UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

Facultad de Medicina. Enfermería, Nutrición y Tecnología Médica

BIBLIOTECA DE MEDICINA
TOMO!

Editor Científico
Dr. Buddy Lazo de la Vega
Editor Científico Asociado
Dr. Eduardo Arando

BACTERIOLOGIA BASICA

DR. CHRISTIAN TRIGOSO A.

Colabciradores
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
FACULTAD DE MEDICINA, ENFERMERIA,
NUTRICION Y TECNOLOGIA MEDICA

BIBLIOTECA DE MEDICINA
Editor Científico:
Dr. Buddy Lazo de la Vega
Decano de la Facultad de Medicina de la UMSA

Editor Científico asociado:

Dr. Eduardo Aranda
Jefe de la División de Investigación y
Post Grado Facultad de Medicina de la UMSA

TOMOl
SEGUNDA EDICION

BACTERIOLOGIA BASICA

DR. CHRISTIAN TRIGOSO A.

y colaboradores

LA PAZ - BOLIVIA
19-97
 BACTERIOLOGIA BASICA

- Dr. Christian Trigoso A.

Profesor Titular de Microbiología
Facultad de Medicina - UMSA
Médico Bacteriologo-lNLASA/M.P.S. y S.P.
Ex-Bacteriólogo del Laboratorio de Microbiología de Ali•
mentos, INLASA/M.P.S. Y S.P.

COLABORADORES
- Univ. Hernán Huarita O.
Auxiliar de Docencia de Microbiología
Jefe de Auxiliares de Docencia de Microbiología y Parasito•
logía.
Facultad de Medicina - UMSA
- Biotec. Ma. Lourdes Zegarra N.
Ex-Laboratorista de la Unidad de Inmunología-INLASA/
M.P.S. y S.P.
Ex-Laboratorista de Entomología-INLASA/M.P.S. y S.P.
1992
D. L.: 4 - 1- 819 - 92
Facultad de Medicina - UMSA
La Paz - Bolivia

Impresión: HUELLAS SRL.

Con devoción y gratitud a
nuestros padres

Para Christian y Antonella Trigoso

V. en pertenencia, por haber inspirado
con su amor este esfuerzo.
 PRESENTACION
En el curso de los últimos años y luego de inmenso
sacrifi• cio, algunos profesores de nuestra facultad, han
logrado publi• car un libro.
El esfuerzo, casi siempre personal, ha volcado en
las páginas de dicha obra, las inquietudes que en el ámbito
de la práctica profesional, de la docencia y el compromiso
social, han atesorado sus autores.
Pero no siempre se ha logrado, en todos los casos,
cum• plir el anhelo del texto propio, pese al reclamo de
profesores y estudiantes, para investigar y enseñar la
patología regional y nacional.
Con este primer tomo de "Biblioteca de Medicina",
edita• do gracias al apoyo de la Embajada de Gran Bretaña,
inicia• mos un proyecto que esperamos se de por
concluido unica• mente cuando los docentes de todos las
asignaturas, hayan publicado sus propias obras.

Dr. Buddy Lazo de la Vega

DECANO DE LA FACULTAD DE MEDICINA
UMSA
 INDICE

Prólogo ··········-········-········-········································-·····················-········· 11
Prefacio ········-- ·······-·········· .. 13
Cap. l. Historia de la Microbiología ·····-···-····-··········-····--·-·····- 15
Cap. 11. Ambientes de Laboratorio y
Preparación de material ··-··········-··-·-··············-·········-········--· 23
Cap.111. Microscopía . ., .,.. . .. 41
Cap. IV. Esterilización y Desinfección ··--···-····--·············- : 55
Cap. V. Medios de Cultivo ···-········-·····-·-··-··-·----··-·..·-······--····- 71
Cap. VI. Métodos de Siembra-Lectura
Interpretación del Desarrollo Bacteriano 87
Cap. VII. Toma de Muestra -···································-···································· 105
Cap. VIII. Tínciones • Gram y Otras ·············-················-·········-······ 119
Cap. IX. Ziehl-Neelsen-Baciloscopía . . 137
Cap.X. Antibiograma ..,_ - --·-········· 149
Cap. XI. Flora Microbiana Normal . . .. . 159
Cap. XII. Fundamentos de Urocuítivo, Hemocultivo
y Coprocultívo -·····-············--···· ··-··· .. 167
Cap. XIII. Metodología del Diagnóstico
Bacteriológico ···········-·····-···-·-·--··-··············· 175
Cap. XIV. Diagnóstico de Cocos Piógenos ···········-······················· 183
Cap. XV. Diagnóstico de Enterobactcrias ·············--························· 203
Cap. XVI. Diagnóstico de Mycobacterias ·-··························· 231
Cap. XVII. Diagnóstico de Bacilos Gram (+)
(Bacillus y Corynebacterium) ·-··············. ...... . . .... 243

9
Cap. XVIJI. Diagnóstico de Gérmenes Anaeróbicos 255
Cap. XIX. Diagnóstico de Bacilos Hemofilos
y Bordetellas ···--····-·· ... ··········-········ ··-········-············ ·············-········. 269
Cap. XX. Diagnóstico de bacilos Gram (-),
Pequeños (Brucellas, Yersinias, y
Pasteurellas) ·······-····--··--·····-········-········-··············-··········-········ 277
Cap. XXI. Diagnóstico de Espiroquetas ······-········-··-········-·-····- 287
Cap.XXTI Fundamentos de Técnicas Básicas
en Serología ·-····-··--··-········-·······-········-············--········-·· 295
Cap.XXIII Técnicas de Inoculación en Animales
de Laboratorio ·······--············ ········-········-············--············ 305
Bibliografía ···--·----·-·····- - _ _.._.. 319

10
 PROLOGO

La permanente inquietud científica demostrada a través

de la Carrera docente del Dr. Christian Trigoso. Profesor
de la Cátedra de Microbiología, nos entrega esta vez un
valioso apone para la enseñanza de esta importante disciplina
en la Fa• cultad de Medicina.
Manual en el que encontrarán tanto profesionales como
es• tudiantes de Medicina y de las otras carreras del Area de
la Sa• lud una guía valiosa del manejo práctico del laboratorio
micro• biológico.
El lenguaje claro, sencillo y didáctico en el desarrollo
de los diferentes capítulos nos muestra; por una parte. el
conoci• miento. la experiencia y el dominio del autor en este
campo y por otra la habilidad de transmitir la
metodología en la enseñanza de esta parte de la Patología.
base fundamental de la Medicina en el diagnóstico preciso de
las enfermedades.
El autor y colaboradores ponen al alcance de la
comunidad científica este "Manual Práctico de Bacteriología
Básica", que recomiendo sea leído. en muchos casos para
aprender y en otros
· para actualizar ó recordar conocimientos.
Muchos han debido ser los obstáculos para lograr que
este texto salga a la luz, porque como sabemos, publicar en
nuestro medio significa un enorme sacrificio; el haber
culminado exi• tosamente este trabajo debe ser el estímulo
que impulse a los autores a seguir adelante.

Dra. Gracíela L. de Murillo Jefe

de la Cátedra de Microbiología
Facultad de Medicina
Universidad Mayor de San Andrés
La Paz. 1992
 PREFACIO

El presente manual fue preparado de manera que tanto los

estudiantes como los que ya desempeñan labores en esta disci•
plina puedan tener en él una guía. Al margen de que es también
interés nuestro incrementar la bibliografía en lo que respecta a
obras de divulgación científica en nuestro medio.
En honor a la verdad debemos destacar que este texto em•
pezó a ser elaborado hace seis años, habiéndose destinado todo
este tiempo para las correcciones y modificaciones pertinentes.
El contenido ha sido ajustado al programa vigente en la
Facultad de Medicina de la Universidad Mayor de San Andrés,
y revisa desde los aspectos históricos -"Una ciencia no puede
ser conocida si no se conoce su hístoria"- pasando por una pri•
mera parte general que brinda las herramientas básicas que debe
conocer y adoptar el practicante, finalizando con la segunda
parte que orienta en la metodología diagnóstica básica de la
bacteriología clínica. Precisamente en este sector se han reco•
gido aquellas pruebas que por su simplicidad, costo, procedi•
miento y disponibilidad, son las más asequibles para quienes se
desenvuelven en la realidad de nuestro país.
Así mismo existen dos capítulos, de los cuales uno trata so•
bre pruebas serológicas básicas y el otro sobre inoculación en
animales: intentan pues desde un punto de vista básico iniciar a
los estudiosos en el campo vasto de la inmunología a partir de la
estrecha relación que existe entre la bacteriología y esta ciencia.
Deseamos también poder ayudar a través de este esfuerzo
a desterrar de una vez por todas aquellos viejos y caducos pre•
juicios, por los cuales solo algunos profesionales pueden traba-
jar en esta disciplina, habiéndose creado una especie de barrera
mental que impide a la bacteriología estar al alcance de todos
cuantos conforman el llamado equipo de salud; es hora pues de

13
romper estas barreras de manera que nueva luz pueda iluminar
a esta ciencia todavía joven en nuestro medio, pero con un pa•
sado extraordinariamente brillante.
Hay que ponderar la valiosa colaboración prestada por el
Univ. Hemán Huarita al haber complementado todo el
conteni• do y escrito íntegramente el tema de Inoculación en
Animales de Laboratorio. Mi eterna gratitud. no solo por haber
ayudado en toda esta obra. sino también porque con su interés
e inquie• tud a la vez que capacidad supo demostrar que los
jóvenes se están preparando óptimamente para enfrentar un
mundo lleno de desafíos.
Vaya también un sincero agradecimiento a la Biotec.
Maria Lourdes Zegarra N. por haber revisado y corregido
cada uno de los capítulos de este Manual y redactado el
acápitc co• rrespondiente a Fundamentos de Técnicas
Serológicas Básicas.
Es de rigor agradecer a la Señora Patricia Ferrufino Loza
por haber realizado eficientemente la transcripción del texto.
Finalmente nuestro reconocimiento a la Dra. Gracicla
López de Murillo por todo el apoyo moral. así como por sus
enseñanzas siempre valiosas e imperecederas. Este es un
fruto del arbol que sembró y plantó desde varios años atrás.
Toda crítica que realice el amable lector ayudará a
mejorar esta obra en las sucesivas ediciones. disculpándonos de
antema• no por cualquier error involuntario que presente el
libro.

Christian Trigoso

Invierno de 1992
14
 CAPITULO I

HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA

A la luz de los actuales descubrimientos sabemos que

los primeros seres dotados de vida e independencia biológica
fue• ron los microorganismos, para esto tan solo debemos
atenemos a las pruebas de que ya en la era protozoica y en la
era paleo• zoica (carbones) existieron los cocos (formas
bacterianas redondea• das): inclusive se asevera que en el período
pérmico ya aparecie• ron los cocos patógenos; hecho que
está apoyado por el hallazgo de cambios oseos en los réptilcs
de esta época.
Con la aparición del hombre sobre el planeta. también comenzaron
sus males (enfermedades infecto-con tagiosas); el binomio
bombre• microoio inleraccionó desde los albores de la humanidad;
además de que echó maro de ciertos procesos vitales en base a la
fermentación (uva, maíz. etc.) sin imaginar que los microbios
eran los responsables, para que cuente con el vino o la chicha de
maíz.
Las antiguas culturas (Egipto, Asiria, etc.)
comprendieron de que existían ciertas enfermedades (Lepra)
por las cuales los individuos infectados debían ser separados
de la sociedad. Aún en la cultura Egipcia; se llegó a manejar
muy bien el fenómeno de la putrefacción. pues es bien
conocida la actividad de momi• ficación de los cadáveres por
parte de los sacerdotes. preservan• do los cuerpos a través de
muchísimos años.
Posteriormente Hipócrates y Galeno enunciaron la
hipótesis de la naturaleza viva (contagium vivum) de las
enfermedades infecciosas.
De aqui en adelante sobrevino un largo periodo de
tiempo en el cual la humanidad se sumió en la obscuridad.
precisa• mente en esta época, arreciaron las epidemias,
lamentablemente
15
debido a presiones ejercidas por las clases gobernantes, en esta
etapa la ciencia se sum ió en superstición y charlatanería,
dando explicaciones por demás absurdas a las causas
etiológicas y modos de transmisión de las eníermedades que
awtaroo esos pueblos.
El primer hombre que emitió una teoría sobre la causa de
las enfermedades epidémicas fue Jerónimo Fracastorius (Vero•
na) quién en 1546 publicó un libro denominado "De contagioni•
bus et contagionis morbis et eorum curatione", donde postuló la
existencia de partículas vivas que pasaban del enfermo al sano
causándole la enfermedad; además de que identificó los
modos de trasmisión ("per contactum". "per fomítes", "per
dístans").
Sin embargo "Scrutiniurn physico - medicum" escrito
por un sacerdote jesuita Athanassius Kircher indica que es
factible observar seres vivos microscópicos en las substancias
en descomposición.
En 1590 los hermanos Jansen construyeron el primer
microscopio después de pulir afanosamente muchos lentes.
El primer hombre que sacó de la oscuridad a los
microorganismos fue Antonio Leewenhoek, llegó a construir
sistemas muy perfeccionados para su época; a lo largo de una
copiosa correspondencia que mantuvo con la Real Sociedad de
Inglaterra explicó e incluso mostró a través de dibujos
primorosamente realizados, sus "animaíículos" que
encontró en distintas infusiones, excrementos y sarro dental .
En 1695 publicó los resultados de sus observaciones.
Posteriormente estos "animalículos'' volvieron a caer en el
olvido después de la muerte de Leewenhoek, sin embargo
algunos años más tarde haría su ingreso en el escenario de la
ciencia un hombre que habría de hacerse famoso merced a sus
batallas científicas en contra de la teoría de la "generación
espontánea" este magnífico hombre de ciencia se llamaba
Lazzaro Spallanzani (1729 -1799) y tuvo a bien
transformar
16
aquello sobre lo que todo el andamiaje de la ciencia
asentaba hasta entonces (generación expontánea),
Apoyado en su intuición y además en base a los trabajos
previos de Francesco Redi ( 1626-1697), quién demostró que si
se cubría un trozo de carne con tela de seda. y se mantenía otro
sin protección alguna: al cabo de cierto tiempo se vería que
en la carne descubierta aparecían muchas larvas de moscas y
en la carne cubierta no existían estas larvas pues las moscas no
tenían acceso para colocar sus huevos, se abalanzó sobre la
teoría de la "generación expontánea''.
Así quedó preparado el camino para el advenimiento de
quienes terminaron por aplastar la teoría de la "generación
cxpontanca".
En 1838 se lleva a cabo la primera identificación de un
microorganismo llamado Rotrytis bassícae. un hongo productor
de la muscardina del gusano de seda. este primer agente
etiológico fue encontrado por Agostino Bassí, en Italia.
Sin embargo. y en honor a quien sentara las bases de la
Bacteriología como disciplina cientffica, debemos referimos a
un coloso de esta nueva ciencia: Luis Pasteur.
Luis Pasteur en 1855 comienza el estudio de las
fermentaciones. concluyéndolas con los descubrimientos de la
fermentación butírica y el fenómeno de la anaerobiosis.
Precisamente este hombre se encargará de asestar el golpe
mortal a la estructura de por si decadente de la "generación
espontánea" a través de experimentos sencillos y metódicos
pero concluyentes (nunca se olvidará el matraz con " cuello de
cisne " que sirviera a Pasrcur para demostrar lo absurdo de la
generación expontánea).
Igualmente inició sus trabajos en lo referente a infecciones
y septicemias que habrían de servir de base para la creación de
la "antisepsia". a través de la aplicación práctica de estos
principios superando las altas tasas de mortalidad por
infecciones en las salas de cirugía.
17 -
 Joseph Lister (1827-1912) inició esta revolución en lo que
se refiere al uso de compuestos químicos (Fenol) como
procedimiento para esterilizar los ambientes e instrumental
quirúrgicos, y edificar de esta forma los principios de la anti•
sepsia.
Pasteur se convirtió en el decano de los bacteriólogos del
momento, formando una formidable escuela entre los que se
destacarán Chamberland y Roux; precisamente trabajando con
ellos encontró a través de la desecación de las médulas
espinales de conejos que conseguía atenuar la virulencia del
virus de la rabia (imagine el lector. ni siquiera podía observar al
gérmen, pero ya lo había confinado a una probeta ) se
aprestaba a sacarle el máximo provecho).
En lo que se refiere al inicio del aislamiento de bacterias
patógenas, debemos indicar que Rayer 1850, Davainc 1863 y
Pollander 1849 fueron los primeros que hallaron al agente
etiológico del carbunco, sin embargo, no pudieron explicar la
forma de contagio. considerándose este descubrim lento como el
primer hito en la bactenología médica.
En 1876 aparecería un trabajo que habrá de colocar a su
autor como rival de Pasteur: se trata de un médico rural alemán
que trabajando en Wollstein. sin laboratorio sentó las bases de
la metodología en la bacteriología a través de un formidable
trabajo sobre Bacillus amhracis, su nombre Roberto Koch.
Este humilde científico plasmará en cuatro postulados
toda la metodología bacteriológica.
Cabe resaltar que fue el primero que utilizó los medios de
cultivo sólidos, logrando de esta manera el aislamiento de las
bacterias (1881). En 1882 Frau Hesse (esposa de uno de sus
colaboradores) sugiere el uso del Agar Agar corno solidificamc
y en 1887 R.J. Petri (ayudante de Koch) inventa las cajas de
vidrio que llevan su nombre y hasta hoy son utilizadas. Sin
embargo en el año de 1882 se produciría un sensacional
descuhrimiento y obviamente Koch habría de ser su artífice;

18
trabajando con vesubina y azul de metileno (colorantes).
obtuvo las primeras tinciones del Mycobacterium tuberculosis.
En 1884 Christian Gram, descubre la tinción
diferencial que lleva su nombre. Posteriormente los discípulos
y colaboradores de Koch descubrían entre otros a los
agentes etiológicos de la difteria (Klebs y Loeftler), fiebre
tifoidea (Gaffky y Eberth) y del tétanos (Nicolaier y Kitasato).
En lo que respecta a la inmunología; ya en 1796 Eduardo
Jcnner demostró que la inoculación con agentes de viruela
de los vacunos (vaccinia) inmunizaba contra la infección
de la viruela natural, e inclusive antes que él, Lady
Montagu ya explicó en Londres cómo en la China se
utilizaba el método de la variolización a fin de salvar a las
esclavas más bellas de las terribles secuelas de la viruela.
Con los trabajos de Pasteur en el área de las vacunas y
con eJ descubrimiento de la inmunidad celular por parte de
Meten• nikoff (1845-1916) se allanó el camino de la
investigación in• munológica.
Pahlo Ehrlich (1854-19 l 5) es un hito en el estudio de
la inmunología al descubrir los fenómenos de la
inmunidad humoral.
En el campo de los fármacos antibacterianos no debemos
olvidar que inició la era de la quimioterapia al
encontrar, después de sucesivos experimentos el "606"
(salvarsan), primer fármaco utilizado contra la sífilis;
posteriormente Domagk descubre las sulfas y Flcming
encuentra la penicilina a través de una contaminación
afortunada de sus medios de cultivo.
Los virus son descubiertos por D. Iwanovski en 1892,
al estudiar en el Jardín Botánico "Nikitskin" la
enfermedad llamada mosaico del tabaco. En 1898 Beijerinck
confirma estos trabajos y así empezará la ola de
descubrimientos en esta disciplina.
19
MICROBIOLOGIA EN BOLIVIA.-
Ya , desde el período pre-colonial el concepto de
enfermedad fué manejado en función a explicaciones
teogónicas; se asociaba el morbo con la posesión por un demo•
nio del cuerpo humano' hecho que era combatido con rituales y
ceremonias religioso-mágicas. sin embargo la idea de la propa•
gación de las enfermedades era conocida. pues una vez falleci•
do el enfermo se procedía al PICHARA ( Pichay = limpiar) es
decir a limpiar la habitación y la ropa del finado: este hecho nos
demuestra que el concepto de contagio ya se haJlaba arraigado
en nuestras culturas. Inclusive se individualizaron algunas enti•
dades infecciosas. tal es el caso de la sífilis que era conocida
como HUANTI. Es más, con referencia al paludismo (Chuc•
chu) obligó a estas culturas a reconocer las epidemias y desig•
narlas con el nombre de MARCA - l'SO, y los focos de epi•
demias con el nombre de LLACTA -CCOLLOY.
El 24 de diciembre de 1889, a través de un Decreto del Dr.
Aniceto Arce se establece un nuevo estatuto de enseñanza
donde además de la dist ribución de las disciplinas para siete
años de estudio en la carrera de Medicina se incluye en el
contenido de cuarto año a la Bacteriología.
En 1908 se funda el "Laboratorio de Bacteriología" en la
ciudad de La Paz en un local situado en la calle lndaburo (en el
mismo edificio ocupado por la Facultad de Medicina); habien•
do sido su fundador el Dr. Ncstor Morales Villazón y un estu•
diante de Medicina.
Entre los hombres de ciencia que impulsaron la
microbiología en nuestro país destacan:
Dr. Nestor Morales Villazón: Primer Director del Instituto
de Bacteriología, Director y Fundador de la Revista de
Bacteriología e Higiene. Publica obras científicas entre las que
destacan: La Fiebre Tifoidea en Bolivia (1916) y Pasteur y su
Obra (1919).

20
 Dr. Félix Veintemillas: Fue encargado de combatir la
epidemia de tifus exantemático y peste bubónica. Profesor de
Bacteriología en la Facultad de Medicina de La Paz y Director
del Instituto de Bacteriología.
Dr. Luis Prado Barrientos: Fue miembro del Primer
Congreso de Microbiología en París; donde presentó un
aparato para determinar el Indice Delta que lleva su
nombre.Trabajó en Fiebre Amarilla y Peste Bubónica, preparó
un antígeno para diagnosticar lepra, fue profesor de la
Facultad de Medicina en La Paz, en las disciplinas de
Enfermedades Tropicales y Parasitología.
Dr. Luis Valverde Chinel: En 1960 obtiene el biológico
liofilizado antivariólico; prácticamente ese mismo año estudia
en San Joaquín (Beni) la Fiebre Hemorrágica Boliviana. En
1963 con un grupo de investigadores del MARU (MIDDLE
AMERICAN RESEARCH UNITE) consigue aislar el virus
machupo (agente etiológico de la fiebre hemorragrca
boliviana) y descubre su rescrvorio y diseminador (el roedor
Callomys callosus). Profesor de Microbiología y Parasitología
de la Facultad de Medicina en La Paz.
Dra. Laura Prado de Pinell: Quien organizó el laboratorio
de diagnóstico de Tuberculosis en el Instituto "Nestor Morales
Villazón". además de desempeñar las labores de docente en la
Facultad de Medicina (Bacteriología, y Parasitología) en La
Pa1..
Actualmente hay investigadores que desarrollan su
actividad en todo el territorio nacional. siempre en la búsqueda
de un mañana mejor para nuestro pueblo.

