml
almidón almidón
almidón almidón

10
3.4 5.0 8

1 ml saliva 1 ml saliva 1 ml saliva

1 ml saliva

Preguntas:

1. De los pH utilizados, ¿cuál es el óptimo para la actividad de la amilasa salival?

2. Mida el pH de la saliva de todos los miembros de su grupo, utilizando el papel

indicador. ¿Cuál es el pH más frecuente?

3. Compare con otros grupos de trabajo. ¿Cuál es el pH más común en el curso?

4. ¿Cómo relaciona el pH óptimo con el pH de su saliva?

5. Tabule sus resultados y haga una gráfica de 1/ tiempo vs. pH

6. ¿Disminuye la actividad de la amilasa salival a pH extremos? ¿Porqué?

 62

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:

P ara preparar los Buffer:

pH 8: 94.7 ml de Na2HPO4 + 5.3 ml de NaH2PO4 y se completa a 200 ml de solución.

pH 3.4 y 5: Ácido cítrico 2.1g/ 100 ml, Citrato de sodio 2.34g/ 100 ml

3.4: 43.8 ml de ácido cítrico + 16.2 ml de citrato

5: 21.0 ml de ácido cítrico + 39,0 ml de citrato

pH 10: Carbonato de sodio 1.06g /100 ml, Bicarbonato de sodio 0.84g /100 ml
10: 60 ml de carbonato + 40 ml de bicarbonato

Almidón: 2.5 g de almidón soluble + 2.5 g de sal en 500 ml

 63

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

AMILASA SALIVAL SEGUNDA PARTE

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

2. Velocidad de la reacción (1/t) frente a temperatura.

Temperatura Tiempo de la reacción Velocidad de la reacción

de la T ºC (t en segundos) (1/t en minutos -1)
reacción
Baño de
hielo
Ebullición
Ambiente aprox 25ºC
Corporal 37ºC

Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe la gráfica

Cómo interpreta la gráfica realizada: ___________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Gráfica 2.
 64

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

3. Velocidad de la reacción frente a pH

pH de la reacción Tiempo de la reacción Velocidad de la reacción

(t en segundos) (1/t en minutos -1)
3.4
5.0
6.8
8.0
10.0

Con los datos obtenidos realice una gráfica en papel milimetrado. Anexe la gráfica

¿Cómo interpreta la gráfica

realizada?__________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

¿Qué otras observaciones tienen sobre la práctica?

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

Qué pueden concluir de la práctica realizada?

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

Gráfica 3

PRÁCTICA DE LABORATORIO 6

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.
 65

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 59 y 60.

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
 66

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS

O bjetivos:

1. Utilizar una reacción general y algunas específicas para la identificación de

glúcidos.

2. Efectuar algunas de las reacciones especificas para el reconocimiento de

azucares reductores.

3. Analizar la capacidad de diversos tratamientos para ocasionar la hidrólisis de la

sacarosa y del almidón.

Materiales: Reactivos:
40 tubos de ensayo Ácido sulfúrico concentrado
1 vaso de 500 ml 2 pinzas de madera
Alcohol amílico
1 mechero de gas
4 pipetas de 5 ml y 3 de 1ml Papel indicador de pH
Plancha de calentamiento Reactivos de Molisch, Benedict, Bial,
3 gradillas Barfoed y Selivanoff.
Soluciones al 1 % de glucosa, fructosa,
arabinosa, lactosa, sacarosa, maltosa y
almidón.

Procedimiento:

1. Reacción de Molisch:

En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de las soluciones de los glúcidos y en otro
0.5 ml de agua destilada(blanco). Agregue a cada tubo con cuidado y sin agitar, 2 gotas
del reactivo de Molisch, luego inclinando el tubo deje resbalar en cada uno 0.5 ml de
ácido sulfúrico concentrado; deje reposar por unos tres minutos y observe la reacción.

