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Laboratorio N°7 Extracción de ADN (sangre)
Álvarez Miranda Daniel
Granda Valencia Daniela
Tocarruncho Villarreal Lloyd
Vélez López Daniela
Facultad de ciencias básicas, programa de biología, Universidad de Córdoba
Laboratorio de biología molecular
Álvaro Lorduy Rodríguez
28 de enero de 2022
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Resumen
El ADN es la molécula fundamental de la vida, su función es almacenar el código genético
que determina todas las características individuales de las personas. La sangre puede ser
utilizada para la extracción de ADN, debido a que es una fuente excelente de información
genética. Es importante desarrollar de forma correcta los pasos presentes en las
recomendaciones proporcionadas por el docente para su correcta extracción. Para ello, se
depositó una solución de lisis celular en un tubo eppendorf y se mezcló con la sangre por
inversión y se mantuvo a temperatura ambiente. Luego se centrifugó y se descartó el
sobrenadante. Luego se agregó una solución de lisis nuclear por inversión junto con una
solución de precipitado de proteínas, se centrifugó y se mezcló en un tubo con isopropanol.
Se centrifugó nuevamente para descartar el sobrenadante y se procede a disolver con el etanol
y se añade al ADN por rehidratación y se introdujo en el congelador. Se observaron dos fases,
una precipitada en donde se encuentra el ADN y la segunda fase se encuentra en el
sobrenadante que es la solución de rehidratación del ADN.
Palabras claves: ADN, extracción, sangre.
Abstract
DNA is the fundamental molecule of life; its function is to store the genetic code that
determines all the individual characteristics of people. Blood can be used for DNA extraction
because it is an excellent source of genetic information. It is important to correctly develop
the steps present in the recommendations provided by the teacher for its correct extraction.
For this, a cell lysis solution was placed in an eppendorf tube and mixed with the blood by
inversion and kept at room temperature. It was then centrifuged and the supernatant was
discarded. Nuclear inversion lysis solution was then added along with protein precipitate
solution, centrifuged and mixed in a tube with isopropanol. It was centrifuged again to
discard the supernatant and proceeded to dissolve with ethanol and added to the DNA by
rehydration and placed in the freezer. Two phases were observed, one precipitated where the
DNA is found and the second phase is found in the supernatant, which is the DNA
rehydration solution.
Key words: DNA, extraction, blood.
Introducción
La extracción no es más que el método por el cual se obtiene el ADN a partir de material
biológico, por ejemplo, el cepillado bucal, saliva, sangre o cualquier tejido; utilizando
técnicas físicas y químicas. Por lo tanto, la extracción consiste en la separación y purificación
del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo (Checa, 2016). Cabe
destacar que este tipo de método es de suma importancia en las diferentes disciplinas tales
como la medicina forense, diagnóstico genotípico en biomedicina, entre otras; en la
investigación biomédica, dado que el ADN se utiliza para analizar y diagnosticar a pacientes
con enfermedades neurodegenerativas, cáncer, infecciones, etc (Osorio & Quenán, 2013).
Por esta razón, se puede decir que la biología molecular es una de las herramientas más útiles
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de las que se vale hoy en día la ciencia. Dado que, la obtención de ácido desoxirribonucleico
(ADN), es el punto de partida para la mayoría de análisis genéticos.
Metodología
EXTRACCIÓN DE ADN (SANGRE)
Se tomaron 900 μI de solución de lisis celular y se depositaron en un tubo
eppendorf, luego se agregaron 300 μI de sangre y se mezcló suavemente por
inversión.
Se mantuvo durante 3 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 13000 por
un minuto a 20ºC. Se descartó el sobrenadante y se llevo al vortex por 30
segundos.
Se agregaron 300 μI de solución de lisis nuclear y se mezcló suavemente por
inversión. Se agregaron 100 μI de solución de precipitación de proteínas y se llevó
al vortex por 20 segundos.
Se centrifugó a 13000 por 4 min a 20ºC y se pasó el sobrenadante a un tubo con
300 μI de isopropanol, luego se mezcló.
Se centrifugó a 13000 por 2 minutos a 20ºC y se descartó el sobrenadante. Se
agregaron 30 μI de etanol al 70 % , se mezcló y se centrifugó a 13000 por 2
minutos a 20ºC.
Se descartó el etanol y se añadió al ADN 100 μI de solución de rehidratación,
luego se metió al congelador a 4ºC.
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Resultados
Como resultado se evidenciaron dos fases, en el fondo del tubo eppendort se evidencian los
fragmentos de ADN provenientes del material biológico; ADN de los leucocitos (células
blancas) con un aspecto un tanto fibroso de color blanco. En la segunda fase que corresponde
al sobrenadante se encuentra la solución de rehidratación, al haber agregado esta solución al
precipitado donde se localiza el ADN purificado le brinda una capacidad para conservarse en
este caso a una temperatura de 4°C.