21
 CAPITULO II

AMBIENTES DE UN LABORATORIO
Y PREPARACION DE MATERIAL

A. CONCEPTO.-
Así como el cirujano precisa del quirófano para llevar
a cabo su trabajo, o el médico clínico, del consultorio, así
tam• bién el bacteriólogo precisa de un laboratorio para
desarrollar su tarea. Por otra parte tal como el cirujano
requiere de las máximas condiciones de asepsia y limpieza en
el quirófano, el bacteriólogo tiene como regla de aseo el
mandato que indica: "prevenir la infección y no contaminar".
Y esta norma adquiere gran importancia, cuando sabemos
que estamos manipulando agentes patógenos que al menor
descuido nuestro pueden infec• tarnos, enfermarnos o
inclusive causamos la muerte o final• mente contaminar
nuestro ambiente.
B. DEFINICION.-
El laboratorio es un conjunto ordenado de salas ó
am• bientes asentados sobre una infraestructura y dotados
de un equipamiento mínimos que nos permite llegar a un
objetivo.
C. ESTRUCTURA.-
Vamos a analizar la estructura de un laboratorio en base a
dos puntos, el primero nos mostrará la estructura de una sala o
ambiente tipo, y el segundo nos mostrará la esquematización
de un laboratorio tipo.
l. Sala o Ambiente Tipo.-
Las paredes deberán estar pintadas con pintura lavable
además de poseer colores claros, esto para facilitar el aseo
y
23
además para que pueda destacar cualquier mancha-contamina•
ción potencial-accidental de las paredes.
Es muy eficaz dotar a las paredes de revestimiento de azu•
lejos desde el ras del piso y hasta la altura mínima de· 1.50
metros.
La iluminación será excelente tanto la natural (grandes
ventanas) como la artificial (buena dotación de bombillas
eléctricas o tubos de gas de neón).
Los pisos tienen que estar construidos de material lavable
(cemento, baldosas, etc.) ya que de esta manera podemos
asegurar la límpieza e inclusive la desinfección de esta
superficie: por otra parte poseerá un declive central con el
correspondiente desaguc.
El ambiente Iaboratorial contará también con:
a. Energía Eléctrica con diferente voltaje.
b. Sistemas de lámparas de luz ultravioleta como fuentes
de esterilización del ambiente, ubicados en los lugares de entra•
da y salida del laboratorio.
c. Agua corriente parn el uso de diferentes procesos. Esto
se explica porque sin agua corriente no podríamos lavar el
material. preparar los reactivos ele. Es también importante
contar con un destilador de agua y dcionizador a fin de tener a
la mano agua destilada de óptima calidad para la preparación de
medios de cultivo. colorantes. etc.
d. Sistemas de gas licuado para el funcionamiento de los
mecheros de bunsen,
De igual manera encontramos en el laboratorio .. los mesones
de trabajo. es decir las mesas donde vamos a realizar todos los
procedimientos pertínemes.
Estos mesones tendrán una altura de más o menos 1.20
metros, las superficies serán de material susceptible de I avado y

24
desinfección (azulejos, etc.) De ser construido de madera
deberán estar pintados de un color negro o mate a fin de evitar
fenómenos de reflexión de rayos solares cuando usemos apara•
tos ópticos.
Los mesones necesariamente contarán con instalaciones de
agua, energía eléctrica, gas licuado y sistema de desague.
En sí el ambiente de un laboratorio debe ser aséptico,. es
decir libre de gérmenes, pues no debemos olvidar que la mate•
ria prima de nuestro trabajo han de ser las muestras que habrán
de contener gérmenes, de tal manera que si nos hallamos en
un ambiente séptico seguramente vamos a entorpecer nuestra
labor porque no vamos a tener la certeza de nuestros resultados
debi• do a potenciales "contaminaciones" de las muestras.
2. Esquematización de un Laboratorio
Tipo.
No pretendemos dar las especificaciones para un
laboratorio grande y multidisciplinario sino tan solo la
distribución de aquellas salas y/o ambientes que creemos son
básicas y necesarias para cumplir el objetivo bacteriológico.
Es pues así que en base a esta premisa vamos a ordenar
ra• cional y lógicamente esta distribución. tomando en cuenta
co• mo guía el trayecto que sigue una muestra dentro del
circuito la• boratorial.
a. Sala (ambiente) de recepción.
Es el ámbito donde ha de llegar en primera instancia el
paciente ó la muestra. básicamente aquí vamos a conocer al
paciente; es decir. que haremos la recolección de datos
informativos de una persona (nombre. edad, sexo, ocupación,
procedencia, domicilio, nombre del médico tratante, tipo de
muestra, solicitud de examen laboratorial, etc.). A la vez que
determinaremos el tipo de prueba (procedimiento que se habrá
de practicar).
En esta sala tendremos el material mínimo para llegar a
la filiación del paciente. así como para posteriormente
guardar
25
esta información y los resultados obtenidos en forma
ordenada (máquina de escribir, sistema de kardex, material de
escritorio, etc.).
b. Sala (ambiente) de toma de muestra.-
Este es el lugar donde se practicará la toma de muestra
del paciente, para este fin tendremos todo el material que sea
preci• so debidamente esterilizado y/o desinfectado (jeringas,
asas bacteriológicas, hisopos, baja lengua, espéculos) además
de una camilla.
Hasta está sala podrá llegar el paciente, de allí en adelante
ya poseemos la muestra con la cual finalmente llegaremos
al diagnóstico.
c. Sala (ambiente) de procesamiento.-
Es el ambiente donde la muestra es procesada a través de
diferentes pasos como ser: concentración, descontaminación,
uncíon. cultivo, etc.
El material necesario es el siguiente: Cubeta de tinción,
mechero. colorantes, centrifugadora. contador de colonias, estu•
fa de incubación, reactivos, material de vidrio.
d. Sala (ambiente) de microscopia.-
En este ambiente básicamente tenemos el
fotomicroscopio compuesto que nos permite la observación de
microorganismos así como el estereomicroscopio que nos
auxilia en el estudio detallado de las colonias microbianas.
e. Sala (ambiente) de esterilización.-
Una vez que hemos llegado al diagnóstico, aún
debemos completar otro paso, y consistente en esterilizar todo
aquel ma• terial recuperable que ha sido utilizado en este
trabajo, poste• rionnente éste deberá ser lavado (detergentes
biodcgradables), preparado adecuadamente y esterilizado para
lo cual contamos con autoclaves. hornos de Pasteur, etc.
26
 f. Sala de medios de cultivo y reactivos.-
Esta sala servirá para preparar nuestros colorantes, reac•
tivos químicos y medios de cultivo. Para este fin tendremos en
este ambiente soportes universales, balanzas. mecheros, horni•
llas, morteros, probetas graduadas, además de los reactivos y
medios de cultivo respectivos.
g. Sala depósito.-
Aquí guardaremos todo el material esterilizado a fin de
que cuando sea requerido en alguna de las salas tan solo se haga
su traslado, también conservaremos el material de vidrio con
que cuenta el laboratorio, así como otros materiales e ins•
trumentos.
Hasta aquí hemos visto un conjunto central ordenado, sin
embargo al margen de este sistema central, existe otro periféri•
co que está constituído por tres salas que son:
h. Incinerador.-
Aquí se va a proceder a incinerar o quemar todo aquel ma•
terial utilizado y que no puede ser recuperado, tal es el caso de
los hisopos. baja lenguas. algunos recipientes, etc. Se halla fue•
ra del sistema central precisamente para no contaminar y no en•
torpecer la actividad de éste por la presencia de humo y gases
irritantes.
i. Bioterio.-
Este es el ambiente destinado a la crianza de animales
susceptibles de experimentación (conejos, ratones. cobayos,
etc.)
j. Portería.-
Es necesario contar con la presencia de personal que cuide
todas las instalaciones del laboratorio las 24 horas del día.

27
D. CROQUIS DE UN LABORATORIO TIPO.-

e d

b l
-
e

--
~I
a g

Sistema Central Sistema Periférico

E. PERSONAL DE
LABORATORIO.-
Para que el trabajo se desempeñe en un ambiente
óptimo es necesario que el personal guarde ciertas normas
básicas:
l. Todo el personal que trabaje en un laboratorio debe
usar mandil, con el propósito de no contaminarse.
2. Debe poner mucha atención y responsabilidad en su trabajo
pues podría infectarse o llevar gérmenes peligrosos hacia otras
personas.
3. El elemento femenino deberá usar un gorro para el
cabello, pues de lo contrario se expone a contraer cualquier
infección o infectar al personal ajeno, al ser su cabello
vehículo de microorganismos (la misma recomendación para
el elemento masculino que lleve el cabello largo.)
4. Se debe evitar el llevar la uñas crecidas, pues también
se vuelven en óptimos "depósitos" de microbios.
28
5. Está terminantemente prohibido fumar y comer en el
labora•
torio.
6. La advertencia que nunca se debe olvidar: es lavarse
las manos con un buen jaboncillo desinfectante. antes y
después de cada trabajo de laboratorio.
7. El personal que trabaje en laboratorio debe conocer normas
y
reglamentos referentes a
bioseguridad.
Bioseguridad (OMS).•
Defin.ición.-
Son todo tipo de normas y reglamentos de conducta que se
establecen con el único fin de asegurar la vida del personal,
co•
munidad, ambiente Iaboratorial, y el medio externo que rodea
a
todo este sistema de trabajo en un
laboratorio.
Estas normas comprenden:
a. Conducta individual
b. Niveles de riesgo
1. Individual y comunitaria
2. Laboratorial
c. Accidentes Laboratoriales
a. Conducta
lndividual»
El individuo que trabaje en el laboratorio debe ingresar
previa revisión médica y debe ser sometido previa•
mente a una revisión médica y a pruebas de sensibili•
dad. Posteriormente se le dotará de gorros. barbijos.
guardapolvos, etc. como vestimenta de protección.
b. Niveles de Riesgo=
Individual y
Comunitario
 Grupos de Riesgo.-
1. Poco riesgo para los individuos y la comunidad.
II. Riesgo moderado para los individuos y limitado para
la comunidad.

29
 IIJ. Riesgo elevado para los individuos pero escaso para la
comunidad.
IV. Riesgo elevado para los individuos y la comunidad.
Riesgo Microbiológico.-
Para el organismo humano en todo procedimiento el ries•
go es potencialmente alto por diversas causas o accidentes, de
cualquier forma el acceso al organismo de gérmenes produce
infección y puede iniciarse por inhalación, ingestión, grietas
en la piel y a través de mucosas.
De esta manera en el grupo I hay gérmenes que tienen po•
cas probabilidades de contaminar.
Grupo II, gérmen que provoca enfennedad en el hombre
en forma moderada, hay prevención.
Grupo Ill, provoca enfermedades en el humano, pero no
se propaga a la comunidad.
Grupo IV, enfermedad grave en el hombre y contagioso
para la comunidad.
Riesgo Laboratorial.-
Grupo I. Laboratorio Básico, de enseñanza básica que dá
servicios primarios de salud, consultorio.
Grupo JI. Laboratorio Básico en laboratorio de
diagnóstico (con dispositivos de seguridad).
Grupo III. Laboratorio de contención que da diagnóstico
especializado).
Grupo IV. Laboratorio de contención máxima, que trabaja
con bacterias patógenas y peligrosas.
¿Que gérmenes podemos encontrar como ejemplos, en
estos grupos?
Son:
Grupo l. Bacillus subtilis Escherichia coli.

30
 Grupo JI. Salrnonella typhi. virus de la hepatitis B.
Mycobacterium T.B.
Grupo III. Brucella s.p.p. Virus,
Histoplasma. Grupo IV. Virus de la fiebre
aftosa.
c. Accidentes
Laboratoriales-
Los accidentes en el laboratorio microbiológico se
deben a muchas causas, éstas pueden ser por error
humano, falla técnica, seguridad deficiente, animal
infectado, etc.
Para mayor detalle se debe revisar textos publicados por la
OMS.
De todas maneras es bueno señalar que cualquier
accidente debe inmediatamente ser atendido con todos los
elementos de seguridad como por ejemplo:
esterilizadores físicos. químicos, al igual que desinfectantes y
áreas destinadas a la protección del individuo o personal de
trabajo (Seguridad Ambiental).

PREPARACION DE MATERIAL
DE LABORA TORIO

F. MATERIAL DE LABORATORIO.-
G. DEFINICION.-
Es el conjunto de utensilios, instrumentos y aparatos
que
se utilizan en laboratorio, a través de los cuales, además de
una
adecuada manipulación podemos facilitar la tarea de
diag•
nóstico bacteriológico.
H. CLASIFICACION.-
 Didácticamente vamos a dividir el material de
laboratorio en cuatro grandes grupos:
l. Material de vidrio
2. Material que no es de vidrio
31
3. Aparatos
4. Reactivos y compuestos químicobiológicos.
a. Material de vidria-
Todo este material está compuesto en base a un producto
químico que es el borosilicato, que le confiere al material la ca•
pacidad de resistir altas. como bajas temperaturas, por otro
lado es más resistente al manipuleo y conserva un pH neutro;
tene• mos varias marcas como ser Pyrex, Schott-Mainz, cte.
1. Tubos de ensayo.-
Tienen un cstrerno cerrado y el otro abierto, existen deva•
rios tamaños, siendo los más usados 16 x 150, 20 x 200 mm. y
13 x 100 finalmente los de 6 x 50 mm. (Durham).
Como estos tubos de ensayo van a servir para almacenar
medios de cultivo o muestras. deberemos dotarles de un tapón
de algodón. Sin embargo existen otros tubos con sistema de
rosca y tapones de teflón -material sintético que resiste altas
temperaturas- que cierran mucho más herméticamente y de esta
manera se vuelven seguros en el trabajo laboratorial; también exis•
ten tubos provistos de un tapón metálico que cierra a presión, son los
lla• medos tubos Morton.
Por otra parte tarnbiccn existen tubos que poseen en d ter•
cio inferior un estrechamiento que divide a este material en dos
partes. una ampolla inferior y un segmento superior: sirve para
determinadas técnicas de cultivo (Roux).
2. Láminas porta-objetos.-
Son rectangulares con una dimensión de 76 x 26 mm. y
diversos espesores que oscilan alrededor de 1 mm. Los bordes
son esmerilados. También podemos contar con portaobjetos
que poseen en la parte central una concavidad; de manera que
nos sirven para realizar la técnica de la "gota pendiente".
3. Láminas cubre-objetos.-
Son laminillas delgadas de vidrio (mica) que pueden tener
forma rectangular.cuadrada o redonda. Las medidas son
variables de acuerdo al propósito que se les de.

32
 4. Cajas Petri.
Constan de una tapa y una contratapa que cierran
armónicamente descansando la una sobre la otra. tienen
forma circular y las medidas son también variables,
usándose sin embargo mucho más aquellas que tienen 10 x 150
y 200 mm.
Sirven para envasar medios de cultivo y posteriormente
recibir el paso de la siembra para que finalmente podamos
seguir el crecimiento y desarrollo de los microorganismos
(colonias).
En la actualidad existen cajas Petri de plástico
(desechables l.
5. Pipetas.-
Son tubos delgados de vidrio con graduación (0.()01. 0.01.
U.1) además de existir con diferentes capacidades (10 ml, 5
ml,
2 rnl, I mi, 0.1 ml). Se utilizan para soplar o aspirar líquidos y
transportarlos previa medición. Existen las pipetas terminales
y no terminales, siendo las más usadas las terminales por
lo práctico de su manejo: se debe indicar que es preciso colocar
un trozo de algodón en el extremo que se pone en relación con
la boca; esto para evitar que aerosoles contaminantes se pongan
en contacto con el operador.
- Pipeta Pasteur.-
Es un tubo cilíndrico que en un extremo se adelgaza
hasta disminuir bastante la luz del mismo: en el otro extremo
presenta un trozo de algodón y un perita de goma; no está
graduada. sirve para aspirar pequeños volúmenes de líquidos.
6. Balones y matraces.-
Los balones son recipientes esféricos provistos se cuello
largo y redondo. Si estos recipientes poseen base plana se de•
nominan matraces.
Los matraces de Erlenmeyer presentan forma cónica y
están diseñados para poder presentar al calor mayor superficie
acelerando de esta manera el proceso de la ebullición.
33
 Estos recipientes pueden estar graduados y así tenemos
desde 50 ml hasta I litro.
En Bacteriología este material sirve para preparar
los medios de cultivo. almacenarlos, preparar reactivos etc.
7. Probetas.-
Son recipientes de forma cilíndrica con un extremo
ce• rrado (pie) de base plana y el otro abierto provisto de un
pico para facilitar el traspaso de líquidos a otro recipiente. Son
gra• duados (desde· 10 ml hasta 1 litro).
8. Embudos.-
Son de forma cónica invertida, abierto por su base y cuyo
veertice, también abierto, se prolonga en un tubo estrecho
de• nominado pico. éste termina cortado en bisel.
9. Mechero.-
Es un instrumento destinado a proporcionar calor y
llama en pequeña escala. En Bacteriología es útil pues nos
asegura un
área de protección que se describe como de 25 . alrededor de la
<.m,
llama. además de los otros usos.
10. Varillas.-
Utiles como agitadores. así como para sostener
porta-objetos en la cubeta de tinciones.
b. Material que no es de vidrio.-
Estos instrumentos pueden ser de madera, porcelana.
me•
tal, etc.
1. Gradillas.-
Pueden ser de madera o material plástico. sirven para
sostener los tubos de ensayo.
2. Asa bacteriológica.-
Este instrumento consta de un mango. (mango de
Kolle) que puede ser de ebonita o cualquier otro material
aislante. y un hilo fabricado de platino o nicrom (aleación de
níquel y cromo)
34
que tiene la particularidad de ponerse rápidamente al rojo vivo.
al estar en contacto con la llama del mechero. además de man•
tener su estructura física y no sufrir alteraciones morfológicas.
Empero se puede utilizar en casos extremos. un hilo de alambre
mientras no sea muy grueso y no se altere con el fuego.
De acuerdo,' a la forma que adopte el extremo del hilo,
denominaremos a este instrumento: si el extremo remata a una
circunferencia que es calibrada con diámetros de 3 a 5 mm.
entonces se llama asa bacteriológica. Si el extremo termina en
punta se denominará aguja bacteriológica.
Este instrumento sirve para tomar muestras y para sembrar
en los medios de cultivo además de realizar los extendidos para
teñirlos.
Existen asas de vidrio que sirven para extender muestras
y se conocen como asas de Drigalski. ·
3. Morteros-
Son recipientes que presentan un pico. de fondo
cóncavo y más o menos áspero, acompañados de un pilón
que posee un extremo abombado. Pueden ser de porcela•
na o vidrio. Sirven para pulverizar substancias sólidas:
en bacteriología sirven básicamente para preparar colo•
rantes y reactivos.
4. Frascos Lavadores (Pizeta-;).-
Es un recipiente que generalmente es de plástico y esta
provisto de un tubo abierto en sus dos extremos y que describe
una curvatura: sirve para echar agua o cualquier otro reactivo
directamente sobre una preparación determinada tan solo al pre•
sionar el recipiente.
5. Cubeta de Tinción.-
No es nada más que una caja de plástico o lata que sirve
para realizar las tincioncs, y sobre la cual montamos dos vari•
llas de vidrio que mantienen una determinada distancia. de ma•
nera que permite sostener cómodamente varias láminas porta•
objetos.

35
 6. Aplicadores.-
Son varillas delgadas de madera que se usan para fabrica
hisopos, o en determinadas técnicas de tinción.
7. Papel kraft o papel madera.-
Usado para envolver todo material de vidrio a fin de que
no se rompa, pues actúa como amortiguador y además para es•
terilizarlo, pues resiste las condiciones que se crean en los apa•
ratos destinados a este fenómeno.
8. Mecheros de Bunsen.-
Es un mechero ideal porque nos mantiene una llama cons•
tante, una altura confiable permitiéndonos de esta manera una
protección de 40 cm. de diámetro eliminando bacterias termo•
sensibles del aire y otros.
El combustible de este tipo de mechero es gas licuado.
c. Aparatos.-
Entre estos contamos con los microscopios, autoclaves.
hornos de Pasteur (Pupincl) estufa de incubación. refrigera•
dores, ebullidores, balanza de precisión, soporte universal, po•
tenciómetro (aparato que sirve para detectar el ph de una sus•
tancia), cronómetros, centrifugadora, Baño María. hornillas.
Cada uno de estos aparatos será estudiado en los sucesivos
capítulos que nos ocupan más adelante.
d. Reactivos y Compuestos Químico-Biológicos.•
Incluyen una gran gama de productos que abarca desde los
colorantes, medios de cultivo. reactivo químicos, etc. De igual
forma más adelante iremos revisando todos estos productos.
l. - PREPARACION DE
MATERIAL.-
1. Todo el material de vidrio se lava · con detergentes
biodesagradablcs a fin de barrer con toda la materia orgánica
que se hallare en un material.
Luego se los enjuaga con agua destilada para restituir el pH
neutro.
36
2. Si fuera preciso se utilizará la solución sulfocrómica, que
reacciona con la materia orgánica e inorgánica que esté en el
material de vidrio.
3. Los tubos de ensayo se taponan con algodón y luego se
cubren con trozos de papel madera a manera de capuchones
envolviéndolos luego con cordel.
4. Las cajas Petri deben ser envueltas en papel Kraft o madera,
guardando tan solo un cuidado y es el de envolverlas invertidas,
es decir la tapa abajo y la contratapa arriba. el aislamiento del
medio externo debe ser total.
5. Las pipetas se envuelven en una tira de papel madera,
teniendo la previsión de colocar un trozo de algodón en el
extremo que irá en contacto con la boca. Una vez envuelta se
debe consignar en el exterior e1 volumen de la pipeta y señalizar
con una flecha la disposición de la punta de la pipeta.
6. Los frascos, matraces y balones también :-.e taponan con
algodón, en forma hermética y de igual manera se les pone un
trozo d~ papel madera a guisa de capuchón; sujetándolo con
un cordel.
7. l ,0s hisopos son fabricados a partí r de un aplicador de
madera en uno de cuyos extremos empezamos a envolver un
trozo de al• godón, hasta obtener un extremo redondeado y
fuertemente lia• do; posteriormente se los introduce en un tubo
de ensayo el cual es taponado para posteriormente esterilizar
todo el conjunto.
8. Una manera fácil de proveerse de baja lenguas es recolectar
sujetadores de helados C'palitos de helados"), lavarlos bien,
se• carlos, envolverlos individualmente en papel madera y
esterif zarlos).
J.
ADAPTACION.
Para todos los fines que se consignen en nuestro labora•
torio experimental, podemos apuntar que nuestra sala de recep•
ción será un cuaderno para filiar al paciente. además tendre•
mm, otro donde anotaremos todos los resultados obtenidos; la
sala de toma de muestra será tan solo un sector de la sala de
consultas donde nos valdremos de la camilla o cualquier otro
37
artefacto que en la práctica sea similar: la sala de procesamien•
to, será una mesa donde tendremos una cubeta de tincion.
colo• rantes y material mínimos para procesar la muestra; la
sala de microscopía estará representada por un microscopio,
así tam• bién la sala de esterilización estará conformada por
cualquier aparato que nos sirva para llegar a este fenómeno
(autoclave, pupinel), o finalmente aparatos tan elementales
como ebullido• ras. o aún otros artefactos cuya finalidad
primaria es otra como ser las ollas de presión. La sala de
preparación funcionará tam• bién en la mesa de trabajo y el
depósito será un cajón que guar• demos debajo de la misma.
El incinerador tendrá como símil ya sea a un horno
cons• truído en el exterior del laboratorio. o el inigualable
mechero, para finalmente desechar el material quemado en
el basurero. Asímismo todos podremos ser porteros de
nuestro material y nuestro trabajo.