Preguntas:

1. Qué tipo de glúcidos pueden reconocerse por esta reacción?

2. Explique el fundamento químico de ella.

2. Reacción de Benedict:

En sendos tubos coloque 1 ml de las soluciones de glúcidos y en otro 1 ml de agua

destilada(patrón). Agregue a cada tubo 1 ml del Reactivo de Benedict. En un vaso tenga
agua a ebullición y coloque en los tubos durante unos 3 minutos.
 67

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Preguntas:

1. ¿Qué tipo de glúcidos reaccionan con el Reactivo de Benedict?

2. Escriba la ecuación química general para este proceso.

3. Reacción de Barfoed:

Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glúcidos y

en otro 1 ml de agua destilada. Agregue a cada uno 1 ml del Reactivo de Barfoed.
Coloque los tubos en un baño a ebullición por 3 minutos. Observe los cambios y explique
los resultados.

Preguntas:

1. Qué glúcidos se podrían identificar mediante esta reacción?

2. Escriba la ecuación química general para este proceso.

4. Prueba de Bial:

Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glúcidos y

en otro 1 ml de agua destilada. Añada a cada uno 2.5 ml del Reactivo de Bial. Coloque
los tubos en un baño hasta que su contenido comience a hervir. Un color azul verdoso
de considera positivo.
Deje enfriar los tubos y agregue a cada uno 3 ml de alcohol amílico, agite y observe.

Preguntas:

1. Qué tipo de glucidos pueden reconocerse por esta reacción?

2. Explique el fundamento químico de ella.

5. Prueba de Selivanoff:

Coloque en ocho tubos de ensayo 2 ml del Reactivo de Selivanoff. Agregue a cada uno 5
gotas de la solución de cada glúcido y al último agua destilada. Coloque los tubos
durante 1 minuto en agua hirviendo. Un color rojo intenso se considera positivo.

Preguntas:

1. La experiencia qué tipo de glúcidos identifica?

2. Cuál es el fundamento químico de esta prueba?

Preguntas:

1. Qué tratamientos provocaron la hidrólisis de la sacarosa y el almidón?

2. Qué conclusiones pueden sacar de lo observado?

 68

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Preparación de los reactivos:

1. Molisch: 5 g de alfa-naftol en 100 ml de metanol (al usar)

2. Benedict: 1.73 de CuSO4 + 17.3 g de citrato de sodio + 10 g de Na2CO3 anhidro

y disolver a 100 ml con agua destilada.

3. Barfoed: 4.5 g de acetato de cobre + 1 ml de ácido acético al 50 % y disolver a

100 ml con agua destilada.

4. Bial: 100 mg de orcinol + 100 ml de HCl concentrado + 100 mg de cloruro

férrico.

5. Selivanoff: 0.5 g de resorcinol en un litro de HCl 3 N.

 69

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE

AZÚCARES

Sustancia desconocida

Prueba de Molisch

No da coloración Da coloración roja violeta

No es carbohidrato Es un carbohidrato

Lugol

Color azul Incolora Color rojo

Almidón Monosacárido o disacárido Glucógeno o

eritrodextrina

Reactivo de Barfoed

No hay precipitado o Precipitado rojo naranja

éste es muy escaso abundante en 5-7 minutos Precipitado
abundante en
Sacarosa Monosacáridos más de 5-7
minutos
(-) Benedict
Disacáridos
Fermentable
Hiérvase con HCl y aplique la prueba de
Seliwanoff para diferenciar cetosas de aldosas
y la prueba de Bial para diferenciar pentosas
de hexosas
 70

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS
HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

GLÚCIDOS REACTIVOS

MOLISCH BENEDICT BARFOED BIAL SELIVANOFF

AGUA

ALMIDÓN

MALTOSA

LACTOSA

SACAROSA

FRUCTOSA

ARABINOSA

GLUCOSA

DESCONOCIDO

Al analizar la tabla:

A. ¿Cuáles reactivos son generales?__________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________.
________________________________________________________________