Análisis de resultados
Para llevar a cabo esta extracción, fue necesario el aislamiento y purificación del ADN
gracias a las características fisicoquímicas de la molécula, cumpliendo con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de
inhibidores que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Al utilizar el kit comercial
hay diferencias con el método casero. En ocasiones el material obtenido con el método casero
puede estar fragmentado. Este método es susceptible de contaminación, variación y errores
por los múltiples pasos de manipulación, pero al tener en cuenta el costo, este es muy bajo
ya que los materiales son más sencillos. Por el contrario, con un kit comercial se garantiza la
obtención de resultados confiables, aunque cueste más dinero. Independientemente del
método de extracción que se utilice, lo importante es realizar cada paso con cuidado para
obtener ADN íntegro y puro que permita llevar a cabo las técnicas posteriores. En general,
estos métodos constan de cinco etapas principales: lisis celular, separación de proteínas y
lípidos, y precipitación del ADN. Durante el proceso de lisis las interacciones entre las
moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen
permitiendo que los ácidos nucleícos se liberen. En nuestro caso, la Cell Lysis Solution
(solución de lisis celular) fue la que actuó en la célula y luego la Nuclear Lysis Solution
(solución de lisis nuclear) en los núcleos celulares. Posteriormente, hay una separación del
ADN de las proteínas y lípidos debido a la Protein Precipitation Solution (solución de
precipitación de proteínas) y los ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia
hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las
proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se
separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN. Después de que son eliminados los
lípidos y las proteínas, se precipita el ADN. Para ello, generalmente se adiciona etanol y
soluciones con altas concentraciones de iones que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla
reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí
mismo haciéndolo insoluble. La posterior centrifugación permite que el ADN permanezca
en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan
con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación. Por último, la
DNA Rehydration Solution (solución de rehidratación de ADN) permite la conservación del
ADN cuando se guarde la muestra (Alejos [Link]., 2014).
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Conclusión
Se logró obtener el ADN de sangre humana por medio del kit promega wizard, debido a que
este nos proporciona una alta pureza del ADN y puede utilizarse con una amplia gama de
tipos de muestras. También podemos agregar que gracias a la correcta realización de los
pasos propuestos en la guía de laboratorio, el proceso se llevó a cabo de manera correcta,
sencilla y rápida, con un satisfactorio resultado en el que se observa el ADN. En cuanto a los
reactivos, estos nos proporcionan una mejor eficacia en el proceso de extracción. En el caso
del etanol, fue muy útil porque es utilizado para concentrar ADN y el isopropanol cumple la
función de precipitarlo. En el caso de la lisis nuclear y celular, son fundamentales para romper
las membranas y así liberar los componentes celulares. Todo esto se logra con una eficaz
manipulación de los instrumentos y reactivos para obtener unos buenos resultados y así poder
extraer de forma correcta el ADN
Preguntas complementarias
1. ¿Cuál es la fuente de ADN en la sangre?
La fuente de ADN de la sangre es cada célula que se encuentra en ella es decir las células
blancas.
2. ¿Porque es importante la purificación de DNA?
Es de suma importancia debido a que se necesita partir de un ADN de excelente calidad
(ADN no degradado y de alta pureza) para estudios posteriores.
3. ¿Cuáles son los métodos existentes para la purificación de ADN, explique en que
consiste cada uno de ellos?
Incubación del lisado para su uso: Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar
el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que
mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy
reducidas.
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos: Si se opta por realizar
el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad
de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que este debe bastar para
lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método
puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede
romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos.
Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB: Este es un
procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico puede
romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos
no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de
bacterias y otros tipos de organismos.
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Método de salting-out: A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de
proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal
que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.
Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio: El ADN genómico
puede ser purificado por centrifugación selectiva a través de la generación de gradientes de
cloruro de cesio. Primeramente se lleva a cabo el lisado celular por métodos mecánicos o
químicos y la mezcla es centrifugada durante varias horas en presencia de bromuro de etidio.
Como hay bromuro de etidio en el medio, se pueden visualizar las diferentes capas en las que
se agrupan los ácidos nucleicos según su densidad con luz ultravioleta. Se obtienen varias
capas que pueden separarse y recuperar el ADN purificado. Este método a pesar de dar como
resultado un ADN de alta calidad tiene una serie de desventajas: es largo, imposible de
automatizar, caro, requiere una ultracentrífuga y usa compuestos químicos tóxicos.
Referencias bibliográficas
Alejos, L. Aragón, M. Cornejo, A. (2014). Extracción y purificación de ADN. Herramientas
moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos. Vol. 1.
[Link]
Checa, A. (2016). Extracción de ADN. [Link]
Osorio, J & Quenán, Y, (2013). MODIFICACIÓN DE UNA TÉCNICA PARA EXTRACCIÓN
DE ADN DE GLÓBULOS BLANCOS HUMANOS.
[Link]