38
 r¡ í\ o
F1
1

u
1

I ,
i \

/
.:
MATRAZ
Erlenmeyer
PRECIPITACION
\
MATRAZ
BASE REDONDA
(_) MATRAZ
BASE PLANA
VASO DE

p,

u
TUBO DE
íl
TUBO DE
uíl]
TUBO DE
u
TUBO CONICO
ENSAYO PRECIPITADO HEMOLISIS

[l
PROBETA PIPETA PIPETA TUBO
PATEUR CAPILAR GRADUADA

39
CUBET A MECHERO PIZET A
DE ALCOHOL
TlNClON

/
,/_
,/
-/
00
PORTA OBJETO
CUBRE OBJETO GOTERO

\JH,l
t~:
t~·
A-
FRASCO DE TOMA CENTRIFUGADORA MECHERO DE
DE MUESTRA BUNSEN
,c:7

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m
T

~t~--<
RI

PODE
CON REJILLA HOMOGENEIZADOR MORTERO
DE AMIANTO
íl
bEMBUDO
CAJA PETRI BALANZA

40
 CAPITULO III

MICROSCOPIA

A. CONCEPTO.-
La microscopia es el estudio de los instrumentos que nos
permiten la observación de microorganismos, aumentando mu•
chas veces su tamaño y permitiendo de esta manera un
estudio de los mismos.
B. INSTRCMENTOS.-
Los instrumentos que nos permiten lo enunciado
anterior•
mente son:
l. Microscopio Compuesto.
2. Microscopio de contraste de fases.
3. Microscopio de campo oscuro.
4. Microscopio de fluorescencia.
C. DEFINICION.-
El microscopio es un conjunto de lentes montado
sobre una estructura .mecáníca, a través de los cuales se
magnifica la imagen de un objeto observado.
El punto central de nuestro estudio será el
fotomicroscopio compuesto (Photo=luz. micro=pequeño:
Scopein=ver). en el en• tendido de que es probablemente el
único microscopio con que cuentan los sistemas tanto
asistenciales, de enseñanza, como de investigación en nuestro
medio.
l. Microscopio Compuesto-
E.:.; el instrumento de precisión más empleado en la
actuali• dad. Su poder de amplificación llega
aproximadamente hasta más de J 500 aumentos.
41
 Para su mejor estudio podemos dividir al microscopio en
dos panes: La parte mecánica y la noble.
a. Mecánica.-
A su vez se subdivide en dos sistemas:
1. Sistema de soporte que comprende:
- Pie o Base
- Columna- Brazo. Asa o Limbo
- Platina
2. Sistema de ajuste que comprende:
- Tomillo macrométrico
- Tomillo micrométrico
- Revolver Porta Objetivos
- Carro de Movimiento
D. PARTE MECANICA.•
i. Base.-
Es la parte donde asienta el microscopio. debe ser pesada
y mantener de esta manera siempre la posición del aparato.
Puede adoptar diversas formas.
2. Vástago.- Columna
Esta estructura es una auténtica articulación pues une dos
elementos (base y asa) y por otra parte les dota de movimiento.
El sistema de unión es en base a una chamela .
.t Asa ..-
Es la estructura que sirve de engarzo para el tubo y la
pla• tina. además de que sirve para sujetar el microscopio en
opera• cione de traslado; )' posee los tomillos de ajuste de
enfoque: a saber:
a. Tornllo macrométrico.-
Da el enfoque grueso o grosero de la preparación, se
mueve en el orden de milímetros.

42
 b. Tornillo micrométrico.-
Da el enfoque fino o exacto de la preparación. se
mueve en el orden de micrómetros.
Estos tomillo deben su capacidad de movimiento a un sis•
tema de piñon y cremallera.
4. Platina.-
Es una estructura plana, lisa, pintada con colores mate,
y atravesada por un orificio circular. El espacio que queda por
de• bajo de la platina se denomina sub platina.
La platina puede adoptar forma cuadrada, rectangular
o circular. Posee un sistema que por una parte asegura
(mantiene fijo) el portaobjetos y por otra parte le dota de
movimientos laterales y antero posteriores: este sistema se
denomina carro de movimientos ó charriot,
El carro de movimientos presenta dos tomillos, que se ba•
san en el principio del piñon y cremallera para dotar los movi•
mientos anteriormente descritos.
También hallamos en la platina el Nonius ó Vernier
que no es nada más que sistema de reglas dispuestas en
coordenadas y graduadas en centímetros y milímetros. Este
ingenioso imple• mento nos sirve para detectar un lugar
(enfoque), exacto de una preparación a través de las
coordenadas; por otro lado nos sirve como escala para
cuantificaciones (mediciones) donde también se puede utilizar
el Ocular micrómetro.
S. Tubo.-
Se halla rematando el asa, y es un cilindro hueco que
po• see una longitud de 160 mm. está pintado por dentro de
color negro mate para evitar la reflexión de los haces
luminosos. El tubo se mueve por acción de los tomillo macro y
micrométricos (platina fija) y lo hace por un sistema de piñon
y cremallera. En
360º de rotación del tomillo macrométrico el tubo se
desplaza
2,5 cm. y el micrométrico en la misma rotación desplaza
200 micras al tubo, ya sea en ascenso o descenso.
43
 En la parte inferior se halla el revolver porta-objetivos,
donde engarzan éstos que generalmente van en número de cua•
tro. En la parte superior del tubo se halla el ocular y al llegar
a este elemento estarnos ya entrando al estudio de la parte
óptica.
E. PARTE NOBLE.-
Se divide en dos sistemas:
l. Sistema de Aumento que Comprende:
• Lentes del Ocular
• Lentes de los Objetivos
2. Sistema de Iluminación que Comprende:
• Espejo o fuente de iluminación
- Diafragma o iris
- filtros
- Lentes del condensador
a. Ocular.-
Es un cilindro que engarza en la parte superior del tubo y
posee dos lentes, una superior llamada ocular (plano convexa)
y otra inferior llamada colectriz (plano convexa)
Posee en la parte central un anillo donde se puede
depositar la lente micrómetro ocular que nos permitirá
realizar mediciones de lo que estemos observando,
Así tenemos oculares que poseen aumentos desde 5x hasta
30x (muy sofisticado). siendo el más utilizado el de IOx.
b. Objetivos.-
Son también cilindros metálicos que poseen en su interior
una serie de lentes acopladas. Hay que destacar que la lente
in• ferior se denomina frontal y es plano convexa. siendo la
única responsable de dar aumento; las demás lentes son tan
solo co• rrectoras.
44
 Básicamente se utiliza tan solo el 4to. Objetivo (de inmer•
sión) pues es el único que nos permite ver y distinguir a las bac•
terias, para reconocerlo veremos que posee un anillo negro en
su tercio inferior.
c. Condensador>
Se halla en la sub platina con todo el resto de elementos
que citaremos. El condensador está compuesto de un sistema de
lentes del cual la lente superior es plano-convexa y se denomina
FRONTAL, y la lente inferior es biconvexa, llamándose CO•
LECTRIZ. La función de este aparato es condensar, concentrar
en un punto brillante un haz de luz. Posee movimientos de as•
censo y descenso merced a un tornillo que se basa en el princi•
pio del piñon y cremallera. Hoy en día el condensador más utili•
zado es el de Abbe pués es el que ha logrado mayor pertec•
cionamiento.
d. Diafragma.
Este dispositivo no posee lentes. Se halla también en la
sub-platina e inmediatamente por debajo del condensador. La
función del Diafragma es regular la cantidad de luz que pase ha•
cia el condensador, a partir del deslizamiento de un conjunto de
láminas metálicas, que pueden hacer real una abertura virtual.
e. Filtros.-
Son cristales compuestos de materiales especiales que se
encuentran engarzados en anillos ubicados por debajo del
diafragma. Estos filtro son utilizados con preferencia cuando se
pretende- utilizar técnicas fotográficas adaptadas al microscopio.
También se utilizan para lograr ciertos efectos o aumentar el
poder de resolución.
f. Fuente de iluminación.-
Esta ¡;e halla por debajo de todos los implementos que he•
mos descrito en la sub-platina, descansa sobre la base del mi•
croscopio y puede ser de dos tipos.

45
 l. Fuente <le iluminación natural.-
Está dada por un espejo de doble cara, así en una 'tenemos
un espejo plano y en la otra, un cóncavo. Posee un sistema de
engarce con la base del microscopio que a la vez le
facilita movimientos de lateralidad y movimientos en sentido
lateral y anteroposterior . este sistema que sujeta el espejo y a
la vez le dota de movimientos es denominado Cardán.
El espejo plano ha de ser utilizado cuando la
iluminación es suficiente o también si es natural.
El espejo cóncavo será usado cuando la iluminación es in•
suficiente o si es artificial.
2. Fuente de iluminación artificial.
Está dada por una lámpara eléctrica aplicada a la base
del microscopio; tal vez la lámpara más utilizada sea aquella
que posee el sistema de iluminación Kohlcr que logra la
uniformi• dad de los haces Juminosos disparados.
En este caso la fuente de iluminación es fija,
obviamente así no posee movimientos.
Hasta aquí hemos descrito la estructura deun
microscopio convencional; sin embargo antes de entrar al
funcionamiento debemos hacer todavía otras consideraciones
más, que son: Po• deres del microscopio y aberraciones
producidas en el micros• copio.
g. Poderes del microscopio.-
Son tres y definen la observación de un
objeto determinado:
l. Poder de definición.-
Es la capacidad que tiene el microscopio de brindar una
imágen nítida y definida del objeto, esto se logra gracias a la
eliminación de las aberraciones cromáticas y de esfericidad.
46
 2. Poder de penetración-
Es la capacidad que tiene el microscopio de lograr obser•
var con un mismo enfoque, el mayor número posible de de•
talles.
~. Poder de resolución. -
Es la capacidad del microscopio para poder discriminar la
distancia que pueda existir entre dos puntos de una preparación.
dando imágenes diferentes. Cabe resaltar que el poder de reso•
lución del fotomícroscopio compuesto es de 0.25 micrómetros.
es decir que puede discriminar hasta una distancia de 0,25
micrómetros que exista entre dos puntos. si es que la distancia
fuese menor a la descrita, entonces veríamos a los dos puntos
como uno solo.
h. Aberraciones producidas en el microscopio.•
Son trastornos producidos en el paso de los haces lumino•
sos por los diferentes lentes.
l. Aberraciones de cromaticidad.-
Fundamento: Se producen en virtud a que una lente es
considerada como la unión infinita de prismas y entonces ya sea
por anormalidades en el paso de la luz o ya sea por defectos de
pulido, los haces luminosos impactarían en estos prismas
dando por resultado la descomposición de la luz en los siete
colores del espectro solar.
i. Corrección: utilizamos sistemas de lentes-
1. Sistema acromático.-
a. l .ente convergente. Crown Glass (Silicato doble de
calcio y potasio).
b. Lente divergente. Flint Glass (Silicato doble de plo•
mo y potasio)
c. Colores eliminados: Anaranjado amarillo - verde -
azul - añil.
47
 2. Sistema Apocromático.•
Lentes de fluorita. -
a. Colores Eliminados: Rojo y
Violeta
- Aberraciones de Esfericidad-Fundamento: Conside•
rando que si una lente posee defectos de pulido. o
lige• ras modificaciones en su acoplamiento. la
distancia fo• cal de los extremos del lente no es
igual a la de la porción central. O sea que los rayos
luminosos que se impactan en las panes marginales
hacen su foco por delante de los rayos luminosos
centrales. Así pues el observador verá una parte
central de la imagen nítida y los contornos
difuminados o borrosos.
3. Corrección.-
a. Disminuir grosor de la
lente
b. Usar lentes aplaneticas {cóncavo
convexas)
c. Usar lentes
acsfericas
Ahora ya podremos entrar a estudiar como habrá de
fun• cionar el microscopio. una vez enterados de la
estructura de este aparato.
F. FUNCIONAMIENTO.-
Para dotar a esta explicación de interés y facilidad de
com• prensión imaginaremos que estamos tratando de
observar un pona-objetos en el que tenemos una muestra
que contiene mi• crobios.
l. Colocamos el microscopio en posición óptima para trabajar.
esto es racionalmente ubicado hacia la iluminación.
2. Revisamos que todos los componentes de la estructura
del aparato están dispuestos y en perfecto estado.
3. Colocamos el porta-objetos, sobre la
platina.
4. Ubicamos la fuente de luz y orientamos los haces
luminosos hacia el diafragma. dado que vamos a observar
microorganis• mos abrimos totalmente este dispositivo.

48
 MICROSCOPIO COMPUESTO

(Identifique cada una de las partes que lo constituyen)

NOMBRES Y APELLIDOS
.
49
5. Los haces luminosos atraviesan. el diafragma y se dirigen
ha• cia el condensador, entran por la lente colectriz de este
instru• mento y salen por la lente frontal, concentrados en un
punto lu• minoso y brillante.
6. Este haz condensado atraviesa el orificio de la platina y
llega finalmente al porta-objetos para atravesar la muestra.
Sin em• bargo, luego <le haber dado la iluminación respectiva,
procede• mos a colocar una gota de aceite de cedro sobre la
muestra (se puede usar también vaselina líquida). esto porque
ya habíamos indicado anteriormente que el único objetivo
que nos sirve es el de inmersion. así que haremos coincidir
el eje óptico del Ob• jetivo de inmersion con el eje óptico
del tubo moviendo el revólver porta-objetivos siempre en
sentido de las manecillas del Reloj; luego y mientras
observamos lateralmente. bajamos el tubo hasta posar
suavemente el objetivo de inmersion sobre la preparación,
esto significa virtualmente sumergir la lente frontal del
objetivo en el aceite de cedro o en la vaselina líquida;
posteriormente vamos subiendo el tubo operando con el
tomillo macrométrico a la vez que vamos observando color y
formas groseramente dibujadas, dejamos de utilizar el macro•
métrico, pues ya cumplió su función y empezamos a operar
con el tomillo micrométrico, siguiendo el movimiento de
ascenso del tubo. finalmente vamos a ver que la imagen se va
aclarando paulatinamente y se hace nítida. entonces dejamos
de usar el micrométrico, pues también ya cumplió su labor.
esto es dar el enfoque fino.
Pregunta:
¿Por que utilizarnos aceite de cedro para la lente de inmer•
sión?
Respuesta:
Porque dado el índice de refracción del vidrio que es
igual a 1.52. los haces luminosos se refractan y así tan solo un
por• centaje- mínimo puede pasar 1a lente frontal del
objetivo. en cambio al utilizar aceite de cedro (índice de
refracción 1.52)
50
corregimos esta refracción "empaquetando" los haces lumino•
sos con dirección al objetivo y además porque el aceite de ce•
dro, (función importante) aumenta la Abertura Numérica del
objetivo, definiéndola como el ángulo máximo con el que los
rayos luminosos provenientes del objeto. pueden atravesar la
lente frontal del objetivo y ser aprovechados en la formación de
imágenes.
7. Al llegar los haces luminosos a la lente frontal del objetivo se
produce el 4to. caso de formación de imágenes en lentes con•
vergentes (objeto situado entre el centro de curvatura y el foco
principal) siendo la imagen real, invertida y de mayor tamaño
que el objeto; que es proyectada al interior del tubo del mi•
croscopio.
8. La lente colectriz del ocular recoge esta imagen y fabrica
con ella en la lente superior (ocular) el 6to. caso de
formación de imagen (objeto situado entre el centro óptico y el
foco princi• pal) siendo la imagen virtual, derecha y de mayor
tamaño.
9. Finalmente los haces luminosos salen del ocular hacia el ojo
del observador, el cual los prolonga hacia la subplatina (25 cms.
desde el ocular a la subplatina) de dome el ojo normal recoge
la imagen, siendo ésta reinvertida por el cerebro, es decir que
Iavemos" invertida.
10. Una vez concluída la observación, procedemos a subir el
tubo, para luego extraer la lámina porta-objeto, limpiarla y de•
sengrasarla con xilol o alcohol etílico a fin de poder guardarla
Debemos también limpiar el objetivo de inmersión con xilol y
papel especial de microscopio o en su defecto un paño fino que
no deje pelusas.
G. AUMENTO TOTAL DEL MICROSCOPIO.-
Es el producto aritmético del aumento del sistema de
lentes del objetivo y del ocular. ·
Ejemplo: Objetivo de 40 x 10 x del ocular, nos da un au•
mento total de 400x.
51
H. LUPA O MI CROSCOPIO SIMPLE.-
Es una lente convergente (biconvexa) de poca distancia fo•
cal, la imagen que nos proporciona, esta dada por el 6to. caso
de formación de imágenes, por tanto obtendremos una imagen
vir• tual, derecha y de mayor tamaño que el objeto; es así pues
que el objeto debe situarse entre el foco principal y la lupa
(centro óptico). Por lo general la distancia focal de la lupa
corriente se halla entre 5 y 10 cms. obteniendo un aumento útil
de lüx a 12x.
l. OTROS MICROSCOPIOS.-
1. Microscopio de campo obscuro.-
Se basa en el fenómeno físico de Tyndall, es decir en la
di• fracción de los haces luminosos al ser impactados en forma
tan• gencial al objeto.
Para lograr este fenómeno utilizamos condensadores
espe• ciales como aquellos que poseen lentes parabólicas a fin
de lo• grar el fenómeno antes referido. Otros microscopios
tienen la capacidad de que tan solo con colocar en forma
oblícua el con• densador normal y utilizar el objetivo
marcado con la sigla "PHACO" se logra el mismo fenómeno.
La observación final será la de un campo microscópico
obscuro, y los gérmenes se verán brillantes al haberse
producido la difracción de los haces luminosos sobre los
objetos. Es particularmente útil en Bacteriología para hacer
el diagnóstico rápido de Treponema pallidum (sífilis).
l. Microscopio de fluorescencia.-
Este aparato utiliza ciertos colorantes que absorben
energía luminosa de una longitud de onda de luz
incandescente. Estos colorantes se conocen como
fluorescentes o fluorocro• mes, porque fluorecen cuando se lo
somete a la luz ultravioleta. Como la longitud de onda de la
luz ultravioleta es más corta que la longitud de onda de la luz
blanca, podemos mejorar el poder de resolución del
microscopio.
52
 Para observar se debe pintar las células con estos
colorantes.
Las variantes están en la fuente de iluminación (luz
ultravioleta), el condensador (lentes de cuarzo) y un filtro de
absorción que permite una correcta captación de la iluminación.
3. Microscopio de contraste de fases.-
Se puede adaptar perfectamente el fotomicroscopio
compuesto para lograr el fenómeno de contraste de fases, esto
merced a una placa de retardación que se halla en el plano focal
posterior del objetivo y un diafragma anular a nivel del
condensador (objetivo phaco).
De esta manera la luz que pasa por el canal de la placa de
retardación es retrasada un cuarto de longitud menos que la luz
que pasa por el resto de la placa Así logramos interferencia
de los haces luminosos desviados y directos llegando a
imágenes finales tridimensionales de muestras no coloreadas
(células vivas).

53
 CAPITULO IV

ESTERILIZACION Y DESINFECCION

A. CONCEPTO.-
Desde que Lister introdujo los conceptos de asepsia y
anti• sepsia en el vocabulario médico, se desató una ola de
experi• mentos a fin de poder trabajar en la seguridad de no
contaminar y no infectarse, es más se colocó a manera de
prevención con diversos métodos que compitieron y aún lo
hacen por hacerse ideales.
Para entender el resto del trabajo laboratorial,
debemos previamente definir una serie de términos que nos
ayudarán a comprender mejor el aspecto procedimental.
B. ESTERILIZACION
Es el conjunto de procedimientos físicos y químicos que
destruyen todo tipo de vida que se encuentra asentada en forma
definitiva o transitoria sobre un determinado objeto.
C. DESL"fFECCION.-
Es el conjunto de procedimientos físicos y químicos
que destruyen a la flora patógena, sin remover a la flora
residente. Generalmente es una substancia química utilizada
sobre superfi• cies, pero es demasiado tóxica para aplicarla
directamente a los tejidos; esto sin olvidar que también hay
fenómenos físicos que en determinadas circustancias pueden
actuar a manera de desin• fectantes.
D. ANTISEPSIA.-
Es el conjunto de procedimientos físicos y/o químicos
que nos permiten llegar a un estado, cual es el de la asepsia.
55
E. ASEPSIA.-
Es un estado caracterizado por la falta de contaminación
o infección (microorganismos patógenos).
F. SEPSIS.-
Es una condición que involucra la presencia de
contamina• ción o infección (Microorganismos Patógenos)
en un tejido vivo.
G. BACTERICIDA.-
Es el conjunto de procedimientos físicos y/o químicos
que provocan la destrucción de las bacterias, por ende éste será
un procedimiento irreversible.
H. BACTERIOSTATICO.-
Es el conjunto de procedimientos físicos y/o químicos
que inhiben el crecimiento bacteriano (por ejemplo. actuando
a ni• vel de su metabolismo) de manera que cuando retiramos
este agente, nuevamente se reinicia el crecimiento, así pues este
será un procedimiento reversible.
l. FUNGICIDA.-
Es el conjunto de procedimientos físicos y/o químicos
que provocan la destrucción de los hongos (fungi=hongo).
J. FUNGOSTATIC O.-
Es el conjunto de procedimiento físicos y/o químicos que
inhiben el crecimiento de los hongos.
Todo material en el laboratorio de bacteriología se esterili•
za para tres propósitos principales:
l. Preparar el material para una toma de muestra.
2. Esterilizar y desinfectar, el material contaminado.
3. Preparar los utensilios para su uso en
cultivo bacteriano.