________________________________________________________________.
 71

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

B. ¿Cuáles reactivos se consideran específicos? Y para cuáles azúcares?

________________________________________________________________

________________________________________________________________.
________________________________________________________________

________________________________________________________________.
C. Qué otros aspectos desea consignar?
________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________.
________________________________________________________________

________________________________________________________________.

OBSERVACIONES:
________________________________________________________________

________________________________________________________________.
________________________________________________________________

________________________________________________________________.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 65, 66 y 67

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
 72

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
 73

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

PRÁCTICA DE LABORATORIO 7

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS

I ntroducción:
Los lípidos son compuestos insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos.
Generalmente se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza como ésteres de
ácidos grasos de cadena larga.

Desde el punto de vista químico los lípidos pueden dividirse en dos grupos principales:
Simples y Compuestos.

Los esteroides y las vitaminas liposolubles se consideran también lípidos Derivados.

Muchos de estos compuestos son, sin embargo, alcoholes y no ésteres y por lo tanto no
pueden saponificarse.

Objetivos:

1. Determinar la solubilidad de las grasas en diversos solventes.

2. Realizar una saponificación sencilla y determinar algunas propiedades de los

jabones.

3. Establecer la presencia de ácidos grasos libres y de insaturaciones en las

grasas.

4. Realizar una prueba para el reconocimiento de esteroles.

Materiales: Reactivos:
15 tubos de ensayo Papel indicador de pH
1 vaso de 50 ml HCl al 10 %
1 balanza HCl concentrado
1 mechero de gas H2SO4 concentrado
1 espátula Escamas de jabón
Soporte con aro y malla CaCl2 (50 g/ l)
2 gradillas MgCl2 (50 g/ l)
5 pipetas (CH3COO)2Pb (50 g/ l)
1 agitador de vidrio
1 vaso de 250 ml

Otros: Mantequilla, margarina, aceite vegetal, anhídrido acético, etanol 95 %,

cloroformo, éter etílico, benceno, tetracloruro de carbono, ácido esteárico, ácido oleico,
fenolftaleína al 1 % en etanol, acetona, solución de colesterol en cloroformo(0.2 g/ l),
NaOH 0.1 M y soluciones de mantequilla, aceite vegetal y ácido esteárico.
 74

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Procedimiento:

1. Solubilidad:

Numere 10 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, y luego

agregue a cada uno independientemente 1 ml de las siguientes sustancias: agua
destilada, HCl al 10 %, NaOH 0.1 M, etanol frío, etanol caliente, cloroformo, éter etílico,
tetracloruro de carbono, y acetona. Agite cada uno y deje reposar en la gradilla por 5
minutos y observe el grado de solubilidad.

Preguntas:

1. Cuáles son los mejores disolventes para las grasas?

2. Cuáles no disuelven las grasas?
3. Cómo explicarían estos resultados?

2. Emulsificación:

En dos tubos de ensayo coloque 3 ml de aceite vegetal. Añada a cada uno 3 ml de agua
destilada y sólo a uno de los tubos agregue unas escamas de jabón. Agite bien ambos
tubos.

Preguntas:

1. Cómo se denomina la mezcla formada?

2. Cómo está constituida dicha mezcla?

Deje los tubos en reposo y obsérvelos varias veces durante 15 minutos.

1. Notan ustedes cambios en las mezclas?

2. Cómo es la estabilidad de las mezclas en los tubos?
3. Explique los resultados.

3. Saponificación:

Coloque en un vaso en 50 ml, unos 20 ml de agua y sométalos a ebullición(Mantenga el

volumen constante). Cuando esté hirviendo añada 1 ml de ácido oleico. Agregue ahora y
cuidadosamente, gota gota NaOH al 10 %, hasta que el medio sea claro. Tengan
cuidado de no añadir un exceso de álcali.

