TRANSCRIPTÓMICA Y MANEJO

DEL RNA

Dr. Sergio Wehinger

Agosto, 2016
Flujo de la Información Biológica

Retro-transcripción
transcripción
(retrovirus)

RNA polimerasas
RNA-dependientes
Traducción
Transcriptoma: Conjunto de los perfiles de
transcripción de todos los genes de un
genoma
Genoma: “Estático” en cuanto a su secuencia, único
en un momento dado. Cambia lentamente en el
tiempo (mutaciones, evolución). Puede modificar
su “actividad” por cambios epigenéticos.

Transcriptoma: Dinámico, cambio constante, muy

dependiente de las condiciones, específico para
cada célula en un momento dado.
 Estructura Secundaria

ARNt
“Hairpin “
Ej: shRNA,
Regiones de término de la transcripción

“Bugle” “Internal Loops”

Estructura Terciaria

“Pseudoknot”
Ej: regiones reguladoras de retrovirus

RNAt
Técnicas de estudio de la transcripción:
• Northen Blot
• RT-PCR
• qPCR
• Librerías de cDNAS (transcriptomas)
• Uso de ESTs
• RAGE
• Microarrays
Manipulación de la transcripción:
• RNA antisentido
• siRNA
Las razones 260/280 y 260/230 nm
Para cuantificar ADN o ARN, se necesita contar con un espectofotómetro que
permita leer en luz U.V. a 260 y 280 nm.

A 260 nm, se produce el máximo de absorción. A 280 nm,

absorben las proteínas (contaminantes).
La razón abs260/abs280 debe oscilar idealmente entre 1,80-
2,00. La composición de la secuencia del ácido nucleico,
hace variar estos valores.
Ácido Nucleico Proteína 260/280 260/280
(%) (%) Ratio ADN Ratio ARN Guanine: 1,15
100 0 1,8 2.00
95 5 1.79 1.99
Adenine: 4,50
90 10 1.78 1.98 Cytosine: 1,51
70 30 1.74 1.94
Uracil: 4,00
10 90 1.32 1.32
5 95 1.06 1.06 Thymine: 1,47
0 100 0.57 0.57

Debido a que 1 unidad de absorbancia corresponde a 40 μg/ml de ARN, la cantidad de

ARN en una muestra se puede calcular con la siguiente fórmula:
ARN (μg/ml)= Abs260 x 40 μg/ml x dilución
 Las razones 260/280 y 260/230 nm
También se utiliza la razón 260/230, para determinar la pureza del ácido nucleico
respecto a contaminantes que absorban a 230 nm (carbohidratos, fenoles, TRIzol,
EDTA).
El ideal es una razón de 2 a
2,2 para el ADN y ARN

ADN TRIzol

Medios ácidos subestiman la lectura de la razón 260/280 (0,2 a 0,3) mientras que los medios
alcalinos la sobreestiman (0,2 a 0,3)
 Ejemplo

Northern blot analysis of agouti expression in BAPa20 and alb-agouti 86 transgenic mice. A Northern blot containing ~2.5
μg of poly (A)+ RNA per lane was hybridized with a radiolabeled agouti cDNA probe. The blot was stripped and rehybridized
with a radiolabeled glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapd) cDNA probe to control for mRNA loading and
quality. The agouti gene is expressed only in the skin of wild-type mice [2]. Therefore, the agouti mRNA detected in these
BAPa20 and alb-agouti 86 tissues is transgene-specific.
Kuklin et al. Molecular Cancer 2004 3:17 doi:10.1186/1476-4598-3-17
 RT-PCR
Retrotranscripción

Cuando se
retrotranscribe una
secuencia génica
eucariótica, el resultado
es un cDNA, el cual no
contiene Intrones
cDNA
 Retrotranscriptasas comúnmente
utilizadas