56 •
K. CLASIFICACION DE LOS AGENTES FISICOS
ESTERILIZANTES Y/0 DESINFECTANTES.-
Estos se clasifican en varios grupos. a saber: los que utili•
zan el calor, con sus variantes de húmedo y seco: las radia•
ciones; la filtración; la centrifugación; el ultrasonido. etc.
l. Calor.-
Es el agente físico más utilizado dentro de la
bacteriología. y posee dos variantes, el calor seco y el húmedo.
a. Calor secu.-
1. Harneado. -
Es el método más elemental y primario de esterilización a
través del calor seco. Consiste en someter directamente a la
lla• ma de un mechero, el objeto que se desea flamear: así
pueden ser esterilizadas hojas de bisturí, pinzas, asa, y agujas
bacterio• lógicas: sabremos que el material está estéril el
momento en que se ponga al rojo vivo.
2. Incineración.-
Este procedimiento es utilizado en áreas rurales
donde con toda seguridad no dispondremos de artefactos
relativamente sofisticados para esterilizar. Consiste en cubrir
un objeto (de vi• drio o metal) con papel estañado y
depositarlo a las llamas de una hoguera o en su defecto a un
horno de barro. ladrillo o me• tal. Así transcurrido un lapso
de l a 2 horas esto dependiendo del material, obtendremos
un estado esteril que nos permirira desarrollar un trabajo más
eficiente.
3. Horno de Pasteur (pupinel)
En honor a la verdad debemos indicar que este es el
méto• do más eficiente de esterilización dentro de los
procedimientos que utilizan el calor seco.
Esteriliza a una temperatura de 160ºC a 200ºC por
un tiempo que abarca desde 1 a 2 horas.
57
 Los materiales que pueden ser sometidos a este proce•
dimiento son: material metálico que no sea cortante pues el filo
se carboniza y pierde utilidad. material de vidrio (boro silicato),
aceites y vaselinas, esto último porque los aceites y
vaselinas tienen un punto de ebullición superior a los 300"C,
de manera que a temperaturas de esterilización del pupinel no
sufrirán al• teraciones y/o degradaciones.
4. Descripción del horno de Pastcur:
Es una caja metálica de doble pared, con material aislante
entre pared y pared: provista de un sistema de resistencias eléc•
tricas que serán en último caso la fuente de calor.
Externamente posee un termómetro y un conjunto de
con• troles y voltaje encendido y apagado y termostato.
Lateralmente posee dos ventanillas que pueden ser abiertas, a
fin de purgar el interior del horno. En el interior de este aparato
podemos obser• var las rejillas metálicas donde depositaremos
el material sus• ceptible de esterilización.
5. Funcionamiento
a. Enchufe el pupinel al terminal de energía
eléctrica.
b. Coloque el material en su interior disponiéndolo
pre• ferentemente en el centro de la rejilla, esto a fin
de evi• tar alteraciones por efecto del calor, mucho
más inten• so obviamente, junto a las paredes..
c. Cierre herméticamente las puertas del
aparato.
d. Active los controles de encendido y posteriormente
gradue el termostato hasta igualar una temperatura
que sea igual a 160ºC ó 200ºC.
e. Espere hasta que el termómetro tenga la lectura co•
rrecta. Solo a partir de este instante se cronometra el
tiempo de esterilización (1 a 2 horas).
f Transcurrido este tiempo procedemos a
desconectar el horno ó a través de un mecanismo
automático éste se
58
 apagará en forma instantánea al cumplirse todas las
condiciones requeridas para esterilizar.
g. Dejamos que enfríe el aparato abriendo las ventani•
llas laterales (a fin de que el contraste térmico entre
en el interior y el exterior del horno no provoque
destruc• ción del material) y luego procedemos a
extraer el ma• terial estéril.
b. Calor húmedo.~
Cuenta con los siguientes métodos:
1. Ebullición:
Este es el método más elemental dentro del calor húmedo.
Se basa simplemente en someter a la ebullición el material que
deseamos esterilizar, empero debemos dejar constancia que este
es el más ineficáz para destruir microrganismos, ya que a 3.600
m.s.n.m. el agua hierve a= 80ºC, temperatura que como se
verá no es suficiente para llegar al fenómeno de la
esterilización, así pues la recomendación válida sena someter a
ebullición por un lapso de tiempo mínimo de 15 minutos ,
tiempo en el cual todas las bacterias termolábiles mueren
excepto aquellas que son re• sistentes y además aquellas que
tienen la capacidad de formar esporas.
2. Tyndalización:
El fundamento de este procedimiento se basa en el calor
húmedo fraccionado.
El procedimiento consiste en someter ei material a
tres tiempos de ebullición. Por ejemplo: el primer día
sometemos a ebullición (802) por un tiempo de 15 minutos;
luego incubamos el material tyndalizado a 379C por el lapso
de 18 horas; el se• gundo día nuevamente utilizamos la
ebullición (80ºC) por 15 minutos para incubar otra vez a 37ºC
durante 18 horas: final• mente el tercer día, someteremos a
ebullición (80ºC) durante otro cuarto de hora. Con este
procedimiento básicamente des• truimos bacterias esporuladas,
pues el primer tiempo de ebulli-

59
ción nos sirve para deshacemos parcialmente de las bacterias
vegetativas. en el primer tiempo de incubación logramos la ger•
minación de las bacterias esporuladas de manera que en el se•
gundo tiempo de esterilización destruimos a las bacterias vege•
tativas resultantes y en el segundo tiempo de incubación
obten•
dremos la germinación de las últimas bacterias esporuladas;
de
forma que el tercer tiempo de ebullición representa para
noso•
tros un tiempo de seguridad pues se lisarán a las últimas
bacte•
rias vegetativas.
Básicamente podremos tyndalizar, sueros. vitaminas,
pro•
ductos biológicos,
etc.
3. Autoclave
El fundamento de este procedimiento se basa en el
calor húmedo (vapor a presión).
Se usa el autoclave (horizontal o vertical) que es
un aparato en el cual se conjugan la temperatura y la presión.
Esteriliza a l 20ºC, por un lapso de tiempo de l5 - 30 mi•
nutos y a una presión de 1.5
atmósferas.
Los materiales susceptibles de autoclavado son: textiles en
general (mandiles, pijamas, barbijos. etc.) material de
vidrio (boro silicato): Medios de cultivo (excepto aquellos
que se especifiquen para otro tipo de esterilización)
soluciones; etc.
4. Descripción del autoclave.-
Es un aparato generalmente cilíndrico (vertical u
horizon• tal) que posee dos cubiertas a nivel de sus paredes
denominadas camisa interna y camisa externa. Externamente
posee la llave de encendido y la válvula de seguridad. además
del termómetro y la columna graduada para el control del
agua. La· tapa posee manijas que aseguran firmemente ésta;
además de poseer el co• rrespondiente manómetro y la válvula
de Spita.
El interior del autoclave posee- si hablarnos del
modelo vertical - a nivel de la base una rejilla o criba (lámina
metálica
60
redondeada y que presenta orificios) si extraemos esta,
vemos un piso metálico con un orificio central y otro lateral y
por de• bajo de este la cámara de agua y finalmente la fuente
de calor (resistencias eléctricas).
5. Funcionamiento
a. Enchufe el autoclave al terminal de energía
eléctrica.
h. Coloque el material dentro de los tambores de
esteri• lización (cajas redondas metálicas), asegure
bien la tapa del tambor de esterilización.
c. Proceda a llenar con agua la cámara destinada
para este objeto; previamente deberá sacar la criba;
controle en la columna graduada ta cantidad de agua
necesaria, así deberá dejar que el agua ascienda
hasta nivelarse con un anillo que se encuentra pintado
en la parte me• dia de la columna graduada.
Vuelva a colocar la criba en su lugar
original.
d. Coloque el tambor de esterilización dentro del
apa•
rato, dejando que descanse sobre la
criba.
e. Cierre la tapa teniendo la precaución de asegurar
en forma de cruz las llaves o manijas, una vez que
ha asegurado herrnéticamente proceda a abrir
totalmente la válvula de Spita que se halla sobre la
tapa.
f. Encienda el
equipo.
g. Observe que a medida que va calentando el agua y
se va transformando en vapor, empieza a abandonar el
in• terior del aparato pero sale también el aire que
quedó atrapado en el interior del autoclave, todo esto
se mani• fiesta por la salida de un vapor discontinuo;
estamos en la etapa de la purga de aire.
h. El momento que empieza a salir solo vapor y en
for• ma continua (vapor fluente); cerramos la
válvula de Spita.

61
 i. El instante que la presión sea igual a l .5 atmósferas y
solo a partir de este momento empezamos a tomar el
tiempo real de esterilización que va de 15 a 30 minutos
dependiendo esto de la calidad. y la cantidad del mate•
rial.
j. Después de haberse cumplido este tiempo de esteri•
lización apagamos el aparato y abrimos lentamente la
válvula de Spita de manera que el vapor vaya saliendo
lentamente, descomprimiendo (X)CO a (X)CO el auto•
clave.
k. Abrir el equipo solo cuando la presión es igual a
cero. Para esto procedemos a soltar las llaves siempre
en disposícion de cruz.
l. Una vez que todas las llaves han sido abiertas. le•
vante suavemente la tapa un par de veces y apenas. de
manera que no se rompa el material de vidrio al existir
un contraste térmico en relación a ta temperatura am•
biental.
6. Pasteurización
El fundamento básico es el calor húmedo momentáneo se•
guido o no de enfriamiento brusco.
a. Pasteurización
rápida
Se verifica a una temperatura que va de 70 a 74ºC y
. por un lapso de tiempo que está comprometido en frac•
ción de minuto (13 segundos).
b. Pasteurización
lema
Se realiza a una temperatura que va de 60 a 64"C y por
20 a 30 minutos.
Los productos que se pasteurizan son: leche, productos
lácteos, vino, cerveza, sidra, etc.
2. Radiaciones
Las radiaciones son utilizadas para esterilizar teniendo
como principio la producción de peróxido de
62
 hidrógeno en medios acuosos y ozono en el aire; y todo
esto finalmente repercutirá sobre los ácidos nucléicos
de la bacteria, que al absorber la radiación por el ADN
dará la producción de enlaces cruzados entre residuos
pirimídicos.
Se utiliza la luz ultravioleta a partir de longitudes de
onda que van de 2.400 a 2.800 A• (poder bactericida).
Las radiaciones X y Gamma a dosis letales destruya
cualquier célula viva; en dosis subletales, son agentes
mutagénicos.
3. Filtración
El principio fundamental es forzar el paso de un I íquido a
través de una superficie que posee poros; los cuales tienen
diámetros inferiores a los que presentan las bacterias de manera
que éstas quedan retenidas y el líquido es esterilizado.
a. Tipo de filtro
1. Bujías de Chamberland.-
Cilíndros huecos cerrados en un extremo y hechos de una
mezcla de silicato de albúmina hidratado, caolín y arena de
cuarzo. tienen diversos grados de porosidad que van desde L l
hasta L 13. el número menor corresponde al tamaño de poro de
mayor diámetro y los números mayores corresponden a poros
de menor diámetro.
2. Filtros de Berkefeld
Fabricados a hase de tierra de infusoríos mezclada con as•
besto y materia orgánica. formando un conjunto prensado. Se
clasifican de la siguiente forma: W poros de 3 a 4 micras; V de
5 a 7 micras y N de 8 a 12 micras. Los filtros de Mandler son
similares.
3. filtros de Seitz.-
Son de asbesto prensado.

63
 4. Filtros de vidrio poroso
Son filtros en forma de un disco por donde se logra este
fenómeno. Se clasifica de la siguiente manera: EG (extra
grue• so.): G (grueso); M (mediano) F ( fino); UF (ultra fino).
5. Ultrafiltros
Son los hechos a base de colodión, que se obtiene
disolviendo piroxilina en una mezcla de una parte de alcohol y
tres de éter. Sirven para separar partículas coloidales.
La filtración se usa para esterilizar líquidos que se des•
truirán por el calor: por ejemplo, algunos medios de cultivo.
suero. toxinas bacterianas, etc.
4. Centrifugación
Con el fundamento de que aprovechando la gravedad in•
tensificada artificialmente y a través de un movimiento circular
centrifugo; logramos que todas las partículas ,;e precipiten al
fondo de un tubo cónico (sedimento) quedando un líquido claro
y estéril (sobrenadante); esto a través de sucesivas e intensas
centrifugaciones.
5. Ultrasonido.-
Utilizado a frecuencias superiores a 15.0<.X) vibraciones
por segundo, llegan a desnaturalizar las proteínas además de
provocar un desorden en la arquitectura molecular determinan•
do la destrucción de las bacterias.
L. FLUJO LAMINAR.-
Consiste en un fluído mecánico donde la operación es más
favorable si la viscosidad del fluído esta incrementada: para
esto se utiliza una pantalla de entrada y otra de salida. llegando
a obtenerse una velocidad de paso de] aire de 0.45 m/seg.
En un quirófano aún esterilizado convencionalmente
puede haber unas 250.000 partículas por litro de aire: con la
pantalla de flujo laminar, estas partículas pueden reducirse de
40 a 400 por litro de aire. El flujo laminar puede ser vertical,

64
horizontal y oblicuo, según donde se coloquen los paneles de
entrada y salida de aire.
M. FRIO.-
No es un método de esterilización sino más bien de con•
servación (generalmente a 4ºC).
N. LIOFILIZACION.-
La liofilización es la deshidratación de un producto al va•
cio y a bajas temperaturas; así pues prácticamente llega a este•
rilizar, aunque es más bien utilizada como procedimiento de
conservación.
Ñ. CLASIFICACION DE LOS AGENTES QUIMICOS.•
Los compuestos químicos serán clasificados por razones
didácticas, en función a la clasificación propuesta por Jawetz,
l. Alcoholes.-
Donde tenemos el alcohol etílico 70% (CH3 - CH2 OH) e
isopropílico ([CH3]2 CHOH) 40% en solución acuosa. El
alcohol yodado al 0.5 ó I % es un buen antiséptico.
2. Fenoles-
Tenemos el fenol y a muchos compuestos fenólicos en una
concentración del 1 al 5% en solución acuosa. Los derivados
fenoíícos como el creso]. clorofenol y resorcinol pueden ir
uni• dos a jabones. Entre los difenoles tenemos al
hexaclorofeno donde además hay 6 átomos de cloro, también
va unido aja• bones.
3. Iones de metales pesados.-
Las sales de mercurio, plata y cobre se emplean a bajas
concentraciones. El mercurio combinado con compuestos
orgánicos (mercurio cromo) y el merthiolate son excelentes an•
tisepticos para uso externo.
COONa
[.

Merthiolate C2 H5 Hg S ~ por esto se des-

compone por la luz, se debe guardar en frascos topacio.

65
 Mercurocromo (dicromo oxim ercuro fluoresceina) puede
algunas veces estar contaminado por bacterias ácido - alcohol
resistentes.
4. Agentes
Oxídantes-
Entre los agentes útiles tenemos al Peroxido de hidrógeno
(agua oxigenada) yodo, Hípoclorito de Sodio (1 :8, 1 g/L, l O
g/L), cloro, permanganato potásico, etc.
5. Agentes
Alquilizantes:
Tenemos el formol (40%), la forrnalina al 37% y el
óxido de etileno (C2H40) que por ser un gas explosivo se
inactiva al mezclarlo con C02 al 90% o con fluorocarbono.
6.
Detergentes-
Son compuestos que tienen la particularidad de
concen•
trarse en las interfases. Se clasifican
en:
a. Aniónicos:
Detergentes en los cuales el hidrocarburo de cadena larga
tiene CARGA NEGATIVA. aquí se incluyen a los jabones
(sales sódicas de acidos carboxüícos de cadena larga),
también
a productos sintéticos similares a los jabones donde el
grupo carboxilico es reemplazado por un grupo sulfónico y
finalmente a las sales biliares. en las cuales la porción
liposoluble tiene es• tructura esteroide.
b. Catiónicos
Obtenidos de la combinación del residuo soluble en
grasa con un átomo de nitrógeno cuaternario el cual le dá ta
CARGA POSITIVA.
7. Mecanismos de
Acción.-
Los agentes antibacterianos pueden actuar de muchas
maneras; siendo las formas clásicas las descritas a
continua• ción:
66
 a. Coagulación de Proteínas>
Las proteínas bacterianas. existen en un fino estado
coloi• dal disperso, si el agente actúa drásticamente puede
llegar a coagular dichas proteínas inutilizándolas
funcionalmente.
Ejemplo: calor, alcoholes, fenoles.
b. Rompimiento de la pared o de la membrana celular.•
Así las sustancias que se concentran en la superficie de la
célula provocan alteración de la tensioactividad; alterando
las propiedades físicas y químicas de la membrana,
impidiendo su función, destruyendo así a la bacteria
Ejemplo: jabones, detergentes.
c. Remoción de grupos sultbidrilos libres:
Las enzimas proteícas que contienen cisteína, tienen cade•
nas laterales que terminan en grupos sulfhidrilo, además de
la coenzima A. Así pues si se quiere estas cadenas laterales
repre• sentan la puerta de activación para la reacción posterior
con el subtrato, pero si el agente antibacteriano reacciona
con estos grupos sulfnidrilos veremos que forma uniones
disulfuro deter• minando un "cierre" de estas cadenas y por lo
tanto la no acti• vación del substrato o pueden bloquear estos
grupos sulhidrilo al reaccionar químicamente con ellos; de
cualquier manera se produce el "cierre" de esta puerta.
-2H
R - SH + HS - R --t R - S - S - R
Puerta "Cerrada"

RR - SH
+Hg
C!
/ --t
R
s"" Hg + 2 HCI

"" Cl /
R SH R - S
Puerta "Cerrada"
67
 Ejemplo: agentes oxidantes en el primer caso. mercurio
en el segundo caso.
d. Interferencia química de reacciones
metabólicas
Donde el agente antibacteriano compite con el
sustrato, combinándose con una enzima por su afinidad
química con res• pecto a un sitio esencial de la enzima.
determinando la interfe• rencia de la reacción metabólica
con la consiguiente destruc• ción de la bacteria.
Ejemplo: Los Dinitrofenoles,
O. CONCLUSIONES.-
Podemos indicar para terminar que es ideal seguir ciertos
criterios óptimos para que el agente antibacteriano actúe
co• rrectamente . tales como el hecho de que actúe sobre pocas
bac• terias (lavado previo), que la concentración sea la
adecuada, que no hayan substancias que lo inacuven, que el
tiempo de acción sea el correcto y seleccionar el agente
teniendo en cuen• ta que los efectos secundarios sean mínimos.

68
 Incinerador

QJ
'O
e
:Q
.!/l
.~ Flameado Autoclave
¡g
:)

69
 CAPITULO V

MEDIOS DE CULTIVO

A.
DEFINICION.-
Un medio de cultívo se define como el sustrato
estéril que reúne características físico-químicas a través
de las cuales vamos a lograr el desatollo y crecimiento de
los gér• menes.
Muchas veces podremos detectar ciertos mecanismos
me• tabólicos traducidos en· reacciones bioquímicas que en
su mo• mento abren la puerta al diagnóstico. Por otra parte las
carac• terísticas físico-químicas de ahora en adelante las
denominaremos simplemente corno factores de crecimiento.
B. FACTORES DE
CRECIMIENTO.-
Son aquellos fenómenos físicos y químicos que encuadra•
dos en un marco obviamente biológico van a determinar la
su• pcrvivcncia y continuidad vital de los microorganismos.
l. Nutrientes.-
Los nutrientes para las bacterias son proporcionados
de acuerdo a sus exigencias. Aquellos microorganismos que
uti-
1 izan metabolitos orgánicos se denominan organotroficos;
y
los que utilizan metabolitos inorgánicos; litotróficos. En la
naturaleza los seres vivos de acuerdo a su fuente de
energía y carbón se los clasifica así: fototrofos y
quimiotrofos.
a. Nitrógeno.-
 A partir de sales inorgánicas de nitrógeno. ej.: nitrato
potásico (KN03) y de productos orgánicos:

71
 b. Azufre y Fósforo.-
Ambos de productos orgánicos, el azufre lo obtienen de
vegetales y el fósforo a partir de sales del ácido fosfórico, fosfa•
tos.
c. Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Cu, Co:
También son útiles de acuerdo a sus exigencias.
d. Vitaminas.-
El empico es variable, pero debemos indicar que algunos
gérmenes sintetizan sus propias vitaminas mientras otros neces•
itan de vitaminas preformadas.

CUADRO N!! 1
PRINCIPALES FUENTES DE ENERGIA
Y CARBON PARA EL CRECIMIENTO
DE BACTERIAS
FUENTE DE FUENTE DE
ENERGIA CARBONO

FOTOTROFO
autótrofo LUZ CO2
heteró1rofo LUZ COMPUESTO
ORGANICO

QUIMIOTROFO CO2
autótroto OXIDACION DE
COMPUESTO
INORGANICO
He1eró1rofo OXIDACIONDE COMPUESTO
COMPUESTOS ORGANICO
ORGANICOS

e. Agua.-
En el caso de las bacterias, lodos los nutrientes deben estar
en solución para que puedan penetrar en el organismo.

72
2. pH.-
La concentración de hidrogcniones es también importante
pues si no ajustáramos este factor de acuerdo al gérmen, no ob•
tendríamos su desarrollo. El pH más utilizado varia en un ran•
go de 6.0 a 7.5 precisando la mayor parte de las bacterias un pH
de 7.2; sin embargo esto no excluye la existencia de otros mi•
croorganismos que requieren un pH francamente ácido, tales el
caso de los bacilos -thiooxidans- que viven en un pH de 2, ó el
caso del Vibrio cólera que vive en un pH de 8.5
3. Temperatura.-
Para obtener un desarrollo óptimo será necesario que to•
memos en cuenta el tipo de gérmen que estamos manipulando
en función a la temperatura precisada. Los psicrófilos viven a
una temperatura inferior a 15ºC. los termófilos lo hacen a tem•
peraturas superiores a 50ºC y los mesófilos que requieren de 30
a 37ºC.
En Bacteriología médica revestirán mayor importancia los
gérmenes mesófilos.
4. Respiración.-
En base al tipo de respiración dividimos a las bacterias en
tres grandes grupos a saber:
a. Gérmenes aeróbicos:.-
Aquellos que precisan del oxigeno molecular como acep•
tor final de hidrógeno. un ejemplo lo constituye el micobacte•
rium tuberculosis.
b. Gérmenes anaeróbicos.-
Aquellos qu precisan de un compuesto inorgánico dife•
rente del oxígeno (nitrato. sulfato, carbonato. etc.) como aceptor
final del hidrógeno. Un ejemplo es el género Clostridium.
c. Gérmes anaeróbicos facultativos.-
Aquellos que pueden usar el oxígeno o compuestos inor•
gánicos como aceptores finales de hidrógeno. Escherictua coli
es el representante de este grupo.
73
5. Concentración salina.-
Asímismo es importante dotar de cloruro de sodio (Cl
Na) al sustrato ya que de esta forma lograremos una interrela•
ción óptima del gérmen con su medio ambiente respecto a las
funciones de intercambio y transporte de la membrana bacteria•
na.
Además de que predisponemos las circunstancias para el
siguiente factor de crecimiento.
Por otra parte indicaremos que la concentración estandard
de CINA es de 0,4 a 0.5 %. en un medio de cultivo en el cual
desarrollen gerrnenes comunes; sin embargo existen otros mi•
croorganismos que resisten hasta una concentración del 10%,
a estos les llamamos halodúricos (estafilococos) y hay otros
que resisten concentraciones susperiores al 10%, a estos les lla•
mamos halófilos.
6. Presión osmótica.-
Es otro requisito que debe ser ajustado en función al Cl
Na, y así pues quedará determinado todo el juego de procesos
de intercambio de la membrana bacteriana.
Los microorganismos que necesitan de altas presiones
osmóticas se denominan osmófilos,
7. Presión atmósferica.-
Normalmente este factor no incide mayormente ya que to•
dos los gérmenes de importancia médica pueden vivir a las
presiones que nosotros lo hacemos sin embargo hay otros mi•
croorganismos que viven en profundidades marinas abisales
donde la presión es mayor denominándose estos barófilos.
8. Luz.-
Muchos gérmenes precisan de luz para desarroJlar pig•
mentos en sus colonias, estos son llamados totocrornogcnos
(Micobactcrium kansassi).
74
9. Obscuridad.-
Otros microorganismos precisan de obscuridad para
de• sarrrollar su pigmentación en las colonias, a éstos
llamamos es• cotocromógenos (Micobacterium tlavescens).
C. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.•
Podemos clasificarlos a partir de tres criterios corno ser:
el estado físico, su procedencia y su finalidad bacteriológica.
1. Por el estado físico.-
a. Medios de cultivo líquidos.-
Aquellos que son fluidos, libres de Agar (Caldos. etc.).
b. Medios de cultivo sólidos.-
Aquellos que poseen en su constitución un solidificante
(agar) que se halla en una concentración de 1 % ó mas.
c. Medios de cultivo semisólidos.-
Aquellos que poseen en su consütucion agar pero en una
concentración inferior al 1 %. Otros autores también indican
que un semisólido es aquel que posee en su formulación un
solidifi• cante que no es el agar.
2. Por su Procedencia.-
a. Medios de cultivo naturales.-
Son aquellos que provienen directamente de dos reinos
de la naturaleza (animal, vegetal) en realidad se refiere a
líquidos e infusiones que en determinado momento pueden ser
utilizados para el desarrollo de bacterias.
Así podemos utilizar la leche de vaca, ciertos líquidos
orgánicos, o en su defecto infusiones de vegetales a partir
de los cuales también logramos el desarrollo de
microorganismos.
Obviamente estas consideraciones son hechas en parte,
como homenaje a los primeros investigadores que
trabajaron con este tipo de medios de cultivo (Koch. Pasteur,
etc.) y como
75
una opción para aquellos espíritus inquietos que a través de
estos procedimientos perfeccionándolos. pueden darles utili•
dad.
b. Medios de cultivo artificiales
Son aquellos químicamente definidos y que son
utilizados ampliamente en todos los Laboratorios
bacteriológicos. La for• ma de presentación está dada por
medios de cultivo deshidrata• dos que son fabricados en fonna
de polvo o en forma de granu• lado. Estos productos son
higroscópicos, es decir que tiene la capacidad de captar
rápidamente agua del medio ambiente; por este aspecto deben
mantenerse bien cerrados los frascos y al abrirse se deberá
contar con un ambiente seco.
Por término medio los frascos pueden ser
almacenados más o menos un año, posteriormente el contenido
debe conside• rarse inservible.
3. Por su Finalidad Bacteriológica.•
a. Medio basal.-
Es aquel cuya composición posee tan solo los
elementos básicos y elementales en la estructura de un medio
de cultivo. de esta forma se convierte en un sistema en el cual
va a desa• rrollar una gran gama de microrganismos.
Como ejemplo tenemos el agua de peptona y el
caldo nutritivo entre los líquidos. y el agar nutritivo
entre los sólidos.
b. Medio enriquecido>
Es aquel que en su composición posee una o
más substancias nutritivas que van a permitir el
desarrollo de gérmenes exigentes respecto a su nutrición.
Explicando en forma más sencilla no es nada más que un
medio basal al cual le vamos añadir una o más substancias que
van a enriquecer el medio original. Entre estos se cuentan al
caldo lactosado, caldo bilis buey y el agar sangre, etc.
76
 c. Medio selectivo>
Es aquel que en su composición posee una substancia inhi•
bitoria que tan solo va a permitir el desarrollo de un solo tipo de
gérmenes, evitando el desarrollo de otros microorganismos.
Generalmente el inhibidor será un colorante, un antibiótico o
un compuesto químico.
Ejemplos son el medio de Lowenstein - Jensen cuyo inhi•
bidor es el verde de malaquita, el medio de Sabouraud cuyo
inhibidor es la penicilina o el cloranfcnicol. etc.
d. Medio diferencial.-
Es aquel que posee en su composición una substancia in•
dicadora que va a diferenciar a los gérmenes a traves de reac•
ciones bioquímicas en virtud al metabolismo bacteriano: así
entonces en este medio de cultivo desarrollan todas las bacterias
pero son diferenciadas por el indicador.
El medio de Levine es un representante de este grupo
siendo su indicador la eosina azul de metileno (EMB), este
medio de cultivo posee un substrato que es lactosa de manera
que los gérmenes una vez sembrados (Enterobacterias) pueden
ser divididos en dos grupos, aquellos que fermentan lactosa
(colonias coloreadas por el EMB) y aquellos que no fermentan
lactosa (colonias incoloras).
D. FORMULACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO.-
La preparación de medios de cultivo es todo un arte
debido a que los comensales, que son los microorganismos, son
muy exigentes, por tanto el mayor cuidado es siempre para
satisfacer su nutrición, permitiéndonos así el estudio de sus
características funcionales como también morfológicas.
En realidad casi todas las recetas para cultivo parten de
medios básicos que contienen dos o tres elementos ricos en
proteínas y mctabolitos.