Preguntas:

1. En que consiste la solución formada?

2. Escriba la ecuación química correspondiente.
 75

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Numere ahora 5 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de la solución anterior y

efectúen las siguientes pruebas:

TUBO 1: Sature la solución con NaCl(sólido)

2: Agregue 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado
3: Agregue 5 gotas de solución de cloruro de magnesio
4: Agregue 5 gotas de solución de cloruro de calcio
5: Agregue 5 gotas de solución de acetato de plomo

Observe y anote los resultados.

Preguntas:

1. Explique lo que ocurre en cada caso.

2. Escriba las reacciones químicas correspondientes.

4. Ácidos grasos libres:

En diferentes tubos de ensayo coloque 1 ml de las soluciones de mantequilla, aceite

vegetal, y ácido esteárico en éter.
En otro tubo de ensayo coloque 10 ml de una solución de fenolftaleina y agregue
cuidadosamente gota a gota a las muestras disueltas en éter, hasta que el color rosado
de la solución de la solución de fenolftaleína no desaparezca, agitando el tubo(Máximo
15 gotas).

Preguntas:

1. Tenga en cuenta el número de gotas usadas en cada caso.

2. Qué explicación pueden dar en cada uno de los ensayos?

5. Prueba para esteroles:

Atención: Los recipientes y sustancias que se utilizan deben estar exentos de agua.

1. Coloque en un tubo de ensayo seco 2 ml de solución de colesterol. Añada 5

gotas de anhídrido y luego 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado.

2. Agite suavemente y deje reposar durante unos 5 minutos.

3. Observe y explique los cambios de color.

 76

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS
HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica)

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Solubilidad
Indique el grado de solubilidad o insolubilidad del aceite en cada uno de los
casos (muy soluble, soluble, poco soluble, insoluble)

HCl 10% Etanol frío

NaOH 0.1M Éter
Agua CCl4
Etanol caliente Acetona

¿Cuáles son los mejores disolventes?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________

2. Emulsificación:
¿Qué observa en ambos medios:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
¿Qué tan estables son las mezclas?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
 77

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

3. Saponificación:
¿Qué observa en cada uno de los tubos después de realizar los ensayos?

a. NaCl _________________________________________________________

________________________________________________________________

b. H2S04
________________________________________________________________

________________________________________________________________

c. MgCl2:
________________________________________________________________

________________________________________________________________

d. Ca Cl2:
________________________________________________________________

________________________________________________________________

e.(CH3C00)2Pb:____________________________________________________

________________________________________________________________

4. Ácidos grasos libres:

¿Cuántas gotas del reactivo NaOH utilizó para neutralizar las muestras?
Mantequilla: ______________ Aceite vegetal___________ ácido esteárico:
____________

¿Cómo interpretan este resultado?

________________________________________________________________

________________________________________________________________

6. Esteroles:
Describan lo que observan:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
 78

Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

1. ¿Qué son los jabones?

2. ¿Cómo se pueden obtener los jabones?

3. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?

4. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos

minutos de reposo?¿Y con la de eter y aceite?¿A qué se deben las
diferencias observadas entre ambas emulsiones?.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 74 y 75

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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Conclusiones:
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4_______________________________________________
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PRÁCTICA DE LABORATORIO 8

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioquímica. Universidad Santiago de Cali. Facultad

de Educación. Química.

TRANSAMINACION

I ntroducción:
La transaminación es una de las reacciones más importantes en el catabolismo y
biosíntesis de los aminoácidos en la célula.
Durante la reacción de transaminación se transfiere el grupo alfa-amino de un
aminoácido al carbono alfa de un alfa-cetoácido, dando como productos un nuevo
aminoácido y un nuevo alfacetoácido.

La reacción de transaminación es catalizada por las enzimas llamadas transaminasas,

que utilizan el piridoxalfosfato como coenzima. Estas enzimas se encuentran en la matriz
citoplasmática y en las mitocondrias de las células de varios tejidos. Por ejemplo, en los
mamíferos las transaminasas son abundantes en el hígado, corazón y riñón,
principalmente.