• M-MLV: virus de leucemia murina

• AMV: virus de la mieloblastosis aviar
• rTth: enzima de Thermus thermophilus
 M-MLV
• Genera cDNA a partir de RNA, DNA o RNA/DNA
• Primers: RNA de hebra simple (ss), híbridos DNA/RNA
• Requiere magnesio
• Gen pol del virus de la leucemia murina
• Muy baja actividad RNAsa H, ideal para fragmentos de
RNA largos (>5kb)
• Puede trabajar óptimamente a 37°C
• Es capaz de sintetizar la segunda cadena de cDNA, pero
normalmente esto no se usa
• Se inhibe con actinomicina D
 AMV
• Genera cDNA a partir de RNA, DNA o
RNA/DNA
• Primers: DNA preferentemente
• Requiere magnesio o manganeso
• Trabaja mejor a elevadas temperaturas (75°C)
• Actividad RNAsa (aunque débil)
• No es capaz de sintetizar DNA a partir de
cDNA
 rTth DNA pol
• Se expresa en forma recombinante en E. coli
• Origen: Thermus termophylus HB-8
• Requiere Mg y Mn
• Trabaja entre 60-70°C
• Posee tanto actividad de transcriptasa reversa como de
DNA pol 5’3´ y exonucleasa 5´3´
• Es capaz de realizar la retrotranscripción y la
amplificación en un solo paso
• Menor tasa de error (1/10 kb)que la Taq (1/6Kb)
• Más eficiente en desnaturalizar estructuras secundarias
del RNA, respecto de AMV y M-MLV
 Corrida de un PCR en gel de
agarosa al 1%
Marcador
de PM
Carril de muestras

Fragmento
amplificado
 Aplicaciones del RT-PCR

• Niveles de RNA (semicuantitativo)

• Bibliotecas de cDNAs
• Detección de carga viral: VIH, hepatitis, etc.
 plateau

exponencial

inicial

Ctct1
1 ct2
Ct2 Ctct3
3
1-Eliminar las desviaciones (outliers)
Ct: M1 M1 M1 M2 M2 M2
23 32 24 27 25 26
2-Promedio de las réplicas para cada muestra tanto para el gen endógeno (gen
constitutivo: GAPDH, rRNA 18S, etc.), como para el gen estudiado.
Ct prom : M1: 23,5 M2: 26

3-Diferencia entre Gen estudiado y gen endógeno: ∆Ct

∆Ct = Ct(gen estudiado) – Ct(gen endógeno)

4-Cáclulo del ∆∆Ct entre el control y la prueba

∆∆Ct = ∆Ct muestra1(control) - ∆Ct muestra2 (experimental)

5-Cálculo del cambio (Fold change)

2 -∆∆Ct
Si se usa una curva de calibración: 10 -∆∆Ct/m donde m es la pendiente de la curva
Cálculo del “fold change” con ΔCt usando un gen de referencia
Se estudió la transcripción del gen de la proteína survivina por qPCR frente a un
fármaco, utilizando GAPDH como gen de referencia y se obtuvo lo siguiente:

Gen survivina condición control Gen survivina con fármaco

Ct1: 23 Ct2: 26 Ct3: 28 Ct1: 26 Ct2: 27 Ct3 25

Gen de referencia condición control Gen de referencia con fármaco

Ct1: 12 Ct2: 15 Ct: 16 Ct1: 11 Ct2: 12 Ct3: 14

Calcular el “fold change”

 •Cálculo del ΔCt:
ΔCt exp= (Ctexp target – Ctexp ref)

ΔCt exp= (26 – 12,3)

ΔCtexp = 13,7 Survivin Transcription

6

Fold over change

ΔCt control = (25,6-14,3) 5
4
ΔCt control = 11,3 3
2
•Cálculo del ΔΔCt 1
0
ΔΔCt = (ΔCt control-ΔCtexp) Control Drug

ΔΔCt =-2,4
•Cálculo del “fold change”

2 –ΔΔCt = 2 2,4 = 5,3

Conclusión: el fármaco induce un aumento en la transcripción en 5,3 veces con respecto a la

situación control.
 Generación de una
Librería de cDNA

Sergio W. 2012
Expressed Sequence Tag EST
Son secuencias cortas dentro de un
cDNA. Son útiles en la identificación
de transcritos, secuencia de genes y
para identificar la regulación
transcripcional de la expresión de
proteínas. Son especialmente
utilizados para identificar transcritos
desde una Librería de cDNAs
Existen millones de ESTs
identificados y almacenados en
bases de datos (ej: GeneBank:
dbEST)

Como se obtienen a partir de la

secuenciación e identificación de
una librería de cDNAs, su tamaño
está limitado por el máximo
permitido por los vectores
(plasmidios o fagos ), unas 800
bases.
 EST y STSs
Los 5´-ESTs son más conservados que los 3´-ESTs, ya que estos últimos son ricos en
UTRs (regiones no traducibles) pueden ser utilizados como STSs (Sequence Tagged
Sites: 200 a 500 pb únicas en un genoma), dado que contiene secuencias únicas en
todo el genoma.

Estos STS son muy útiles cuando se requiere amplificar regiones específicas del
genoma (uso de primers) y sus polimorfismos sirven para la identificación de
individuos por la prueba del ADN o para identificar alelos asociados a enfermedades
genéticas o de predisposición genética.

