Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores

Cuautitlán - Campo 4

Medicina Veterinaria y Zootecnia

Bioquímica

Práctica 3. Separación e identificación de

aminoácidos por cromatografía en papel.
Profesor titular:
● M. V. Z. Ranulfo Reyes Gama
Profesores de Laboratorio:
● M. V. Z. Francisco Javier Cervantes Aguilar
● M. en C. María del Carmen Barrón García

Equipo 5:
● Flores González Andrea
● Lara Martínez Ximena
● Martínez Arzola Mariana
● Reyes Serrano Itzel
● Rubí López Jessica Ariadna
● Sánchez Ortiz José Alberto

Grupo: 1103

Fecha de entrega: 30 de Septiembre de 2016

ÍNDICE

Resumen . . . . . . . . . . .3
Introducción . . . . . . . . . . .3
Objetivos . . . . . . . . . . .4
Material . . . . . . . . . . .4
Metodología . . . . . . . . . . .4
Resultados . . . . . . . . . . .5
Discusión . . . . . . . . . . .6
Conclusión . . . . . . . . . . .7
Recomendaciones y sugerencias . . . . . . . .7
Bibliografía . . . . . . . . . . .7
RESUMEN
Al realizar esta práctica se tuvieron que seguir ciertos pasos y objetivos que a
continuación se mencionan, como: colocar con un capilar una pequeña muestra de
las soluciones en cierto orden, una vez que se secó la primera aplicación, fue
conveniente realizar una segunda aplicación para que se observarán mejor los
resultados, los reactivos y soluciones tuvieron que manejarse de forma correcta,
cuidando no cometer ningún error ya que podía haber variaciones.

Se realizaron los cálculos necesarios para obtener la distancia recorrida por un

compuesto y la distancia recorrida por un compuesto problema.
Se identificaron exitosamente los aminoácidos presentes en la mezcla.
Al final logramos cumplir con los objetivos.

INTRODUCCIÓN
El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos,
proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y
purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier
material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para
dicho fin es la cromatografía.
La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico
cualitativo, permite llevar a cabo la separación e identificación de iones, trabajando
con cantidades mínimas de sustancia. Pertenece al tipo de “Cromatografía de
partición” se fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes
coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece
fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil
constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en
ella.

Los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos se basan en la

reacción específica de éstos con determinados compuestos, dando derivados
coloreados. La formación de color se toma como resultado positivo e indica su
presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no está
presente. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también denominado
blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente
adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo la determinación
cualitativa de aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las
reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación
cuantitativa de dichas biomoléculas.
OBJETIVOS
● Conocer el principio de separación por cromatografía en papel y a través de
​

ello, comprender su importancia al ser empleada como técnica de separación

de moléculas, tales como los aminoácidos.
● Realizar la separación de aminoácidos por cromatografía en papel e
identificar los aminoácidos presentes en una mezcla a través de aminoácidos
patrón.

MATERIAL
Material: Reactivos y soluciones:
1 piezas de papel Whatman no. 3 Solución de fenilalanina 1%
(10x8 cm) Solución de leucina 1%
1 cámara cromatográfica Solución de prolina 1%
6 tubos capilares Solución de glicina 1%
1 parrilla electrica3 Solución de histidina 1%
Solución de ninhidrina 0.5%
Material que debería traer cada Eluyente: v/v/v/v
equipo: Butanol/acetona/acido acético/agua
Regla y lápiz 7.0/7.0/1.5/4.5
2 pinzas de disección sin dientes de
ratón Muestra biológica:
1 par de guantes de látex Mezcla de aminoácidos
Cubre bocas por cada integrante

METODOLOGÍA
1. Sujete el papel de cromatografía (cromatograma) por los bordes, pues
las yemas dedos no deben tener contacto con la superficie del mismo.
2. A 0.5 cm del extremo inferior del cromatograma, marque, con lápiz,
seis cruces muy finas y muy bien distribuidas a lo largo de los 10 cm
de este, las cuales indicarán la posición respectiva de cada
aminoácido y la mezcla.
3. Coloque con un capilar, en el centro de la primera cruz una pequeña
muestra del aminoácido Histidina, en la segunda la fenilalanina, en la
tercera la prolina, en la cuarta la glicina y, en la quinta la leucina (estos
cinco aminoácidos serán los aminoácidos patrón). En la sexta, se
coloca la muestra de aminoácidos problema, tal como se ilustra en la
figura.