En esta práctica pretendemos examinar la reacción de transaminación utilizando como

catalizador un extracto enzimático crudo obtenido de tejido cardiaco de ternera.

Objetivos:

1. Obtener un extracto enzimático crudo a partir de corazón de ternera.

2. Utilizar el extracto enzimático para catalizar la reacción de transaminación entre

el aminoácido L-alanina y el alfa-cetoácido alfa-cetoglutarato.

3. Analizar las características de la reacción efectuada mediante la utilización de la

cromatografía de papel.

4. Deducir la importancia de las reacciones de transaminación en el metabolismo

general de las células y los organismos.

Materiales: Reactivos:

10 tubos de ensayo Amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4

2 gradillas Amortiguador de fosfatos M/ 15, pH 7.4
2 tubos de centrífuga plásticos Solvente: Etanol- agua- amoniaco
1 probeta de 100 ml (80- 10- 10 por volumen)
1 vaso de 250 ml Ninhidrina 0.2 % en acetona
4 pipetas de 5 ml Mezcla alanina- alfacetoglutarato
1 pipeta de 1 ml Acido acético al 4 %
1 embudo
papel filtro
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Otros:

1 licuadora, 1 balanza, 1 cuchilla nueva

1 baño de agua a 37º C Plancha de calentamiento
1 tira de papel filtro 1 erlenmeyer de 500 ml con tapón
2 clips 2 tubos capilares
1 secador de pelo 1 estufa a 110º C
1 rociador 1 centrífuga
1 vaso de 500 ml

Procedimiento:

1. Prepación del extracto enzimático:

Pese aproximadamente 30 g de corazón de ternero fresco, córtelo en pedazos pequeños

y colóquelos en la licuadora con 60 ml de amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4.
Homogenice durante unos 3 minutos y luego reparta el volumen en dos tubos de
centrífuga. Centrifugue a 3000 r.p.m. durante 15 minutos. Decante el sobrenadante en
un tubo de ensayo y descártense los sedimientos.

2. Reacción de transaminación:

Prepárese cinco tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones.

Adicionar siempre de último el extracto enzimático.

Tubo # 1 2 3 4 5
Solución
Alanina - cetoglutarato 1 ml 1ml 1ml
Amortiguador M/15 pH 7.4 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Agua destilada 1ml 1ml 1ml
Alanina – acido glutámico 1ml
Äcido glutámico 1ml
Extracto enzimático 1ml 1ml

1. Tan pronto como se hayan mezclado los ingredientes del tubo No 1(control a
tiempo cero), añádale inmediatamente 0.2 ml de ácido acético al 4 %, mezcle
bien y coloque el tubo en un baño de ebullición durante 3 minutos. Deje enfriar y
filtre en un tubo de ensayo. Descarte el residuo.

2. Este será el filtrado libre de proteínas del tubo No. 1. Guárdelo para la
cromatografía.

3. Antes de añadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullición durante 3

minutos. Agregue la enzima y añada 0.5 ml de ácido acético al 4%. Filtre
en un tubo de ensayo y descarte el residuo.
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4. Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un baño de agua

mantenida a 30 – 35ºC terminada la incubación añádase 0.5 ml de ácido
acético 4% y colóquelos en el baño de agua hirviendo por 3 minutos;
luego filtrelos.
5. El tubo # 4 no necesita ningún procedimiento

6. Guarde los diferentes tubos para la cromatografía.

3. Cromatografía de papel:

Coloque la tira de papel para cromatografía sobre una hoja limpia. Maneje el papel solo
por las puntas.

Trace una línea fina con un lápiz de grafito a 2 cm del borde inferior. Marque 5 puntos
sobre la línea, con 2 cm de separación entre ellos.

Utilizando cinco tubitos capilares realice 3 aplicaciones o sobre cada uno de los puntos,
secando la muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto, así (utilice un capilar
diferente para cada muestra):

Terminada la aplicación, enrolle la tira de papel teniendo cuidado de que las muestras
queden afuera y manejando el papel solo por el borde superior. Sujete el borde superior
con un “clip” tratando de formar un cilindro.