77
1. Medios Basales.-
a. Agua de peptona.-
Es este el primer ladrillo en el gran edificio de los medios
de cultivo. Su formulación es quizás una de las más sencilas:

Peptona I0-14 g
O Na 4-5 g
Agua destilada 1000 ce.

Si a esta fórmula añadimos 4- 6 g de extracto de carne

magra y libre de tendones y grasas tendremos automáticamente
formulado el medio de cultivo llamado caldo nutritivo.
Añadléndo agar 12 - 14 g. obtendremos el agar nutritivo.
El agar es un polisacarido que se obtiene de algas marinas
que son del orden de las Florideas, familia Gellidacea
(Gellidium spíníforme, G. Cartilaginium} que tiene la
particularidad de adoptar un estado I íquido a temperaturas por
encima de 45º C y un estado sólido a temperaturas por debajo
de ésta: básicamente sirve para dar consistencia y soporte al
medio de cultivo.
Otra de sus características es que puede ser esterilizado y
permite que se añadan otros productos sin interferir su acción.
2. Medios enriquecidos.-
b. Líquidos.-
1. Caldo lactosado:
Caldo nutritivo + 0.5 % de lactosa
2. Caldo sangre
Caldo nutritivo+ 7 - 10% de sangre desfibrinada de cone•
jo, camero o caballo.

78
 3. Caldo bilis buey
Caldo nutritivo+ 10- 20% de bilis buey.
4. Caldo glucosado:
Caldo nutritivo + 1 % de glucosa
c. Sólidus.-
L Agar lactosado
Agar nutritivo + 0.5% de Lactosa.
2. Agar sangre
Agar nutritivo + 7 - 10% de sangre desfibrinada de conejo,
camero o caballo.
3. Agar chocolate:
Es el a gar sangre sometido hasta una temperatura de
80ºC. de esta forma la hemoglobina se transforma en metahc•
moglobina. dándole el agar el aspecto de W1a tableta de choco•
late.
4. Agar bilis - buey:
Agarnutritivo + 10 - 15% de bilis buey.
S. Agar ascitis:
Agar nutritivo + líquido ascítico.
3. Medios Selectivos>
a. Medio de Lowenstein - Jensen
Este medio de cultivo no posee agar en su composición, en
lugar de este se utiliza fécula de papa y huevos completos que
son añadidos en la etapa final de la preparación.
El inhibidor es el colorante verde de malaquita, sirve para
que desarrolle Mycobacterium tuberculosis en forma selectiva.
b. Medio de Sabouraud:
Posee muchas variedades pero se trata de un preparado en
base a peptona. agar y 2% de glucosa, posteriormente se
le

79
añade penicilina, en su defecto estreptomicina y/o cloramfcni•
col y/o actidionc, En este medio desarrollan solo hongos, cum•
pliendo así su función los antibióticos de no permitir el desa•
rrollo de bacterias que acompañan normalmente a los
hongos de una muestra.
c. Agar Chapman:
Este medio de cullivo posee su inhibidor que e<; el
cloruro de sodio en una concentración del 7.5% es decir una
concentra• ción en la cual tan solo los estafilococos pueden
sobrevivir y desarrollar. Por otra parte este medio posee en
~u formulación manita que nos permite averiguar en una
segunda etapa si hay o no formación de ácido a partir de este
azúcar.
4. Medio Diferenciales.~
a. Medio de Levine (EMBJ:
En realidad este medio se definiría como selectivo pues
la Eosina - azul de metileno que posee inhibe a los
gérmenes Gram ( + ), sin embargo en base al desarrollo de
Enterobacterias y a partir de la fementación de lactosa que se
traduce por la pre• sencia de colonia pigmentadas (Lactosa+)
y colonias transpa• rentes (lactosa-) variación que finalmente
se debe a la reacción de la eosina y el azul de metileno
determinando la coloración o no, nos deciden a ubicarlo
como medio de cultivo diferencial, pues está diferenciando
por su comportamiento bioquímico a dos grandes grupos
de gérmenes Gram (-).
b. Agar Mac Conkey:
Es otro medio de cultivo que por la presencia de
sales biliares y violeta cristal puede definirse como selectivo
pues inhibe el desarrollo de gérmenes Gram (+). sin embargo
posee un sustrato importante que es lactosa de manera que
también podemos detectar la capacidad de las enterobacterias
para fer• mentarla y esto se hace patente por el viraje del
indicador de pH rojo neutro que nos demostrará finalmente
la fermentación o no de este azúcar.
80
E. CONSIDERACIONES GENERALES PARA LA
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.-
Como habíamos indicado ya. actualmente se trabaja
con medios deshidratados los cuales simplemente deben ser
resus• pendido en agua destilada. para 1000 mi cada medio de
cultivo tiene especificado que cantidad debe ser pesada. así
que si nece• sita preparar una cantidad di Ierente a los l 000
ml de base. tan solo deberá realizar una regla de tres
aritmética llegando al peso exacto que precisará.
La esterilización se efectúa en el caso de la gran
mayoría de medios de cultivo en autoclave, a una
presión de 1.5 atmósferas, 120!/C y por tiempo de 15
minutos. En el caso de que se especifique que el producto no
puede ser esterilizado en autoclave. se utilizará el sistema de
filtración.
Posteriormente, se envasa utilizando el sistema de
Caja Petri en caso de Medios Sólidos y tubos de ensayo en
caso de medios sólidos y líquidos, al igual que los medios semi
sólidos.
Las tapas de las Cajas Petri se dejan semiabiertas luego
de venir el medio aún caliente en la contratapa. ( 15-20 mi),
esto para evitar que se forme vapor de condensación en el
interior. Finalmente esperamos que baje la temperatura hasta
459C geli• ñcando el producto. envolviendo luego la Caja
Petri, en forma invertida en el papel Kraft o madera para
ser guardado en la sección de conservación de un
refrigerador. nunca los guarde en la sección de congelación.
debiendo calentarlos en una estufa de incubación o a la llama
de un mechero, por un tiempo pru• dencial. cada vez que tenga
que utilizarlos.
En caso de utilizar tubos de ensayo. si preparamos medios
líquidos, estos son trasvasados directamente a los tubos en
una cantidad promedio de 20 rnl.. de allí el camino es
similar a la Caja Petri, es decir que van a esperar a la
conservadora la oportunidad de ser usados.
 Si son medios sólidos siguen dos opciones. es decir que el
medio aún ca1iente (en estado líquido) es vertido en el tubo.
éste
81
se deja reposar en una gradilla, de manera que cuando la
temperatura disminuye por debajo de 45ºC. el producto
solidifica adoptando la forma del tubo y ocupándolo más
o menos en 1/3 de su longitud. a esta tecnica la llamamos
"Agar en pie".
La segunda opción es que el medio aún caliente es
vertido en el tubo y éste luego es reclinado sobre un soporte
dándole una inclinación de más o menos 30º. así pues el
producto tenderá a salir del tubo sin embargo por el declive
formado y la longitud del recipiente solo llega a cubrir los 2/3
o un poco más del tubo de ensayo. Luego de producirse la
gelificación el medio es llamado "en declive" o más
comúnmente es conocido como agar en "pico de flauta".
Después seguirán el destino de los anteriores medios
de cultivo ya mencionados.
La cantidad es de 15-20 ml en el caso de ambas técnicas,
y se debe tener mucha precaución con los tapones ya sean
de algodón o de otro material.
En muchos casos se debe obtener el valor del pH del
producto, cuando la temperatura es de 45ºC, o cuando se está
realizando la preparación de los componentes, para esto
utilizaremos un determinador de pH cuyo uso se ha
generalizado y es aquel que posee sistemas de electrodos; en
caso de que el pH · se hubiese acidificado
utilizamos neutralizadores del tipo de los hidróxidos y si
hubiese sucedido lo contrario usamos ácidos.
F. TABLA DE MEDIOS DE CULTIVO Y GERMENES
QUE DESARROLLAN EN ESTOS:
l. Agua de peptona:
Desarrollan casi todos los gérmenes excepto los exigentes
respecto a nutrientes y los anaerobios.
2. Caldo nutritivo:
Similar al anterior
82
3. Caldo sangre:
Desarrollan óptimamente neumococos, estafilococos,
es•
treptococos.
4. Caldo azida púrpura bromo cresot:
Desarrollan entcrococos.
5. Agar nutritivo:
Similar al caldo nutritivo.
6. Agar sangre:
estreptococos, estafilococos, neumococos. hacmophilus.
7. Agar chocolate:
ne isscrias.
8. Medio de Thayer Martin:
neisserias.
9. Medio de Levine (EMB):
cnterobacterias.
10. Medio de Mac Conkey:
enterobacterías
ll. Medio T.S.I.:
enterobacterias (diagnóstico bioquímico)
12. Medio Krumwiede:
entcrobacterias (diagnóstico bioquímico)
13. Medio azida púrpura Bbromo cresol:
enterococos.
14. Medio S.S.:
salmonellas • shigellas.
15. Medio G.S.P.:
pseudomonas -
aeromonas.
83
16. Agar y caldo urea:
Proteus (diagnóstico bioquímico).
17. Medio de Wilson Blair:
Salmonellas.
18. Medio bilis verde brillante:
Enterobacterias.
19. Medio Endo:
Enterobacterias.
20. Caldo MR - VP:
Enternbacterias (diagnóstico bioquímico).
21. Medio de Clark - Loobs:
Enterobacterias (diagnóstico bioquímico).
22. Medio de Loefler:
Coryncbactcrias.
23. Medio de Macleod:
Corynebactcrias.
24. Medio de Bordet- Gengou:
Bordetellas.
25. Medio SIM:
Entero bacterias (diagnóstico bioquímico).
26. Agar Cetrimide:
Pseudomonas.
27. Medio de Sabouraud:
Hongos.
28. medio de Baird - Parker:
Estafilococos

84
29. Medio de Chaprnan:
Estafilococos
30. Medio de Tioglicolato:
Anaerobios
31. Medio de Brewer:
Anaerobios.
32. Medio Muller - Hinton:
Neisseria y Antibiograrna.
33. Medio de Lowenstein - Jensen:
Mycobacterians.
34. Medio de Korthof:
Leptospiras.
35. Medio de Stuart:
Para transporte de gérmenes.
36. Caldo Tarozzi:
Anaerobios.
37. Agar y Caldo Soya Tripticasa:
Bacterias exigentes.
38 Agar y Caldo Brain Heart Infusión:
Bacterias exigentes.
39. Stone - brink:
Micobacterias.
40. Caldo indol:
Enterobacterias (Dx, - bioquímico).
41.Citrato Simons
Entcrobacterias (Dx - bíoquímico).

85
42. LJ~A.:
Emerobacterias (Dx - bioquímico).
43. Kligler:
Enterobacterias (Dx - bioquímico).
44. Skirrow:
Campylobacterias
.
86
 CAPITULO VI

METODOS DE SIEMBRA -
LECTURA E INTERPRETACION
DEL DESARROLLO BACTERIANO

A. DEFINICION.-
Siembra es la técnica y/o procedimientos que permite
co• locar la muestra, sobre el medio de cultivo para cumplir un
ob• jetivo:· el aislamiento de microorganismos.
B. CONSIDERACIONES GENERALES DE LA
SIEMBRA.-
Debemos apuntar que en primer lugar el inóculo
destinado a la siembra debe ser cuanti - cualitativamente
óptimo. por otra parte se debe elegir un medio de cultivo de
acuerdo al germen en cuestión y se debe asegurar un
procedimiento racional en la manipulación del inoculo.
Si hablamos de medios de cultivo sólidos, tenemos
que considerar aún otro punto más y es que el método de
siembra elegido debe asegurar el aislamiento de los
microorganismos: entendiéndose por aislamiento al conjunto
de procedimientos destinados a obtener la individualización
de un gérmen a partir de su desarrollo en forma pura en un
medio de cultivo. Y es este principio elemental que apuntala
el diagnóstico bacteriológico; pues solamente a partir de
gérmenes aislados podemos conti• nuar la marcha hacia otros
procedimientos laboratoriales,
Desde este punto de vista el método de siembra puede ser
cualquiera, inclusive puede el practicante crear una nueva
técni• ca de sembrado, siempre y cuando cumpla el requisito
antes es• tablecido.

87
 Por otra parte el procedimiento sea cual fuere , debe ser
realizado cuidadosa y delicadamente, es decir que la siembra
debe Llevarse a cabo en superficies simplemente "acariciando"
con el instrumento elegido.
Finalmente toda manipulación de microorganismos
debe ser hecha "previniendo la infección y no contaminando".
C. CLASIFICACION DE LOS
METODOS OE SIEMBRA
La realizamos a partir del tipo de medio de cultivo.
toman•
do en cuenta su estado físico.
l. Siembra en caja Petrk-
a. Agotamiento.-
Utilizarnos el asa bacteriológica o hisopo; si vamos
a trabajar con asa esta debe ser previamente flameada a la
llama de un mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
posteriormente la enfriamos en un recipiente que contenga
agua destilada estéril, o en su defecto en un borde del medio
de cultivo. luego tomamos la muestra y cerca a la
llama del mechero, procedemos a destapar la Caja Petri,
solo lo suficiente para que penetre el asa bacteriológica.
colocamos enseguida el inóculo en un extremo del medio de
cultivo, para después con movimientos suaves y delicados
proceder a desparramar la muestra sobre el medio.
tocándolo y describiendo movimientos en zig-zag hasta cubrir
toda la superficie con un solo trazo.
Luego extraemos el asa bacteriológica y volvemos a
flarnearla, enfriándola y guardándola finalmente.
El principio de esta técnica y de todas las que vamos
a describir es simplemente agotar la muestra a través del
"paseo" sobre el medio de cultivo; si matizamos con un
ejemplo apuntaremos que esto es similar a lo que sucedería si
le damos a una persona un bote de pintura y brocha, y luego le
indicamos que vaya pintando una linea sin fin en una pared, al
principio el trazo será grueso, luego a medida que se va
agotando la pintura
88
de la brocha, el trazo será delgado y finalmente quedarán mar•
cadas en la pared tan solo pequeñas gotas del colorante; es
ésto lo pretendido con los microorganismos. es decir que en el
ul• timó sector de la Caja Petri donde sembremos queden
gérmenes únicos depositados, los cuales luego de un tiempo
prudencial y a través de sucesivas fisiones binarias darán
como resultado la formación de una COLONIA, o sea una
familia de microorga• nismos similares que proceden de uno
viable e independiente. así pues está cumplido el requisito del
aislamiento.
b. Cuadrantes.•
También es una técnica basada en el agotamiento; solo
que en este caso dividimos la Caja Petri en 4 cuadrantes, de
igual forma flameamos y enfriamos el asa bacteriológica y
tomamos la muestra. para luego proceder a sembrar en el
primer cua• drante por agotamiento. inmediatamente,
pasamos al segundo cuadrante, sin volver a cargar el asa. de
igual fonna sembramos por agotamiento pasando
sucesivamente al tercer y cuarto cua• drantes. reiterando
recargaremos el asa, luego de un lapso de tiempo veremos el
desarrollo de colonias individualizadas en el tercer y cuarto
cuadrantes.
c. Por radios.-
Con posterioridad al flameado y enfriamiento del asa,
se roma la muestra; está luego es depositada en un extremo
del medio de cultivo. para después proceder a realizar un
trazo a partir del inóculo hasta el otro extremo de la caja de
Petn, vol vemos al inocuro y realizamos un segundo trazo
paralelo al pri• mero tomando la misma dirección que el
anterior y así sucesi• vamente hasta cubrir toda la superficie
del medio de cultivo.
Tambien llegamos a asegurar el aislamiento con esta
técni•
ca que es cómoda y
práctica.
d. En pentágono:
 Una vez flameada y enfriada el asa. y después de tomar
la muestra (cargarla). el inoculo es colocado en un extremo
de la

89
AGOTAMIENTO CUADRANTES

RADIOS PENTAGONO

90
caja Petri procediendo a realizar trazos paralelos en un sentido,
quemando nuevamente el asa, ésta se enfría en un borde del
medio de cultivo donde no se ha sembrado y luego apoyando
sobre un extremo del anterior trazo realizar otro en diferente
sentido, así sucesivamente (sin volver a cargar el asa) hasta
for• mar un pentágono, los bacteriólogos usan esta técnica
para asegurar un mayor aislamiento generalmente a partir de
mues• tras de heces fecales.
e. Método de la placa vertida-
Esta técnica es particularmente útil cuando deseamos
sem• brar una muestra líquida; en primer lugar disponemos
de una caja Petri estéril y vacía, luego vertimos 10 mi. de
cualquier tipo de agar obviamente aún en estado líquido,
esperamos unos minutos y cuando la temperatura del medio
de cultivo dismi• nuya por debajo de 45<JC y adquiera estado
sólido añadimos la muestra líquida, puede ser l ml. de
acuerdo a la concentración que deseemos. Finalmente
añadimos los restantes 10 mi. del medio de cultivo a 50ºC.
tapando la caja Petri y describiendo con ella movimientos
elipsoidales a fin de que la mezcla sea óptima; al momento
de solidificar todo el conjunto, la caja debe ser incubada para
obtener el desarrollo esperado.
Otra modalidad más sencilla se basa en utilizar una
caja Pctri estéril vacía a la cual colocamos l ml. de muestra
o el volúmen requerido, posteriormente procedemos a vertir
20 ml. de medio de cultivo a SIJ'C imprimiendo movimientos
elipsoi• dales suaves sobre la superficie del mesón a fin de
dispersar bien la muestra, posterionnente y cuando se
produzca la solidi• ficación del medio de cultivo, la siembra
estará concluída.
f. Método de inundación>
Tenemos una pipeta de Pasteur estéril, la cargamos con la
muestra líquida y posteriormente procedemos a descargar
sobre la superficie del medio de cultivo, con movimientos
suaves, ha• cemos que esta bañe todo el medio, dejando
reposar la Caja Pe• tri, a fin de que los gérmenes queden
adheridos y se evidencia
91
su desarrollo en determinados lapsos de tiempo. También po•
demos dispersar el inoculo con la ayuda del asa de Drigalski.
g. Método del cargado.-
Esta técnica es útil en el caso de muestras de piel, pelo,
uñas, básicamente consiste en depositar las descamaciones de
piel. trozos de uña o pelos, directamete sobre la superficie de un
medio de cultivo selectivo.
2. Siembra en tubo de ensayo.-
Aquí tenemos a su vez dos probabilidades; siembra en me•
dio de cultivo sólido y en medio líquido.
a. Tubo con medio de cultivo sólido
A su vez se subdivide en otros dos grupos; asaber,
siembra en tubo "en declive" y en tubo "en pie".
1. Siembra en tubo con medio "en declive"
Se siembra con asa bacteriológica ó hisopo. Luego de ob•
tener la muestra procedemos a derapar el tubo, para lo cual usa•
mos el borde cubital de la mano aprisionando con el dedo
meñique el tapón, haciendo girar tan solo el tubo con la otra
mano.
Procedemos después a Harnear con dos o tres pases
rápidos sobre la Llama del mechero la boca del tubo, introduci•
mos el asa o el hisopo de tal manera que no toquen el medio de
cultivo ni las paredes hasta llegar al fondo del agar "en declive"
donde recién depositarnos la alícuota extrayendo el instrumento
utilizado, sembrando por agotamiento. Procedemos a flameada
boca del tubo para finalmente cerrarlo.
b. Siembra en tubo con medio "en pie">
En este caso se siembra con aguja bacteriológica. para
cuyo efecto procedemos tal y como se tratase del asa en el pro•
cedimiento del flameado y enfriamiento, luego destapamos el
tubo en la misma forma que se había explicado ames para des•
pués de obtenida la muestra, esta sea inoculada por picada,
es
92
decir puncionando el medio a nivel de su sector central pe•
netrando luego 2/3 de la columna: en seguida extraemos la
agu• ja y procedemos a cerrar el tubo.
3. Tubo con medio de cultivo líquido.•
a. Método de la agitación
Utilizamos como instrumento de siembra el asa bacterio•
lógica. una vez que tomamos la muestra procedemos a
destapar el tubo de ensayo con la técnica ya descrita.
Posteriormente in• troducimos el asa al tubo y sumergiendo el
instrumento empe• zamos a realizar movimientos de agitación
de manera que la muestra se distribuya en et medio
uniformemente. Luego ex• traemos el asa y procedemos a
cerrar el tubo con las precau • cíones y providencias ya
descritas.
b. Método del cargado.-
Es útil cuando usamos hisopo para obtener la muestra,
de esta forma lo introducimos suspendido de tal manera que
queda medio líquido pero sin llegar a tocar las paredes del
tubo ni tampoco posarse en el fondo; todo esto conseguimos
sujetando el hisopo por su sección superior al tapón del tubo.
Algunas veces el cargado se verifica sin lomar en
cuenta lo anteriormente expuesto, es decir simplemente se
procede a introducir el hisopo. de tal manera que este
puede estar apoyado e inclusive posado sobre el fondo del
tubo.
c. Método de la dilución.-
Sirve cuando deseamos sembrar muestras líquidas. para
esto utilizamos como instrumento de siembra una pipeta gra•
duada con la cual hacemos diluciones y posteriormente pipetea•
mos cantidades determinadas al tubo.
D. LECTURA DE
COLONIAS.-
Para realizar este paso, es importante que tengamos pre•
sente algunos conceptos;
93
METODOS DE SIEMBRA.-

i,
Agotamiento
Agitación
">
<

Por Picada Picada

Inundación Cargado
Dilución
94
l. Colonia.-
Familia de microorganismos similares que proceden
de uno viable y que conforman una agrupación visible e
indepen• diente.
2. Lectura macroscópica.-
Es el conjunto ordenado de observaciones acerca de las
diferentes características que posee el desarrollo y
crecimiento de un microorganismo en un sustrato.
Por otra parte será también necesario que el operador
po• sea una lente de aumento a fin de llegar a ver ciertos
detalles que normalmente pasarían inadvertidos.
E. MEDIOS SOLIDOS
l. Cajas Petri.-
Observamos las siguientes características que deben
ser consideradas en forma metódica y ordenado.
a. Forma.-