Entonces, los ESTs permiten:

•Identificar genes que se transcriben
•Mapear el genoma (como STSs)
• Identificar transcritos desde una librería de cDNAs
•Ser utilizados como sondas en un microarray
 SAGE
Serial Analysis of Gene Expression

•Surge de la necesidad de
caracterizar e identificar
transcriptomas de una manera más
sencilla que secuenciar cada EST
•SAGE se basa en la identificación de
cDNAs con sólo secuencias de 12pb
•Utiliza enzimas de restricción de
anclaje (AE) con sitios de corte muy
comunes en los RNAm (Ej: Alu I y
BamFI) y una Tagged Enzyme (TE:
BmsFI) que corta los fragmentos
unidos al TAG.
•Los fragmentos de cDNA
resultantes (12 pb) pueden ser
ligados, concatenados y
secuenciados
Serial Analysis of Gene
Expression

•Cada fragmento representa un

RNAm, de tal manera que su
abundancia en las secuencias
concatenadas (contigs),
permitirán determinar la
transcripción diferencial de esos
genes.
•Es más sensible que un Array,
pero menos específico (y más
caro)
•Si dos o más genes comparten
regiones 3´similares,
compartirán el mismo TAG
•Si un gen presenta slicing
alternativo en su eRNa a nivel
del 3´, podría dar lugar a 2 TAGs
distintos
•Permiten el estudio de la
transcripción de una enorme
cantidad de genes en distintas
condiciones experimentales
•Constan de un soporte sólido
(nylon, cristal, silicio, etc.) que
contiene pocillos (puntos) con
monohebras de ADN conocidas
inmovilizadas
•Las muestras con ARNm se marcan
con un fluorocromo rojo o verde
(según la condición) y se exponen
equivalentemente al ADN de cada
pocillo
•Según los ARNm marcados
(dianas) de las muestras hibriden o
no con los ADN (sondas), se
obtendrá un color que dependerá
de la abundancia de los ARNm de
una u otra condición
•Con esta tecnología, se puede
hacer un “screening” de los genes
que podrían tener implicancia en
un proceso específico
•Las sondas de ADN no deben
auto-hibridar y ser altamente
específicas para cada hibridar con
un ARN particular
•Se pueden estudiar genes que
son co-regulados, lo que permite
su asociación funcional
•Esta técnica requiere de un largo
proceso de análisis
computacionales estadísticos, ya
que es propensa a los falsos
positivos.
 Estudios Genómicos

Método Cobertura Cuantificación Sensibilidad Especificidad Detección de

nuevos
genes
Análisis de Baja Alta Baja Alta Muy buena
EST
SAGE Amplia Alta y absoluta Alta Moderada Alta
Microarray Amplia Semi Baja Alta No
 iRNA
•En 1990, se descubrió al querer
sobre-expresar el gen de la Chalcona
sintasa en petunias se obtenía el
efecto opuesto: co-supresión

•En 1992 se observó algo similar en

Neurospora crassa: quelling

•Andrew Fire y Craif Mello en

Caenorhabditis elegans : fenómeno
específico: iRNA. Nobel de Medicina
en 2006

•Descrito in vitro en D. melanogaster

 siRNA
• Tamaño: 21 a 25 pb con un par de nucleótidos
desapareados en los extremos
• Surgen del procesamiento de Dicer (familia RNAsa tipo
III) sobre dsRNA
• Los dsRNA en vertebrados no debe ser superior a las 30
pb
• Son tomados por RISC para la degradación del RNAm,
con un apareamiento casi perfecto
• En plantas pueden ir al núcleo e inhibir la síntesis de
mRNA específicos ( en vertebrados no)
• Pueden ser transmitidos desde la célula madre a la hija
(no en vertebrados)
 miRNA
• Son generados a partir del pri-miRNA y pre-
miRNA (70 a 100 nucleótidos) nucleares
• Dicer genera microRNA (21-24 nucleótidos) a
partir de pre-miRNA translocados por Exportina-5
• A diferencia de siRNA, los miRNA poseen
burbujas y “missmatches”
• En animales, los miRNA generan silenciamiento
por inhibición de la traducción más que por
degradación del mRNA, ya que apareamiento
mRNA/microRNA no es perfecto
• En plantas el apareamiento es perfecto y ocurre
degradación
 Significado biológico del sistema de
silenciamiento génico
• 0,5 a 1% de los genes corresponden a genes
codificantes para miRNA (200 a 255 genes en
humanos)
• El 30% muestra secuencias altamente
conservadas
• Sería un importante mecanismo defensivo contra
la infección de virus y actividad de elementos
transponibles
• Además, el knock-out de genes para Dicer en A.
thaliana, C. elegans y ratones, produce graves
defectos en el desarrollo
Fin