Coloque 30 ml del solvente en el erlenmeyer sin humedecer las paredes.

Introduzca el papel enrollado dentro del erlenmeyer, con el borde que contiene las
muestras hacia abajo, en el centro del recipiente evitando el contacto entre el papel y las
paredes del vaso.

Tape el erlenmeyer con el tapón y déjelo quieto hasta que el frente del solvente haya
llegado a 2 cm del borde superior. Cuando esto ocurra, saque el papel con cuidado y
cuélguelo en un sitio ventilado para que se seque. Una vez seco solicite al profesor que
sea rociado con el reactivo de ninhidrina (evite respirar los vapores) y colóquelo en una
estufa a 110º C por 5 minutos.

Observe las manchas de color púrpura que aparecen en el papel. Trace el perímetro de
las manchas con lápiz establezca su Rf.

Preguntas:

1. Identifique las manchas.

2. En cuáles tubos ocurrió la reacción de transaminación?
3. En los que la reacción no se llevó a cabo, porqué sucedió esto?
4. Escriba la reacción de transaminación efectuada.
5. Cuál es la importancia de las reacciones de transaminación en el
metabolismo celular?
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Preparación de los reactivos:

1. Amortiguador de fosfatos:
0.67 g/ 50 ml de NaH2PO4, (Solución A)
3.48g/ 100 ml de Na2HPO4 (Solución B)

pH 7.4 Solución A Solución B Agua destilada

0.01 M 4.75 ml 20.25 ml Llevar a 100 ml

M/ 15 6.33 ml 27 ml Llevar a 200 ml

2. Alfa-cetoglutarato: 0.5 g se neutralizan hasta pH 7 con NaOH 1 N y luego se añaden

0.3 g de L-alanina. El volumen se completa hasta 50 ml con agua destilada.
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TRANSAMINACIÓN
HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (sólo los que han asistido a la práctica)

____________________________________________________________

_____________________________________________________________

1. Qué apariencia tiene el macerado inicial?

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__________________________________________________________________

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2. Cuál es la apariencia y el color del sobrenadante y el precipitado después de la

centrifugación:
__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Reacción de transaminación:

Prepárese cinto tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones.

Adicionar siempre de último el extracto enzimático.

Tubo # 1 2 3 4 5
Solución
Alanina - cetoglutarato 1 ml 1ml 1ml
Amortiguador M/15 pH 7.4 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Agua destilada 1ml 1ml 1ml
Alanina – acido glutámico 1ml
Äcido glutámico 1ml
Extracto enzimático 1ml 1ml
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Antes de añadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullición durante 3 minutos.

Agregue la enzima y añada 0.5 ml de ácido acético al 4%. Filtre en un tubo de
ensayo y descarte el residuo.

3. Observa algún cambio en este tubo en cada procedimiento:

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__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un baño de agua

mantenida a 30 – 35ºC terminada la incubación añádase 0.5 ml de ácido acético
4% y colóquelos en el baño de agua hirviendo por 3 minutos; luego filtrelos. El
tubo # 4 no necesita filtración.

4. Qué observa después de agregar el ácido acético y colocar en ebullición durante

3 minutos:
__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

5. De que color queda el extracto después de filtrarlo:

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__________________________________________________________________

Efectúe la cromatografía de las soluciones de los 5 tubos.

Realice un esquema del cromatograma, después de haber sido revelado con la

nihidrina (Adhieran al informe el cromatograma realizado?
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1 2 3 4 5

6. Calculen los Rf para cada uno de los aminoácidos.

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

7. Qué concluyen con respecto a lo observado en esta práctica:

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8. Qué otros aspectos desean destacar de la práctica realizada.

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__________________________________________________________________

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta práctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la página 74 y 75

Haga una breve discusión y conclusión de sus resultados.