PUNTIFORME
o
CIRCULAR FILAMENTOSA

D
IRREGULAR RIZOIDE

95
 b. Superficie.-

COLONIAS SWARM

PLANA
; \
ELEVADA
C\
CONVEXA

CONCAVA UMBONADA

r\
UMBILICADA

o o o
c. Borde.-

DEFINIDO IRREGULAR
ASERRADO

r, < a
*
-;:!)
~.
FILAMENTOSO
RIZOIDE ONDULADO
96
 d. Aspecto.•
Húmedo
Seco
Brillante
Transparente
Opaco
e. Consistencia.•
Mucoide
Butirosa
Cérea
Cremosa
Pulverulenta
Granulosa
f. Pigmentación.•
Amarillo intensa
Amarillo Dorada
Anaranjada
Roja
Blanco aporcelanada. etc.
g. Tamaño.-
Medición del diámetro de la colonia.
h. Migración.-
Observar si se produce migración de los
microorganismos sobre la superficie de siembra.
i. Halo.-
Observar que sucede alrededor de la colonia, por
ejemplo en el agar sangre y tras la siembra de
estreptococos ver la hemólisis producida (tipo beta, alfa o
gamma).
97
 j. O lor.-
No es aconsejable oler los cultivos empero en algunos ca•
sos y protegidos por la llama de un mechero, podemos
percibir el tipo de olor que posea el microorganismo estudiado.
- Fecaloide
- Aromático dulzón
- Pútrido
- Amoniacal
2. Tubos de ensayo.-
La lectura debemos realizarla en base a dos técnicas,
ya sea agar en "declive" o "en pie".
a. En declive.-
(Pico de flauta) Si llegamos a observar colonias
aisladas vale toda la secuencia de lectura que hemos revisado
ya antes; sin embargo si el desarrollo no permite ver colonias
aisladas o si son muchas, entonces tan solo describiremos el
tipo de desa• rrollo obtenido.
l. Filiforme
2. Risoide
3. Equinulada
4. Pululante
5. Arborescente
6. Perlada (abundante)
b. En pie.-
Sirve para catalogar motilidad bacteriana. es así que en
es• tos casos el medio de cultivo habrá de ser sernisólido, en
otros casos utilizaremos un sustrato que permite observar
facultades bioquímicas de un gérmen en particular.
1. Filiforme
2. Irregular

98
LECTURA EN DECLIVE.-

al a2 a3

a4 a5 a6

99
LECfURA DE PIE.-

b1 b2 b3

b4 b5 b6

100
 3. Arrosariada
4. Arborescente
5. Vellosa (Rizoide)
6. Nula
3. Licuefacción de la gelatina.-
Es ésta una prueba que nos permite indagar la actividad
proteolítica de los gérmenes hacia la gelatina (proteína), enva•
samos también en la modalidad "En pie" y obviamente sembra•
mos por picada. A partir de la licuefacción de este sustrato reali•
zamos la lectura.
a. Nula
b. Crateriforme
c. Napiforme
d. Infundíbuliforme
e. Saculada
f. Estratiforme
F. MEDIOS LIQUIDOS.-
En medios de cultivo líquidos no podemos observar co•
lonias, pero si podemos ver el desarrollo y crecimiento
bacterianos en base a los siguiente parámetros que deben ser
siempre valorados.
l. Formación de película en la parte superior del medio de cul•
tivo determinando sus caraterístícas, es decir si mantiene su in•
tegridad después de la agitación del tubo. si vuelve a aparecer de•
spoés de agitarlo, si es adherente o no.
Por otra parte veremos si es una membrana granulosa, limpia o
sucia y finalmente si fonna un anillo bien definido.
2. Observamos la turbidez del medio líquido, es decir, si se pre•
senta turbidez regular. flóculos que ocupan constantemente el
tubo o si tan solo se presentan ai agitar el mismo.
3. Estudiamos el sedimíento y sus características o sea si éste es
fino, granuloso, lamináceo, algodonoso.

101
LICUEFACCION DE GELATINA.-

T
3a 3b 3c

3d 3e 3f

102
4. Color.
5. Olor del medio de cultivo a partir del desarrollo
bacteriano. aunque no es aconsejable.

n
~ . '.

PELICULA TURBIDEZ SEDIMENTO

a. Producción de gas.-
En ciertas pruebas bioquímicas es necesario verificar si
se produjo gas o no en el medio de cultivo a partir de la acción
mi• crobiana. para ello utilizamos un artefacto llamado
"campana de Durham", donde observaremos o no la presencia
del gas.

;.::~~~:::.~
.

m §m
~❖
> <
~ ~= ;-:
~-~ -❖
~·
❖

~ ❖' ❖

~fn~1
GAS NEGATIVO GAS POSITIVO
(-) (+)

103
 CAPITULO VII

TOMA DE
MUESTRA
A. DEFINICION.-
La toma de muestra es el conjunto de procedimientos des•
tinados a obtener una parte representativa cualicuantitativa•
mente a partir de un todo, en nuestro caso, el paciente, el medio
ambiente, etc.
B. CONSIDERACIONES
GENERALES PARA TOMAR
MUESTRA.-
). Debemos saber QUE vamos a tomar como muestra: esputo,
sangre, etc.
2. PORQUE vamos tomar la muestra (fines de diagnóstico.
investigación)
3. COMO vamos a tomar la muestra (punción, raspado, etc.)
4. DONDE vamos a tomarla muestra (faringe. piel. etc)
5. CUANDO vamos a tomar la muestra (pico febril, ayum, etc)
C. CARACTERISTICAS DE UNA MUESTRA.-
Debe tener las siguientes características:
l. Ser obtenida del lugar donde asiente la patología.
2. Generalmente tomada de los bordes de la lesión.
3. Ser cualitativamente óptima para su estudio.
4. Alcanzar cuantitiativamente un volúmen razonable.
5. En la mayoría de los casos ser de emisión reciente.
6. En algunos casos haber sido obtenida cuando el paciente está
atravesando determinadas instancias evolutivas de su patología.
105
7. Obtenida siguiendo criterios anatómicos y
funcionales.
8. Perfectamente envasada, evitando recipientes que
potencial•
mente puedan producir contaminaciones
accidental
9. Enviada inmediatamente al laboratorio para su estudio o
si tiene que transcurrir algún tiempo será enviada en
recipientes especiales o en medios de cultivo de transporte.
10. Obtenida con material esterilizado y en condiciones
de asepsia.
D. CLASIF1CACION DE LA TOMA DE
MUESTRA.-
La siguiente clasificación la hacemos en base a una pro•
puesta por el Dr. Nicolas Salazar, con algunas modificaciones
a fin de que sea más asequible al entendimiento y
comprensión del estudiante.
Así podemos clasificar la toma de muestra en tres grandes
grupos a saber:
l. Muestras
superficiales
2. Muestras de
cavidades
3. Muestras
especiales
Reiteramos, esta clasificación tan solo es didáctica.
a. Muestra superficiales.-
Aquí consignamos a las muestras de piel, pelo y uñas.
l. Piel.-
Tenemos dos posibilidades para obtener la muestra. ya
sea procediendo a "alzar" a los gérmenes con el asa
bacteriológica, por simple raspado ligero o con la ayuda de
bisturí proceder a raspar algo enérgicamente los bordes de la
lesión, de esta mane• ra no solo obtendremos los
microorganismos sino también las capas superficiales de la
piel. esto es provechoso en el caso de ciertas determinaciones.

106
 Finalmente puede ser que en determinados casos se pre•
senten nódulos los cuales están por debajo de la piel. siendo
más palpables que visibles: en este caso procedemos también a
raspar con el bisturí el lugar de la lesión llegando hasta el
nódulo de manera que una vez obtenida la pulpa. ésta puede
ser
procesada y así llegar a observar al microbio.
2. Pelo.-
También hay dos posibilidades, la primera cuando los
gér• menes se hallan localizados en el folículo piloso, en
este caso será suficiente proceder a raspar la región con el
asa bacterio• lógica previo lavado de la zona con agua
destilada. también se deberá arrancar el pelo a fin de aislar
al gérmcn a partir del fóliculo piloso.
La segunda posibilidad se verá cuando el tallo del
pelo esté atacado, (micosis) en esta situación procederemos
a cortar el pelo para su observación o posterior procesamiento
en culti• vo.
3. Uñas.-
También vamos a ver que se presentan dos técnicas,
de acuerdo al sitio atacado. La primera se utiliza cuando la
lesión asienta en el lecho ungueal, en esta técnica desplazamos
el asa bacteriológica, previo lavado de la región con agua
destilada, por el lecho ungueal con un solo trazo firme y
seguro.
Si la uña se halla atacada por microorganismos (hongos)
entonces procedemos a cortarla ayudados de un bisturí a fin
de continuar luego con el cultivo y el diagnóstico a través de
la mi• croscopia.
b. Muestra de cavidades-
En este capítulo estudiamos a las muestras de
mucosas. conducto auditivo externo, esputo, orina, heces
fecales.
l. Mucosas.-
El instrumento que sirve de común denominador en la
ob•
tención de estas muestras es el hisopo, es decir un aplicador
de

107
madera que posee en uno de sus extremos un engrosamiento de
algodón y que obviamente debe ser esterilizado.
Si vamos describiendo las mucosas de arriba hacia
abajo. encontramos lo siguiente:
a. Mucosa
conjuntival>
Usamos un hisopo estéril aunque algunas escuelas
prefieren utilizar el asa bacteriológica. luego ubi.camos
la conjuntiva infectada o aquella que presente mayor
exudado si la patología es bilateral; procedemos a ob•
tener la muestra a nivel de! angulo interno del ojo
afec• tado. El hisopado debe ser cuidadoso y suave para
no producir mayor traumatismo.
b. Mucosa nasal.:
De igual forma utilizamos un hisopo. si la lesión es vi•
sible a simple vista procedemos entonces a obtener la
muestra, si la lesión es mucho más interna. entonces
será necesario que un especialista la obtenga con íns•
trumcntal que nosotros ya no poseemos. Hay otras
oportunidades en que es preciso utilizar un cincel del•
gado y largo que podemos fabricar a partir de un suje•
tador de papel (clip) el cual es convertido en un alam•
bre rectilinco y posteriormente aplastando uno de los
extremos obtendremos un pequeño cincel. con el cual y
una vez esterilizado procedemos a raspar lesiones sos•
pechosas.
c. Mucosa
oral
En esta cavidad es sencillo Lomar cualquier muestra
pues tenemos gran visibilidad. así podemos observar
donde se localiza una lesión y posteriormente utilizan•
do el hisopo llevar a cabo la torna de muestra. Por otra
parte para fines de investigación podernos escoger
cualquier segmento de la mucosa oral puesto que ésta
posee una flora variada de.microorganismos.
108
 Para tomar muestras de los espacios interdentarios se
utiliza el clásico hilo estéril, el cual se introduce en
es• tos para recoger el sarro dental o cualquier otro
produc• to, procediendo luego a sembrar o realizar el
correspon• diente frotis,
4. Mucosa faringea.-
Aquí necesitamos de otro instrumento más y es el baja
lenguas. pues al utilizar este elemento vamos a hacer
que cumpla su función es decir, deprimir la lengua para
que de esta manera tengamos la visibilidad y la como•
didad para trabajar. posteriormente utilizamos el hiso•
po. siempre tomando en cuenta que antes de proceder
a esta técnica debemos utilizar un antiséptico para
reali• zar la asepsia de la cavidad oral (enjuague).
Podemos hisopar todos aquellos lugares que nos
interesan (Pi• lares anteriores. arn igdalas, etc.)
En otras circunstancias (difteria) se produce una pscu•
domembrana sucia adherente y resistente; en este
caso el operador debe protegerse con barbijo y
guantes, y luego munido de una pinza proceder a
arrancar esta pseudomembrana. a fin de obtener el
agente etiológico de los lugares de inserción de la
misma.
e. Mucosa genitat-
Debemos tratar por separado la mucosa genital mascu•
lina y la femenina.
1. Mucosa genital
femenina
Aún debemos considerar dos posibilidades más y son
aquellas que se presentan en el caso de una mujer con
himen intacto y otra que ya haya tenido contacto se•
xual. En la mujer con himen Intacto tan solo debemos
esperar que las secreciones se viabilizen al exterior
para así ser obtenidas.
109
En la mujer desflorada utilizaremos el espéculo, es de•
cir dos valvas que una vez Introducidas en el canal va•
ginal pueden ser separadas a voluntad, brindándonos de
esta forma un campo de acción y observación ideales
luego procederemos a hisopar las regiones
escogidas. haciendo hincapié en las vecindades del
orificio cervi• cal externo, pues allí se acumularán las
secreciones. En otras oportunidades se podran
observar chancros de inoculación a partir de los
cuales debemos tomar la muestra con aguja estéril o
Pipeta de Pasteur (ver más adelante).
2. Mucosa genital
mascultna-
Tenemos en primer lugar la presencia de un gran
exu• dado purulento a partir de la uretra en este caso
prote• gidos con guantes y luego de un aseo de la
región pro• cedemos a tomar la muestra munidos de
un hisopo, es decir que en cuanto tengamos la
aparición en el meato urinario del exudado. lo
recogemos con el instrumento antes indicado o
procedemos a hisopar la uretra con movimientos
delicados.
También puede presentarse chancros de inoculación
si• filítica o chancroides en la mucosa prepucial o
en el surco batano prepucial, no olvidando que
también pueden presentarse en otros sectores como
ser escroto. para obtener estas muestras debemos lavar
previamente la zona con agua destilada y siempre
protegidos con guantes, procedemos a puncionar el
chancro con aguja estéril o pipeta Pasteur,
inmediatamente comenzará a fluir un líquido
semiturbío, el cual deberá ser recogido en una lámina
porta-bojctos para su posterior estudio en
microscopio de campo oscuro o en un tubo de
hemólisis que contiene suero fisiológico estéril tibio.
Los condilomas planos luéticos también pueden ser
in•
vestigados en la misma
forma.

110
 3. Mucosa rectat-
Es muy útil su estudio en ciertos casos de disentería.
para el efecto colocamos al paciente en una posición
óptima que nos permita tener una buena observación de
la zona y además posibilidades de poder trabajar
cómodamente. La muestra es obtenida por hisopado de
la mucosa rectal. pudiendo previamente (en algunos ca•
sos) humedecer el hisopo en agua destilada estéril.
c. Conducto auditivo externo.-
utilizamos también un hisopo. pero en este caso debemos
tener en cuenta el criterio anatómico, y esto se explica por el he•
cho de que el conducto auditivo externo es un tubo que se dirige
de afuera hacia adentro, de arriba hacia abajo y de atrás hacia
adelante: en otras palabras describe un trayecto oblicuo, así que
en virtud a esta disposición, el momento de efectuar la toma de
muestra deberemos retraer el pabellón auricular de manera que
tengamos la entrada al conducto totalmente visible. luego debe•
mos medir por simple observación en el hisopo más o menos
dos centímetros (esto porque este conducto tiene una profundi•
dad de 1.5 a 2 centímetros) e introducirlo esta distancia poste•
riormente: finalmente procedemos a imprimir movimientos de
rotación obteniendo la muestra.
Hay que tener cuidado de no dañar la membrana timpánica
por acción brusca o introducción mayor a la profundidad
anatómica establecida.
d. Esputo.-
El esputo es la colección de secreciones patológicas prove•
niente del árbol tráqueo-hronquial.
La muestra podemos obtenerla a través de diferentes técni•
cas. entre las cuales citaremos las más importantes:
1. Forma natural de eliminación del esputo.-
Esta es la técnica más utilizada, se aplica a pacientes que
pueden entender y aplicar las instrucciones que se les dé.

111
 Entregamos al paciente un recipiente especial para esta
muestra y le indicamos que al despertar proceda a realizar un
enjuague bucal con un antiséptico o con bicarbonato de sodio,
luego debe proceder a expectorar directamente dentro del reci•
piente, llegando a acumular por lo menos tres esputos (flemas),
posteriormente se cierra herméticamente el envase y deberá
ser
enviado al laboratorio debidamente rotulado (nombre completo,
edad y sexo) además de la numeración correspondiente y fe•
cha).
2. Lavado gástrico.-
Esta técnica se practica en pacientes que no van a poder
realizar la anterior, es decir en niños (porque degluten el
espu• to), ancianos, enfermos mentales o finalmente mujeres
(porque también degluten el esputo).
Se procede a instalar una sonda naso-gástrica, se introduce
a través de ella 50 mi. de suero fisiológico y luego se extrae el
mismo volúmen, este procedimiento debe practicarse en ayu•
nas. Como se verá prácticamente se realiza un "enjuague" <le la
bolsa gástrica a fin de obtener microorganismos.
3. Lavado traqueal>
Esta técnica consiste en instilar suero fisiológico tibio ha•
cia el árbol tráquco-hronquial de manera que provoquemos el
acceso de tos al despertar o excitar este reflejo, en esta circuns•
tancia debemos estar bien protegidos con barbijo, gorro. mandil
y guantes.
4. Forma postural.-
Este método también es útil en pacientes que no pueden
eliminar en forma expontánea la muestra.
Procedemos a colocar al paciente en decúbito ventral so•
bre una camilla (o cualquier superficie que cumpla la misma
función) con una almohada debajo de la región abdominal, fi•
nalmente la cabeza quedará colgando en uno de los extremos de

112
113
 la camilla al igual que los brazos lateralmente; de esta forma
por simple acción de la gravedad las secreciones se
viabilizarán al exterior, cayendo directamente al recipiente.
5. Características del recipiente para recolectar esputo.-
a. La capacidad mínima será de 30 ml.
b. Debe tener boca ancha.
c. En lo posible tendrá sistema de rosca y tapa que ase•
gure con este sistema.
d. Estéril.
c. Debe ser construido de material cstcnlizable.
f. Tiene que consignar el nombre, y sexo del
paciente. además la fecha y el número de registro.
e. Orina.-
Nuevamente debemos tener en cuenta el criterio
anatómico y patológico. ·
Empezamos con un generoso aseo de las regiones vecinas
al meato urinario, este debe practicarse con agua tibia y jabón,
posteriormente nos planteamos una pregunta capital: ¿Dónde
asienta la patología? y así según la respuesta clínica adoptare•
mos una u otra técnica.
l. Técnica del chorro medio.-
Se usa cuando la patología se localiza en el sistema urina•
. rio superior.
Consiste en eliminar la primera parte de la micción y ob•
tener el resto de la orina. en el entendido de que si tomaramos
en cuenta desde la primera parte de la micción arraslrariamos
gérmenes que normalmente se hallan en el segmento inferior; lo
cual alteraría el resultado final del examen.
2. Técnica de recolección en 24 horas.-
Se usa cuando la patología está situada en los nnoncs.
Consiste en recolectar durante 24 horas toda la orina eliminada

1\4
de manera que aumentemos las posibilidades de coleccionar
el agente etiológico.
3. Técnica de la primera micción.-
Se usa cuando la lesión radica en las vías urinarias bajas.
Obtendremos la muestra en las primeras horas de
la
mañana; recolectando todo el volúmen de la micción, pues
así
recogeremos a los microorganismos causantes del cuadro
infec•
cioso que afecte a esté nivel.
4. Gota matinal.-
Esta muestra no corresponde a orina, pero la
describimos aquí por razones didácticas. Se trata de una
secreción producto generalmente de entidades patológicas
crónicas; el paciente pre• senta al despertar por la mañana,
exudado generalmente trans• parente y filante proveniente de
uretra.
A partir de esta muestra, podemos aislar gonococos,
tri•
chomonas, etc.
5. Características del recipiente para recolectar orína-
a. La capacidad mínima es de 250
ce.
b. Debe tener boca
ancha.
c. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con
este sistema.
d. Debe ser
esteril.
e. Debe ser construido de material susceptible de
esterilización.
f. De preferencia será transparente a fin de
observar ciertas características macroscópicas.
 g. Tiene que consignar el nombre, edad y sexo del pa•
ciente, además de la fecha y el correspondiente
número de registro.
f. Heces fecales.-
Tenemos dos probabilidades: -heces diarréicas y heces
sólidas.

115
 l. Heces diarréicas. -
En este caso obtenemos un volúmen similar al de una cu•
chara sopera lo que más o menos viene a ser una cantidad de 10
mi. Estas muestras deben procesarse dentro de un margen de
tiempo prudencial pues al acidificarse muchos gérmenes
patógenos se lisan.
2. Heces sólidos.-
Se toma un volúmen similar al de una pepa de durazno.
3. Características del recipiente para recolectar heces fe-
cales.-
a. Debe tener una capacidad mínima de 30 mi.
b. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con
este sistema, o en su defecto un tapón que asegure her•
méticamente.
c. En lo posible debe ser estéril. aunque se puede utili•
zar un envase bien lavado.
d. Podrá ser construido de material susceptible de
esterilización, (polipropileno, poticarbonato, vidrio).
e. No debe ser fabricado de cartón pues deshidrata las
muestras. En último caso se podrán utilizar recipientes
de cartón parafinado.
f Tiene que consignar el nombre, edad y sexo del pa•
ciente. además de la fecha y el correspondiente número
d~ registro.
E. MUESTRAS ESPECIALES.-
Consideramos a I as m ucstras provenientes de próstata,
ganglios, cavidades articulares. sangre y líquido céfaloraquideo.
l. Próstata-
En ciertas patologías que en forma aguda o crónica produ•
cen inflamación de este órgano es preciso obtener la muestra a
través de la técnica llamada: masaje prostático.