Distribución de los aminoácidos en el cromatrograma.

 4. Una vez que se hayan secado las aplicaciones, es conveniente
realizar una segunda en el mismo orden.
5. Proceda a colocar el cromatograma dentro de la cámara de
cromatografía la cuan habrá sido previamente preparada ​con el
eluyente saturado dentro de las 24 horas anteriores a su uso. Al
momento de colocar el papel dentro de la cámara, deberá tener
cuidado de que no se rebase el nivel de aplicación de las muestras,
antes de empezar a ascender por capilaridad.
6. Cierre la cámara y deje desarrollar el corrimiento cromatográfico hasta
que el eluyente haya llegado aproximadamente 0.5 cm del borde
superior.
7. Retire el cromatograma de la cámara y seque por el calentamiento en
la parrilla, evitando quemar el papel. puede auxiliarse de las pinzas de
disección sin dientes de ratón para el manejo de este,
8. Una vez seco el cromatrograma, rocié sobre este la solución de
anhidrina, misma que estará dentro de un frasco aspersor.
9. Seque nuevamente el cromatograma, sin pegar a la parrilla, hasta que
se hagan visibles las manchas de los aminoácidos.
10. Marque los bordes de cada una de las manchas para medir
la distancia recorrida y calcule los factores de recorrimiento de los
aminoácidos.

RESULTADOS
Distancia recorrida
Aminacido Histidina Fenilalanina Prolina Glicina Leucina Mezcla

Medida 2.3 3.8 3.1 2.1 3.2 2.1*

 3.5**

5.4***

Factores de recorrimiento de los aminoácidos:

Rf = distancia recorrida por un compuesto problema/distancia recorrida por un compuesto patrón

Histidina 0.37

Fenilalanina 0.60

Prolina 0.49

Glicina 0.33

Leucina 0.51

Rx = distancia recorrida por un compuesto/distancia recorrida por un eluyente

Histidina Fenilalanina Prolina Glicina Leucina

* 0.91 0.55 0.68 1 0.66

** 1.52 0.92 1.13 1.67 1.09

*** 2.35 1.42 1.74 2.57 1.69

DISCUSIÓN
Esta técnica todavía encuentra aplicación en la separación de aminoácidos. Las
muestras se aplican en un punto marcado aprox. A 5 cm del extremo de una tira de
papel filtro, y ésta se suspende en un recipiente sellado que contiene el solvente
cromatográfico (para aminoácidos son mezclas de agua, alcoholes y ácidos o
bases, constituyendo la fase móvil). La fase móvil asciende por capilaridad. Cuando
ha avanzado hasta el otro extremo, la tira se seca y se trata para permitir la
visualización de las moléculas de interés (ej.: para a.a. se trata con ninhidrina al
0.5% en acetona, seguida de calentamiento de 90-100° C durante unos minutos).
Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ileu, Fen, Trip,
Val, Met, Tir) migran más que que aquellos con cadenas laterales más cortas no
polares (Pro, Ala, Gli) o con cadenas laterales polares (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His,
Lis, Cis). Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en la
fase estacionaria hidrofílica, y de las moléculas no polares en solventes orgánicos.
La relación entre la distancia recorrida por un aminoácidos con la distancia que viaja
el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicación de la mezcla
de aminoácidos, se asigna como valor Rf (movilidad relativa con el sustrato) de ese
aminoácidos. La movilidad puede expresarse en relación a la de un estándar.
CONCLUSIÓN
Se lograron cumplir los objetivos, reconocemos la importancia que tiene la
cromatografía que es empleada como método para la separación de moléculas.
Identificamos los aminoácidos presentes en la mezcla gracias a la cromatografía en
papel y con ayuda de las medidas de las soluciones obtenidas, concluimos que
nuestra mezcla de aminoácidos estaba compuesta por solución de Fenilalanina,
Leucina y prolina.

RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS
Se deberá manejar correctamente el papel Whatman, con guantes o pinzas para no
dañarlo.
Manejar con cuidado los tubos capilares, evitando mezclar las soluciones.
Tener precaución al momento de secar el papel en la parrilla ya que podría
quemarse, afectando los resultados.

BIBLIOGRAFÍA
➔ Manual de pràcticas de Bioquímica para la carrera de MVZ. FES Cuautitlán,
UNAM, México