Discusión:
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Conclusiones:
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1_______________________________________________
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2_______________________________________________
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3_______________________________________________
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4_______________________________________________
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FUE UN PLACER HABER TRABAJADO CON USTEDES. LES DESEO

MUCHOS ÉXITOS EN ESTA CARRERA. .
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Guía de Laboratorio de Bioquímica General L.D. Caicedo

Bibliografía:

1. Mulett, J., 1980. Curso de Biología Celular, UNIVALLE. Cali

2. Williams, B.L. y K. Wilson, 1981. Principios y técnicas de Bioquímica

experimental, Omega, Barcelona. Pag. 137-155.

3. Freifelder, D., 1979. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular,

Reverté, Barcelona, Pag. 421-450.
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ANEXOS

MÉTODO DE LOWRY PARA DETERMINAR CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNAS

T iempo requerido: 40 minutos

Rango de sensibilidad: 5g/ml - 100g/ml

MATERIALES:
Espectrofótometro
Cubetas
Pipetas
Pipetas Pasteur
Tubos (3-5 ml capacidad)
Gradillas
Vortex

REACTIVOS:
CuSO4.5H2O
Na3C6H5O7(2H2O) (Cítrato de sodio)
Na2CO3
NaOH
Reactivo de Folin-Ciocalteu

PROTOCOLO:

Solución A: 100 ml
0.5 g CuSO4
1 g Na3C6H5O7(2H2O) (Cítrato de sodio)
Adicionar agua destilada hasta completar 100 ml
Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida.

Solución B: 1000 ml
20 g de Na2CO3
4 g de NaOHAdicionar agua destilada hasta completar 1000 ml
Esta solución puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida

Solución C: 51 ml
1 ml de la solución A
50 ml de la solución B

Solución D: 20 ml
10 ml Folin-Ciocalteu phenol
10 ml de agua destilada
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PROCEDIMIENTO:
1. Lleve la solución de la muestra a 0.5 ml con agua destilada
2. Adicione 2.5 ml de la solución C
3. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 5 – 10 minutos
4. Adicione 0.25 ml de la solución D y mezcle.
5. Después de 20 – 30 minutos lea A750.
6. Realice la curva de calibración con concentraciones conocidas de una proteína.
7. Determine la concentración de su muestra problema

Pasos adicionales para purificar las proteínas cuando existen sustancias interferentes.

Precipitación con Deoxychocolate- ácido tricloroacético

También permite determinar la concentración de proteínas en soluciones diluidas
(< 1 g/ml)
Reactivos: 0.15% de deoxichocolate (DOC) y 72% de ácido tricloroacético (TCA)

1. A 1ml de la muestra de proteína añada 0.15% de DOC

2. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 10 minutos
3. Agregue 0.1 ml de 72% TCA, mezcle y centrifuque por 5 – 30 minutos a
100-3000 xg.
4. Decante inmediatamente y remueva el precipitado con una pipeta.
5. redisuelva el precipitado directamente en la solución C
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PREPARACIÓN DE SOLUCION BUFFER FÓSFATO EN

DIFERENTES PH

Solución stock A: (0.2 M NaH2PO4) Disolver 27.6 g NaH2PO4 llevar a 1 L con agua
destilada.

Solución stock B: (Na2HPO4) Disolver 28.4g de Na2HPO4 y llevar a 1 L con agua

destilada.

PH %A %B PH %A %B

5.8 92.0 8.0 6.9 45.0 55.0

5.9 90.0 10.0 7.0 39.0 61.0
6.0 87.7 12.3 7.1 33.0 67.0
6.1 85.0 15.0 7.2 28.0 72.0
6.2 81.5 19.5 7.3 23.0 77.0
6.3 77.5 22.5 7.4 19.0 81.0
6.4 73.5 26.5 7.5 16.0 84.0
6.5 68.5 31.5 7.6 13.0 87.0
6.6 62.5 37.5 7.7 10.5 89.5
6.7 56.5 43.5 7.8 8.5 91.5
6.8 51.0 49.0
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