116
2. Ganglios>
Para obtener la muestra que se halla localizada en los
gan• glios linfáticos se procede a realizar la asepsia de la
región y luego se practica una punción. llegando de esta
manera a tomar el material atrapado en estas formaciones,
Posteriormente se podrá realizar los procedimientos
pertinentes de acuerdo a la sospecha bacteriológica.
3. Articulaciones.-
De igual forma en procesos sépticos o de otra índole. po•
demos tener la necesidad de obtener líquido intra-anicular,
de esta manera practicamos la artrocentesis con un trocar sobre
un estado previo de asepsia de la región escogida. Obtenida la
muestra realizamos un examen macroscópico y
posteriormente el resto del procesamiento microbiológico.
4. Sangre.-
Esta es una de las muestras más importantes de
obtener por el hecho de que muchas patologías pueden ser
diagnostica• das a través de un hcmocultivo siempre y cuando
medien ciertas circunstancias.
Una muestra de sangre se debe obtener cuando el paciente
esté atravesando por un estado febril, así asegurarnos la
presen• cia de microorganismos y su desarrollo ulterior en
los medios de cultivo.
El procedimiento es el tradicional. esto es realizar la
asep• sia de la región elegida, generalmente la red venosa de
la tle• x.ura del codo, en niños será a nivel de la yugular o en
recien na• cidos aprovecharemos el botón umbilical, el cual
puede ser utilizado para tomar esta muestra. La cantidad
mínima y nece• saria es de 10 mi. que son extraídos mediante
punción venosa. Existen desde las jeringas, sistemas
"vacutaincr", hasta reci• pientes especiales que no solo
permiten la toma de muestra sino que además poseen ya el
medio de cultivo.

117
5. Líquido Céfalo-Raquídeo.-
Esta muestra se obtiene a partir de una punción
lumbar que se practica entre el 3cr y 4to. espacio intervcrtebral
lumbar.
Esta es una técnica prácticamente operatoria y se la debe
realizar con todos los cuidados necesarios teniendo en
cuenta las contraindicaciones (hipertensión intracrancal).
La cantidad necesaria es de 3 - 5 ml. y siempre se debe
realizar un estudio macroscópico antes de entrar al estudio
mi• crobiológico. La previsión más importante es de
procesar el líquido cefalo raquídeo dentro de un margen de
tiempo mínimo desde la toma de muestra, pues muchos
gérmenes se lisan trans• cunido cierto lapso de tiempo:
dándonos de esta manera un re• sultado falso negativo.
F. CONCLUSION.-
No solo se puede obtener muestras de los segmentos men•
cionados, en determinado momento cualquier región del
cuerpo humano se presta a ser tributaria de este procedimiento.
Una vez más realzamos la importancia de poder
recolectar las muestras en forma eficiente. todo esto en pro de
un trabajo microbiológico correcto.

118
 CAPITULO V 111

TINCIONES GRAM Y
OTRAS

A. DEFINICION.-
Una tinción bacteriológica es el conjunto de procedimien•
tos destinados a poner de manifiesto morfología y estructura
bacterianas a través de sustancias químicas llamadas
colorantes.
B. COLORANTE.-
Es una sustancia coloreada que es capáz de teñir (reaccio•
nar químicamente) a elementos vegetales y animales.
Los colorantes pueden dividirse en dos grandes grupos:
1. Colorante sustantivos>
Aquellos de naturaleza coloidal y que tiñen directamente
a la estructura.
2. Colorantes adjetivos.-
Aquellos que precisan de un mordiente para poder teñir la
estructura.
C. MORDIENTE.-
Es aquel fenómeno físico o químico que permite
reaccio• nar al colorante con la estructura, es un puente
químico que se establece entre ambos, de manera que el
primero está capacita• do para reaccionar con esta útirna,
manteniéndo luego ligado el colorante, asegurando así una
tinción permanente.
Los mordientes químicos pueden ser básicos (sales
férricas de aluminio o de potasio) o ácidos (ácido tánico).
119
D. TEORIA ACERCA DE LA COLORACION.-
1. Física.-
Indica que la tinción de una estrutura se produce en base a
fenómenos físicos de absorción. adsorción y capilaridad de los
colorantes, además de la Osmosis.
2. Química.-
Se basa en las reacciones moleculares e iónicas que
se producen entre los colorantes y las estructuras. Una
opción mixta está enmarcada dentro de los criterios físicos y
químicos.
A partir de estos conceptos podemos definir una
reac• ción físico-química como base del fenómeno tintorial;
sin em• bargo podemos entrar más en la intimidad de este
suceso y apuntar que la constilución bacteriana conserva
proteínas y aminoácidos los cuales se comportan como
ácidos o como bases, este es el fundamento para que se
denominen sustancias anfoteras a las proteínas; esto nos da
la posibilidad de que aprovechando la ionización de las
proteínas y colorantes, se puede llegar a reacciones químicas
en las que como es lógico pensar los colorantes que se ionizan
en átomos o moléculas de carga positiva reaccionarán con
estructuras celulares que po• sean cargas negativas y
viceversa.. Además aprovechando el mismo sentido de la
reacción podemos indicar que los colo• rantes que se ionizan
como bases. reaccionarán con porciones celulares ácidas.
a. Los colorantes acidos.-
Están estructurados por nitrocompuestos, sales sódicas de
ácidos carboxílicos y sulfónicos.
b. Los colorantes básicos.-
Están compuestos por grupo amino que se unen a los
ácidos para formar sales.
En Bacteriología vamos a utilizar esencialmente colo•
rantes básicos; esto porque los elementos que vamos a teñir,

120
corresponden a las células procariotas. es decir aquellas que no
poseen membrana nuclear que delimite el material del uuclco
(Cromosomas, jugo nuclear, etc.) ni estructuras membranosas.
De esta manera hallarnos al cromosoma bacteriano des•
nudo en la matriz ciroplasmática así pues los ácidos nucleícos
se hallarán dispersos en el citoplasma. determinando un estado
de ionización ácida, lo que dará por resultado una apetencia de
estas estructuras por los colorantes básicos.
Todo colorante posee dos grupos químicos responsables
en último caso de la ionización y posterior reacción:
l. Grupo auxocromo:
El compuesto coloreado para ser colorante (capacidad de
disociación y reacción) debe poseer propiedades alcalinas o
ácidas, estos comp1ejos son los auxocromos.
Son grupos auxocromicos los siguientes: - OH. -OR. SH,
-NH2. NHR, -NR2.
2. Grupo cromóforo.-
(Cromo = color: foro= llevo) uno o más grupos no satura•
dos determinantes de color:
Estos grupos son los responsables primarios de la colora•
ción. Cabe decir que si no existe este grupo incorporado al co•
lorante, este no posee la capacidad de colorear las estructuras.
Los grupos cromóforos son los siguientes:
-N02, -NO, <-_>..,-( CO, CS. CN, -N = N, -
N:::-N-0.
> 1

Los colorantes más utilizados en Bacteriología son aque•

llos obtenidos del carbón de hulla.
E. FROTIS.-
Una vez que nos disponemos a trabajar en una coloración,
debemos previamente realizar el frotis, para Jo cual adoptamos
el siguiente orden:

121
1. Lavar porta-objetos con abundante agua y jabón.
2. Secar con un paño que no desprerda hilachas ni
pelusas,
3. Sumergir los porta-objetos en una solución alcohólica, esto
para desengrasar totalmente la lámina.
4. Al momento de usar la lámina, procedemos a extraerla del
recipiente de alcohol, y posteriormente la secamos con un paño
que no desprenda hilachas ni pelusas.
5. Procedemos a identificar el porta-objetos, para esto usamos
un lápiz graso, marcador o diamante.Se elige un extremo, gene•
ralmente el izquierdo y allí se colocará las iniciales del paciente
o el número del análisis.
6. Si el frotis se va a realizar con asa bacteriológica; flameamos
ésta hasta colocarla al rojo vivo, posteriormente la enfriamos en
un recipiente que posee agua destilada estéril, y aprovechamos
esta maniobra para recoger en la luz del circulo distal del asa,
una gotita de esta, la cual será colocada sobre el porta objetos,
sirviéndonos para homogeneizar la muestra si ésta fuera sólida
o semi-sólida.
7. Tomamos la muestra o el inoculo de una caja Petri o tubo de
ensayo, para esto tan solo debemos tocar una colonia bacteria•
na.
8. Trasladamos el inoculo hasta el porta-objetos. donde espera
la gota para homogeneizar todo este conjunto, finalmente des•
cribiendo movimientos circulares y en sentido centrífugo, com•
pletamos el frotis, es decir que este debe ser hecho siempre en
forma circular (salvo algunas excepciones).
9. Si la muestra es líquida, la única precaución será la de agitar
bien el tubo de ensayo donde se halla ésta. antes de obtenerla
para Frotis.
10. Después de completar el procedimiento del frotis, procede•
mos a flamear nuevamente el asa bacteriológica, pero comen•
zando del extremo proximal del hilo metálico, avanzando poco
a poco hacia la punta esto para evitar el chisporroteo y posterior
diseminación de los gérmenes.

122
F. FIJACION.-
Es el proceso por el cual matamos una célula pero de tal
manera que todas sus características estructurales se mantienen
indefinidamente. A la vez que logramos este propósito también
actuamos de tal forma que la preparación quede firmemente
adherida al porta-objetos a fin de resistir los procedimientos
posteriores.
Los fijadores pueden ser físicos o químicos, en Bacterio•
logía utilizamos los físicos y de éstos sin duda alguna el ideal es
el calor.
Para l.levar a cabo este fenómeno, simplemente vamos a
pasar la lámina porta-objetos con la preparación sobre la llama
de un mechero, teniendo la previsión de controlar después de
cada pase la temperatura de la laminilla en el dorso de la mano;
no debe quemar; el tiempo necesario para lograr un buen resul•
tado es de cinco minutos.
Ahora si, está preparado el frotis para recibir a los colo•
rantes que destacarán a los microorganismos.
G. t:LASIFICACION DE LOS METODOS
DE TINCION.-
1. Tínción Simple.-
Es un método sencillo en el cual interviene tan solo un co•
lorante. Nos permite conocer la morfología y la agrupación
bac• teriana.
Fundameruc.-
La reacción de los microorganismos con los colorantes
básicos:
Ejemplo: tinción de Loefler (Aazul de metileno)
a. Procedimiento:
1. Frotis
2. Fijación
3. Azul de metileno 1 a. 3 min,
4. Lavado

l 2.3
 5. Secar
6. Observar
Resultado.-
Todos los gérmenes se van a teñir de azul o celeste resal•
tando contra un fondo claro.
2. Tinción negativa (indirecta).
A través de este método vamos a contrastar los
gcrrnenes, de manera que se vean claros y relucientes sobre
un fondo plo• mizo. además de que es ideal para la
demostración de ciertas estructuras como por ejemplo: las
cápsulas.
Procedimiento:
(Método de la nigrosina o tinta china) método de Hiss.
a. Obtenemos con el asa bacteriológica ·y en
condiciones de asepsia una o dos ansas.
b. Las depositamos sobre un porta-objetos limpio y
desen•
grasado, además de identificado.
c. Luego tomamos un ansa de nigrosina o tinta china.
d. Se procede a homogeneizar la suspensión
bacteriana con el colorante y se verifica el frotis.
e. El frotis final debe ser gris y nunca negro.
f. No fijar a la Uama del mechero. pcnnitir que se
deseque al medio ambiente.
g. Observar.
NOTA: Una variante de este método es el aplicar un cu•
bre-objetos a las suspensión bacteriana coloreada con tinta
chi• na o Nigrosina. Para observar en fresco las cápsulas
bacteria• nas.
METODO DE BURRI.-
Consiste en que a partir de la emulsión coloreada (nígrosi•
na o tinta china) y habiendo sido colocada en un extremo
del
124
porta-objetos. se procede a realizar un Irotis similar al extendi•
do de sangre.
El fundamento de estas técnicas estriba en que el colorante
por su naturaleza acida, no va a reaccionar con la bacteria o es•
casamente. de manera que va a quedar alrededor de la misma
dándole imágen de contraste.
3. Tinción estructural.-
Es aquella que permite colorear una determinada estructu•
ra bacteriana. por ejemplo podemos teñir flagelos, esporas. gra•
nos de volutina, etc.
a. Fundamento.-
Se basa en la propiedad de algunos colorantes o procedi•
mientos para reaccionar con determinadas estructuras bacteria•
nas.
METODO DE LEIFSON.- FLAGELOS
Es la aposición del colorante y el mordiente sobre los fla•
gelos determinando un aumento en el volúmen de los mismos
haciéndoles por lo tanto más voluminosos, lo que facilita su ob•
servación.
Procedimiento.-
1. Prepare una suspensión de gérmenes flagelados en
agua destilada, para esto simplemente puede lavar la superfi•
cie de crecimiento de cultivo de un agar nutritivo en "pico de
flauta", transfiriendo luego a tubos de ensayo la suspensión
obtenida.
2. Con una pipeta de Pasteur, extraiga más o menos 0.1 ml
a partir de la región más superficial de la suspensión (aquí se
ha-Ilan los germenes más motiles).
3. Deposite el inocúlo sobre un portaobjetos, procediendo
luego a deseminarlo sobre 2/3 de la superficie de la lámina.
4. No fijar al calor. simplemente dejar desecar al aire.
S. Cubra la preparación con el colorante de Leifson, por un
tiempo de l O minutos.

125
 6. Lave la preparación suavemente con agua, a fin de
eli•
minar el exceso de colorante.
7. Deje secar al aire.
8. Observar.
CAPSULAS.-
Método de Hiss (ya descrito), de Burri (ya descrito).
de
Anthony.
Fundamento.-
Si bien utilizamos coloraciones negativas para destacar
las cápsulas, también podemos utilizar tinciones estructurales
(mé• todo de Anthony) para teñir al gérrnen y observar las
cápsulas nítidamente por refrigencia.
Procedimiento.
- a. Frotis
b. Fijación (calor)
c. Colorante cristal violeta (violeta de genciana) 2
minutos.
. d. Lavar con sulfato de cobre (SO4 Cu2) 20%.
e. Secar
f. Observar.
ESPORAS.-
Método de Schaeffer - Fulton
Fundamento.-
Aprovechar al calor para teñir la espora y resaltar por
con- tratinción al bacteria vegetativo.
Procedimiento.
a. Frotis de gérmenes esporulados
b. Fijación (calor)
c. Colorante verde de malaquita I minuto.
d. Calentar la preparación hasta lograr que se
produzcan vapores (3 vapores) (no hervir).
e. Lavar con agua corriente.
f. Colorante safranina al 0.5% (sol acuosa) 30 seg.
g. Lavar con agua corriente
126
 h. Secar
i. Observar.
V ACUOLAS DE GRASA.•
Fundamento.-
El colorante utilizado es selectivo para reaccionar con
las partículas solubles lipídicas (colorante Negro Sudan B), de
esta forma obtenemos la coloración selectiva de las vacuolas
grasas intraci toplasmáticas.
Procedimiento:
a. Frotis
b. Fijación (calor)
c. Colorante Negro Sudán B 10
minutos. d. Lavar suavemente con agua
corriente. e. Secar
f. Lavar con xilol
g. Secar.
h. Colorante safranina (acuosa) 30 segundo
i. Lavar con agua corriente
j. Secar
k. Observar
CORPUSCULOS METRACROMATICOS
(VOLU-TINA).-
Método de Neisser, (Del Vecchio), de Albert.
Fundamento:
Los corpúsculos metacromáticos tienen especial
afinidad por los colorantes básicos. resaltando en el
citoplasma mucho más intensamente coloreados que el resto
del microorganismo.
Procedimiento:
Técnica de
Albert. a. Frotis
b. Fijación (calor)

127
 c. Colorante de Albert 5 minutos
d. Calentar ligeramente (no hervir ni vaporizar) 30".
e. Lavar con agua corriente pero No bruscamente.
f. Aplicar lugol l minuto
g. Lavar con agua corriente.
h. Secar
i. Observar
Técnica del Vecchio:
a. Frotís
b. Fijación (calor)
c. Colorante azul de metileno l min.
d. Lavar con agua
corriente e. Lugol
f. Calentar 3 vapores en 5 minutos
g. Lavar
h. Secar
i. Observar
4. TINCIONES ESPECIALES.-
Son aquellas que se utilizan cuando debido a las
carac• terísticas estructurales y morfológicas de un
gérmen. no se pueden utilizar el resto de las tinciones.
Básicamente nos interesa la tinción de Treponema
palli• dum el cual habrá de destacarse en un frotis a través
de pro• cedimientos de impregnación generalmente argéntica.
METODO DE FONTANA - TRIBENDEAU
Fundamento.-
La impregnación del compuesto argéntico alrededor del
soma bacteriano; es decir que vamos a realizar fenómenos
de

128
adsorción de compuestos metálicos pesados. los cuales
posteriormente hacen visible a la microscopia el microorganis•
mo en cuestión.
Procedimiento.-
Técnica de Fontana-Tribendeau
a. Frotis
b. Cubrir con solución de ácido tánico (5%) y fenol ( 1 %).
c. Calentar hasta que desprenda vapor.
d. Lavar con agua corriente
e. Cubrir con el colorante de Fontana
f. Calentar nuevamente hasta evaporación
g. Dejar reposar hasta que la película tome un color cas-
taño.
h. Lavar con agua corriente.
L Secar con papel filtro
j. Observar.
5. TlNCIONES DIFERENCIALES.-
Son los procedimientos más utilizados en Bacteriología,
pues nos permiten diagnosticar o viabilizar el resto del trayecto
labo rato ri al.
Son Linciones en las cuales intervienen dos colorantes. es
decir uno primario y otro secundario además de utilizar un de•
colorante que permite diferenciar a los microorganismos entre
sí de acuerdo a sus afinidades tintoriales y en función a carac•
terísticas estructurales.
Son ejemplos clásicos la tincién de Gram y la de Ziehl -
Neelsen.
Fundamento - Tinción Gram.-
La diferencia bioquímica tanto cualitativa como cuantitati•
va. en las paredes de las bacterias Gram (+) y Gram (-), deter•
minan el fundamento de la tinción Gram.

129
 Si revisamos las paredes de microorganismos Gram (+)
detectamos la existencia de peptidoglucano (ácido muramico) y
acidos teicoicos, además de los iones de magnesio. Estos gér•
menes tienen la capacidad de teñirse por los colorantes de la
prosanilina (violeta de genciana o cristal violeta) y que después
de reaccionar con el mordiente (Lugol) forman complejo viole•
ta - lugol, el cual no puede ser extraído de estas bacterias por
soluciones alcohólicas o de acetona.
Por el contrario los microorganismos Gram (-), contienen
mucho menos peptidoglucano; además de poseer lipopolisacari•
dos, lipropoteinas y una membrana exterior a nivel de sus pa•
redes; lo cual condiciona que una vez teñidos con el complejo
violeta-Iugol y después de ser tratados con alcohol o acetona,
van a perder totalmente la coloración, no pudiendo retener el
complejo violeta - Iugol.
Así debido a la diferente estructura de las paredes y las
di fercncias de permeabilidad consecuente se provocan en
las bacterias Gram (+) una disminución de los poros del
peptido• glucano al ser tratados con alcohol o acetona.
En las Gram (-) al poseer menos peptidoglucanos y al ha•
ber ausencia de ácidos tcícoícos, se produciría una estabiliza•
ción en los poros de sus paredes. quedando tan amplios aún
después del tratamiento con alcohol o acétona que el complejo
violeta-lugol saldría de la bacteria.
Procedimiento
b Frotis
b. Fijación (calor)
c. Colorante primario: violeta de genciana 1 - 3 min.
d. Lavar con agua corriente.
e. Mordiente: lugol 30 seg.-1 min.
f. Lavar con agua corriente.
g. Decolorar: alcohol 92º o alcohol acetona 30 seg.-1 min.
h. Lavar con agua corriente.
i. Colorante secundario: fucsina básica 1 - 3 min,

130
 j. Lavar con aguar corriente
k. Secar
l. observar
NOTA: Una vez concluída esta tinción, y en base a las
características de los gérmenes teñidos, podemos clasificar
a las bacterias en G ram ( +) o Gram (- ).
Aquello de "divide y vencerás"; también en
Bacteriología es útil, pues al dividir a los microorganismos en
dos grandes grupos tenemos la posibilidad de acercamos al
diagnóstico.
CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS
POR LA TINCION GRAM .-
1. Cocos Gram ( + ).-
a. Estafilococos
b. Estreptococos
c. Neumococo
2. Cocos Gram (-).•
a. Neisseria:
1. Meningococo
2. Gonococo
3. Bacilos Gram (+)
a.
Bacillus
b.
Clostridium
c. Corynebacteria
4. Bacilos Gram (-)
a. Enterobacterias:
l. E.
coli
2. Enterobacter acrógcnes
3. Providencia
4.
Klebsiella

131
ESQUEMATIZACION - TINCION GRAM

7
I
- --1·
~
[~~}
FROTIS ALCOHOL - ACETONA 1'
2 8
_,.-r.«:.:}\
1 ~>-.._ ~C~--
K-.t_J_'iY.
FIJACION
3
~

LAVAR
~\b

. w;
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9

~
Violeta de Genciana 1 • 3' FUCSINA BASICA 1'-3'

10
4 _&¡~

~
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LAVAR LAVAR

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5 11

~Je~~ .

[i] SECAR

LUGOL30" · 1'

LAVAR ~

-~ ~¡
6

~ --.... y
12 ~

Á\ á~~- . ., ,
~

1 ~
OBSERVAR
~
-
132
 5. Arizona
6 Edwarsiella
7. Serratia
8. Hafnia
9.Salmonella
10. Shigella
11. Proteus
12. Vibrio
b. Haemophilus-BordeteJJas
c. Brucellas
d. Pasteurellas
e. Y ersinias
f. Pseudomonas
Las levaduras (hongos) son Gram ( +).
PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS.-
Para preparar los colorantes se necesita: probetas gradua•
das, balanza de precisión, mortero, pilón y recipiente color ca•
ramelo para guardar los colorantes.
l. Azul de metíleno (Loeffler).• 100 ce
a. Azul de metileno 300 mg.
b. Alcohol 95º 20 ce.
c. Agua destilada · 80 ce.
En algunos casos se puede añadir borax (tetraborato de so•
dio) como mordiente. El alcohol evita que se produzcan preci•
pitaciones en las soluciones colorantes.
2. Violeta de genciana.- 100 ce.
a. Violeta de genciana ,. 1 g.
b. Alcohol 95º 20 ce.
c. Agua destilada 80 ce.

133
3. Fucsina básica - 100 ce.
a. Fucsina básica 300 mg.
b. Alcohól 95 º 20 ce.
c. Agua destilada .80 ce.
4. Lugol.- 300 ce.
a. Jodo Metálico o resublimado 1 g.
b. Ioduro de Potasio 2g
e. Agua destilada 300 ce.
5. Safranina.- 100 ce.
a. Safranina (colorante) l g.
b. Alcohol 95º 20 ml,
e. Agua destilada 80 ml,
6. Verde de malaquita.- 100 ce.
a. Verde de Malaquita 300 mg.
9
b. Alcohol 95 20 mi.
c. Agua destilada 80 mi.
7. Solución decolorante de Gram
a. Alcohol 95" 70 mi.
b. Acetona 30 mi.
8. Colorante de Fontana.- 100 ce
a. Nitrato de Plata 5 g.
b. Agua destilada 100 ce.
Agregar a esta preparación una solución concentrada de
Amoniaco (NH3) hasta disolver el precipitado, finalmente
añadir algunos centímetros cúbicos del nitrato de plata en agua
destilada, gota a gota hasta producir opacidad que se mantenga
después de la agitación.

134
9. Solución de nigrosina.-
a. Nigrosina hidrosoluble 1 O g.
b. Agua destilada 100 ce.
c. Formol, 0.4 ce.
10. Colorante de Leifson .•
Solución A:
a. Cloruro de sodio 1,5 g.
b. Agua destilada 100 ce.
Solución B:
a. Acido tánico 1,2 g.
b. Alcohol Etílico 9S 1
100 ce
Solución C:
a. Fucsina básica l,2 g
b. Alcohol etílico 95 º 100 ce.
Ejemplo Agregar la solución A en la solución B, y luego
agregar este conjunto a la solución C.
11. Colorante de Albert.-
a. Azul de toluidina O, 15 g.
b. Verde de malaquita 0,2 g
c. Acido acético glacial.; l.cc
d. Alcohol etílico 95º , 2 ce
e. Agua destilada 100 ce.

135
 CAPITULO IX

ZIEHL - NEELSEN - BACILOSCOPIA

A. CO~CEPTO.-
Probablemente sin este método de tinción., el camino
ha• cia el diagnóstico de las enfermedades producidas por
micobac• tenas no sería tan sencillo como lo es ahora; en
nuestro país ad• quiere una particular importancia, pues por las
condiciones de subdesarrollo; la tuberculosis aún campea
como enfermedad in• vencible-siendo esto una vergüenza -
entre nuestro pueblo.
Es un procedimiento tintorial, sencillo y accesible a
todos los niveles de trabajo en salud, habiendo sido
estandarizado mundialmente para el diagnóstico etiológico
de enfermedades mícobacteríanas: diagnóstico que es
imprescindible para iniciar la quimioterapia.
B. FUNDAMENTO:
Algunas bacterias Gram(+) poseen una capacidad
denomi• nada ácido - alcohol resistencia; esta se basa en el
hecho de que una vez teñída con el colorante primario en
caliente y sometidas posteriormente a un tratamiento con
alcohol-ácido, retienen el colorante primario, en tanto que
otras bacterias se decoloran rápidamente.
Los bacilos ácido-alcohol-resistentes (B.A.A.R.).
poseen en sus paredes bacterianas peptidoglicanos, pero
además lípídos denominados ácidos micólicos,
experimentalmente se ha com• probado que los ésteres de ácido
micólico son ácido-alcohol re• sistentes así que
probablemente este éster de ácido micólico actúa como una
barrera impermeable impidiendo la penetración del ácido
inorgánico.

137
 Los ácidos micolicos son B- hidroxiácidos que han sufrido
una sustitución en la posición alfa por una cadena alifática rela•
tivamente larga. Siendo imprescindible el grupo B-hidróx.ido
en el ácido micólico para que se pueda dar la ácido-resistencia.
C. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.-
1. Esputo.-
Puede ser procesado de dos manera:
a. Sencilla
b. Por concentración (ver capítulo de'rnicobacterias).
- También se puede realizar baciloscopia seriada, esto signi•
fica que realizamos una serie de por los menos tres
bacilosco• pías en base a tres muestras distanciadas entre sí
por veinticua• tro horas o en su defecto tan solo realizamos
la baciloscopia simple; esto equivale a trabajar con una sola
muestra.
2. Orina.-
Se debe esperar que sedimente manteniéndola en
reposo de una a dos horas después de haber sido remitida al
laborato• rio; posteriormente es concentrada por
centrifugación.
3. Líquido Céfalo- Raquídeo.-
Una vez obtenida esta muestra, se debe hacer primero una
valoración macroscópica. para luego inmediatamente
proceder a su concentración a través de la centrifugación.
Así podemos obtener muestras de todos los segmentos
susceptibles de con• tener BAAR: no olvidándonos que
muchas de las muestras son candidatas para estudio anátomo -
patológico que también nos mostrará lesiones sugestivas de
etiología micobacteriana.
D. IMPORTANCIA
Las muestras de esputo pueden conservarse hasta tres <;e•
manas si es que el recipiente se halla en un lugar oscuro y
seco: sin que esto influya en la baciloscopia posterior.
138
E. METODO ALTERNA TI V O.-
Consiste enremitir varios porta-objetos con frotis de
espu• to a un centro de control y diagnóstico. colocando entre
porta• objeto y porta-objeto varillas de madera, formando un
paquete, de manera que no haya contacto entre los mismos. el
cual final• mente es enviado asegurando un buen
aislamiento de las láminas porta-objetos, condición - sine
qua non- es que los fro• tis deben ser gruesos y estar bien
fijados. En el laboratorio se procede a lavar las preparaciones
con agua destilada, para final• mente continuar con el
procedimiento rutinario.
Estas preparaciones así acondicionadas pueden ser
envia•
das dentro del plazo de un mes al laboratorio.
!'JOTA: Mayores explicaciones las hallará en el
capítulo de micobacterias de este mismo manual.
F. PROCEDIMJENT0.-
1. Frotis.-
Este debe realizarse con un aplicador <le madera.
escogien• do en el caso de esputo la mejor "partícula", vale
decir la por• ción más representativa (putrefacta, con
manchas de sangre. etc.) para realizar esta elección
debemos trabajar obviamente dentro del área de protección
que nos brinda el mechero. además de usar barbijo
rigurosamente para este tipo de trabajos. Una vez que hemos
logrado coger la mejor "partícula". esta es depositada sobre el
porta-objetos identificado, procediendo a extender la muestra
sobre la mayor superficie posible que nos brinde éste; esto
para aumentar la posibilidad de hallar BAAR a la
microscopia; por demás está el indicar que la muestra debe
ser bien extendida, homogeneizándola en forma adecuada.
Cumpliendo este paso. dejamos desecar el frotis al medio
ambiente; a la vez que incineramos el aplicador a la llama del
mechero. colocando los restos en el mismo recipiente de obten•
ción de muestra del esputo.
2. Fijación.- Calor
139
3. Colorante Primario:
Fucsina Fenicada
4. Calentamiento.-
Aplicando una estopa de fuego por debajo del porta•
objetos llegando a obtener 3 vapores. no hervir el colorante.
pues de suceder esto. la fucsina Fenicada precipitaría en cris•
tales que adoptan morfología de agujas. lo cual nos daría resul•
tados equivocados.
5. Lavar la preparación con agua comente.
6. Decolorar con una solución ácido-alcoholica.
a. Acido clorhídrico (HCL) al 3%.
b. Acido sulfúrico (H2SO4) al 20% Solución Acuosa.
c. Acido nítrico (HNO3) al 33% Solución Acuosa.
La decoloración se lleva a cabo por 30 seg. a I minuto.
7. Lavar con agua corriente.
8. Colorante secundario: azul de mctilcno I minuto a 3 min.
9. Lavar con agua comente.
10. Secar
11. Observar.
G. RESULTADOS.-
A la observación microscópica vamos a observar a las
micobacterias teñidas de color rojo brillante, destacándose so•
bre un fondo celeste-azul.
H. FALSOS POSITIVOS.-
Se presentan generalmente por deficiente técnica o errores
del observador. así podemos hallar falsos positivos cuando se
utilizan porta-objetos ya utilizados en otros pacientes con enfer•
medades micobacterianas. Otro falso positivo se presenta en
caso de que se usen porta-objetos rayados (viejos). en los que
se concentra la Fucsina Fenicada en las rayaduras del vidrio.

140
 También se presentará este problema cuando el colorante
primario hierve al calentamiento.
Es también posible obtener falsos positivos cuando la
muestra es mal obtenida, arrastrando micobactcrias saprofitas
de algunos segmentos de la economía humana o finalmente por
errores del observador, eliminándose esta posibilidad realizando
dos lecturas de una misma placa por dos diferentes observa•
dores, distanciándose dichas lecturas por un lapso de una hora
por lo menos.
NOTA: El mordiente de esta tinción es el fenol incorpora•
do al colorante primario, coadyuvado por el calor.
l. FALSOS NEGATIVOS.·
Se producen cuando la muestra es obtenida en forma defi•
ciente; cuando el frotis es preparado con la porción salival del
esputo, cuando el procesamiento de concentración es deficiente;
cuando los pasos de la tinción Ziehl - Neelsen son mal realiza•
dos o por defectos en el observador, este conflicto es superado
poniendo a punto todos los factores de trabajo, además de una
preparación adecuada del operador.
En algunos casos se puede utilizar como colorante secun•
dario el verde de malaquita en lugar del azul de metileno. así
pues se destacarán los BAAR de color rojo sobre fondo verde.
J. PREPARACION DE COLORANTES
Y REACTIVOS.-
1. Fucsina Fenicada.-
Fucsina básica 5 g.
Alcohol 95º 100 ce.
Fenol acuoso 55 ce.
Agua destilada ,., , 840 ce.
2. Fenol Acuoso.-
Acido fénico al 10% en agua destilada

141
ESQUEMA TIZACION - TINCION ZIEHL - l'i'EELSEN

FROTIS ALCOHOL· ACIDO 30"- 1'

2 7
\

,~_O?'!.J&
\ ~
FIJACION 1
LAVAR
3 8
et"'~
~
~~~
Fucsina Fenicada Azul de Metileno 3'
4 9

dMf\~
3 VAPORES
·_j
5 10

.,
~
"\~Ud
~---...::::='{!]

LAVA;-~ OBSERVAR

142
3. Azul de Metileno.•
Azul de rnetileno 300 mg.
Alcohol 95º 20 ce.
Agua destilada 80 ce.
4. Decolorante ácido - alcohólico.•
a. H O 3%
Acido clorhídrico (HCL)p.a 3 ce.
Alcohol 95 º 97 ce.
b. H2 S04 20%
Acido sulfúrico (H2 S04) en
Solución acuosa 20 ce.
Alcohol 95º 80 ce.
c. HN03 33 %
Acido nítrico (HNO 3 ) en
Solución Acuosa , .33 ce.
Alcohol 95 2
•..•••..••.••.••.•••.••.......................... 67 ce.
K. BACILOSCOPIA.·
L. DEF1NICION.•
Es el conjunto de procedimientos que nos permite determi•
nar cualitativa y cuantitativamente los bacilos ácido - alcohol
resistentes en un frotis.
M. PROCEDIMIENTO.·
Una vez concluida la tinción Ziehl - Neelsen, y después
que la preparación ha secado. colocamos al porta-objetos
sobre la platina del microscopio y con el objetivo de inmersión
proce• demos a revisar en primer lugar todos los campos
mi• croscópicos. Posteriormente ubicamos un sector de la
prepara•
~(~{\ ü. Qí.\íl.tf (.\~l C.UM. CG'\.\ta.\\1G'S \Q13. b'3.Cfü.)~ íc,dci-o.kl)\\o\
resistentes que se hallen en cien campos microscópicos segui•
dos.
143
 Paralelamente y antes de iniciar la cuenta de
gérmenes dibujamos en una hoja de papel un cuadrado
grande que posea cien cuadraditos pequeños, a partir de
ahora cada cuadradito será un campo microscópico observado.
Hecho esto, comenzamos a contar los BAAR de cada
cam• po microscópico, anotando el número de éstos en el
respectivo cuadradito que corresponda al campo microscópico
observado.

2 3 4 5 6 7 8 9
1O I 1 9
N De BAAR Pare. 1

-,-- - ----¡--.--
- -¡- - 1 - - -

l_ ------------
1

--+-- -
-~----
1
----~-----------------
i
:1J ::::
_j

_ ..J. __
----~J
-----------------_
TINCION .
PROCESAMIENTO .
FRECUENCIA BACILOSCOPICA
..
MUESTRA: N9 BAAR.
TOT.
(100/CMO). -- - --1
PAC!ENTE:
.
Nº DE EXAMEN COCIENTE
BACILOS COPICO:
. RESULTADO (OMS)
..
FIRMA

144
 Una vez que tenemos todos los campos microscópicos ob•
servados contabilizados ( 100) al igual que el número de BAAR,
podemos colocar las cuentas parciales cada 10 campos mi•
croscópicos observados en la casilla respectiva, para finalmente
proceder a sumar las cuentas parciales obteniendo así el número
total de BAAR en cien campos microscópicos observados.
A partir de este instante lo único que hacemos es dividir
aritméticamente el número de BAAR entre el número de cam•
pos microscópicos observados; comparando el cociente con la
tabla de la Organización Mundial de la Salud.
N. TABLA DE LA O.M.S..-
(-) Ningún BAAR en 100 campos microscópicos observa•
dos.
(+) Menos de I BAAR por campo en 100 campos mi•
croscópicos observados.
(++) De 1 a 10 BAAR por campo en 50 campos mi•
croscópicos observados.
{ +.i.+) Mác;de l O BAAR por campo. en '.20 campos mi•
croscópicos observados.
EJEMPLO: Si en un frotis contabilizamos un número
to• tal de 160 BAAR en 100 campos microscópicos
observados: procedernos a dividir 160 entre l OO. obteniendo
el cociente baciloscópico 1,6; esto signfica que tenemos más
de 1 BAAR
por campo en 100 campos microscópicos observados. lo que
según el indice de la O.M.S. corresponde a:
BACILOSCOPIA POSITIVA ( ++ ).
NOTA: Para que la baciloscopía sea positiva debe haber
10.000 B AAR por mililitro de muestra.
Si después de la lectura de los 100 primeros campos no
observamos ningún BAAR. estamos obligados a leer otros 100
campos microscópicos adicionales por seguridad.
O. IMPORTANCIA DE LA BACILOSCOPIA.-
Además de damos el diagnóstico etiológico reviste gran
importancia en el seguimiento terapéutico del paciente pues
es
145
obvio que si la primera baciloscopia nos dá un resultado positi•
vo ( ++ ) y si a los seis meses repetimos la baciloscopia y se
mantiene positiva ( ++) significará que estamos frente a un
fra• caso terapcútico.
P. RECOMENDACION:
La baciloscopía debe ser utilizada en forma idónea sin al•
terar en ningún momento los resultados; es preferible repetir el
procedimiento completo antes de informar resultados dudosos
o errados.
Q. OTRA TINCION PARA BAAR: METODO
DEKINYOUN:
Este procedimiento No utiliza la fase de calentamiento
ya que la preparación de la Fucsina fenicada es mucho más
agresi• va en cuanto al mordiente.
R. PROCEDIMIENT0.-
1. Frotis
2. Fijación (Calor)
3. Colorante primario: fucsina fenicada (KINYOUN) 5 min.
4. Lavar con agua corriente.
S. Decolorar con solución ácido-alcoholica.
6. Lavar con agua corriente.
7. Colorante secundario: azul de metileno l-3 min.
8. Lavar con agua corriente
9. Secar
10. Observar.
S. PREPARACION DE LA FUCSINA FENICADA
KINYOlJN.-
Fucsina básica .4 g.
cristales de fenol 8 g.

146
 Alcohol 95º · 20 ce.
Agua destilada 80 ce.
T. RESULTADO:
Los BAAR se ven también de color rojo sobre un fondo
celeste o azul.
U. CLAVE PARA LA OBSERVACION DE BAAR EN
UNA MUESTRA.-
A fin de observar perfectamente los BAAR, es clásico
el hecho de buscarlos en los acúmulos de coloración celeste-
azul (mucus), aunque a veces los vamos a observar en cantidad
tan importante que prácticamente se hallan en todo el frotis.
EJERCICIO:
Cuál es el diagnóstico en base al índice de la O.M.S.
si contabilizamos un número total de 90 BAAR en 100
campos microscópicos observados, y cuál el cociente
baciloscópico.

147
 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
LA PAZ - BOLIVIA

UNIDAD DE ENSEÑANZA DE
MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA TARJETA DE
BACILOSCOPIA
Nº .

PACIENTE EDAD .
MUESTRA TINCION .
PROCESAMIENTO N2 EXAMEN .

N2 TOTAL
DE BAAR
100%(CMO)
COCIENTE BACILOSCOPICO
.

RESULTADO OMS .

FIRMA

FECHA
148
 • 1

CAPITULO X

ANTIBIOGRAM
A

A. CONCEPTO.-
Ningún trabajo ya sea de rutina o de investigación se
puede considerar completo en Microbiología Médica sino se
realiza el antibiograma: pues este procedimiento nos permite
conocer aunque sea en forma aproximada la respuesta de los
gérmenes ante determinados fármacos.
B. DEFINICION.-
El antibiograma es el conjunto de procedimientos que nos
permite determinar la sensibilidad o la resistencia bacteriana "in
vitro" ante determinados químioterápícos y/o antibióticos.
C. SENSIBILIDAD.-
Es la capacidad potencial bacteriana para interactuar
con los quimoterápicos, produciéndose a consecuencia de
este fenómeno alteraciones reversibles e irreversibles· en el
creci• miento bacteriano.
D. RESISTENCIA.-
Es una capacidad potencial que presentan las bacterias,
misma que puede manifestarse a consecuencia de fenómenos
genéticos o no genéticos. determinando un estado refractario a
la acción de los quimíoterápicos.
En algunos casos es factible encontrar un comportamien•
to intermeüio, el cual nos estaría demostrando un estadio
de indi-Ierenciación respecto a la interacción con los
quimio•
terápicos,
149
E. REGLAS DE ORO PARA REALIZAR
ANTIBIOG RAMA
l. Para llevar a cabo un antibiograma siempre se debe trabajar
a partir de cultivos puros (aislados) e identificados.
2. El antibiograma se debe llevar a cabo cuando el gérmen se
halle en la fase exponencial de la curva de crecimiento
bacteria• no. Esto signfica que debemos trabajar con
poblaciones hacte• rí anas jóvenes.
F. PROCEDIMIENTOS DE ANTIBIOGRAMA
1. Método de Baver - Kirby.-
A partir de un cultivo puro (aislado) e identificado
tómese con un asa bacteriológica aproximadamente 5
colonias, las cuales serán suspendidas en un tubo de ensayo
que contenga 5 ml de agua de peptona, caldo nutritivo, caldo
Mueller Hinton, o finalmente si no poseemos ninguno de
estos medios de culti• vo, utilizaremos suero fisiológico.
2. Se incuba el tubo por el lapso de una hora de manera que
alcancemos la turbidez necesaria para poder seguir
trabajando. Si estuviera a nuestro alcance podemos
comparar la turbidez de la suspensión con un tubo que posee
una substancia patron compuesta de sulfato de bario (S04
Ba2) que se prepara añadiendo 0,5 mi de cloruro de bario
(C12Ba) al 1 % a 99,5 ml de solución de acido sulfúrico
(H2S04) al 1 % preparado al
0,36 N.
Este patrón de turbidez es equivalente al standar de Me
Farland
0,5 y que equivale a 108 enterobacterias por
mililitro.
No olvidar que este patrón de turbidez debe ser renovado
cada mes a fin de no perjudicar el trabajo por lecturas falsas.
3. Una vez preparada la suspensión tenemos 15 minutos
para realizar la siembra pues transcurrido un tiempo
mayor al señalado, 1a concentración de la suspensión
variará alterando también los resultados.
150
4. La siembra se realiza con hisopo estéril y sobre una Caja Pe•
tri que contenga de preferencia agar Mueller Hinton. Este
me• dio de cultivo tiene la particularidad de estar libre de paba
(aci• do p-aminobcnzoico) y sus análogos, de manera que es
ideal para investigar la acción de las sulfonamidas.
Asfrnismo es fáctible agregar 5% de sangre para antibiograrnas
de gérmenes exigentes cuyo pH final es igual a 7.4 a 45''C.
Para llevar a cabo la siembra, introduzca el hisopo estéril en el
tubo que contiene la suspensión: deshágase del exceso de
alícuota apretando el extremo del algodón empapado contra
las paredes internas del tubo de ensayo. Posteriormente y
siempre dentro del área de seguridad que le brinda el mechero,
proceda a sembrar por inundación en la superficie del medio
de cultivo de la Caja Petri.
5. Coloque l01, discos de antibiograma teniendo la precaución
de utilizar una pinza anatómica, procediendo a llamear leve·
mente ésta. cada vez que coloque un disco.
NOTA: Los discos de antibiograma son de papel filtro
con un diámetro promedio de 0,5 cm. y que se hallan embebi•
dos de un quirnioterápico y/o antibiótico determinado. Cabe re•
saltar 4u1.: la concentración es constante. \lo solo hay discos de
antibiugrama sino que también existen pastillas para este fin y
finalmente sistemas multidiscos que presentan un eje
central. llevando cada disco un antibiótico.
Los discos son colocados con la pinza anatómica sobre el
medio de cultivo sembrado, conservando la siguiente disposi•
ción: Una separación de 2 cm. entre disco y disco y a una dis•
tancia de 2 cm. de las paredes de la caja Petri.
En una caja Petri de diámetro corriente no debemos colo•
car más de 9 discos; esto significa que en orden de
disposición pondremos 8 discos siguiendo una trayectoria
circular y uno al centro.
Para hacer más fácil este trabajo tan solo debemos
marcar con un lápiz graso por fuera de la Caja Petri
(contratapa) los
151
puntos donde correspondan los discos. No olvidar que una vez
que se hayan colocado se deben presionar levemente con la pin•
za anatómica a fin de que queden bien asegurados.
Es también factible encontrar despachadores automáticos
que poseen un sistema de cartuchos, cada uno con su dotación
respectiva de discos de antibiogram a (cada cartucho corres•
ponde a un antibiótico determinado); así pues en este caso tan
solo deberemos colocar este despachador sobre el agar inocula•
do y con un movimiento de presión del control de despacho
caeran los discos sobre el agar sembrado, teniendo ya la dispo•
sición verificada.
6. Las Cajas Petri ya preparadas deben ser incubadas a
37ºC. por un lapso de tiempo de 18 a 24 horas.
ADVERTENCIA: La incubación debe realizarse entre
18 y 24 horas, teniendo la precaución de no extender más este
tiempo; esto signfica que la lectura de los resultados se
deberá hacer también dentro de estos plazos.
7. Realice la lectura, para lo cual debe munirse de una regla
que le permitirá conocer el diámetro de los halos de
inhibición de crecimiento.
La terminología de lectura hoy en día se basa en un sistema
bi• nario (resistente o sensible) aceptándose en algunas
oportuni• dades el término de intermedio.
No se pueden dar números exactos respecto a las mediciones
de los halos de inhibición en función a determinar una
clasifica• ción universal de sensibilidad o resistencia de un
antibiótico, pues por una parte la lectura dependerá de la
concentración del antibiótico en el disco y por otra del sistema
de lectura que po• sean los fabricantes.
De tal manera que una vez obtenido el diámetro del halo de
inhibición lo único que deberá hacer es comparar su lectura
con una tabla.

152
G. METODO DE MEZCLA DE AGAR.•
l. Condiciones Generales.-
Todos los pasos previos a la siembra se verificarán en for•
ma idéntica a la descrita en el método de Kírby -
Baver.
2. El momento de envasar el medio de cultivo que recibirá al
inoculo. debe vertir 2/3 partes de agar fundido dentro de la cajá
Petri, dejando solidificar.
3. Proceda a mezclar 0,5 mi de la suspensión bacteriana prepa•
rada con la tercera parte restante del agar que sobre teniendo la
precaución de que este medio de cultivo se halle a una tempera•
tura de 50ºC.
4. Vierta la mezcla antes descrita sobre la primera capa solidifi•
cada de agar que se halla en la caja Petri.
5. Permita que solídifique y posteriormente coloque los
discos de antibiograma en la misma forma que en el método de
- Kirby
- Baver.
6. Incube a 379C por un lapso de tiempo de 18-24
horas,
7. Realice la lectura de acuerdo a los parámetros ya indicados.
H. METODO DE LA DILUCION (CONCENTRACION
INHIBITORA MINIMA).·
l. Prepare una galeria de tubos de ensayo con caldos Mueller -
Hinton o en su defecto, caldo nutritivo, o agua de peptona,
siempre y cuando no se usen sulfonamidas.
Los tubos pueden ser tantos como concentraciones sean utiliza•
das.
2. Si suponemos que vamos a trabajar con 8 rubos de ensayo, el
primero actuará como testigo (sin ningún antibiótico) y a
partir del segundo usaremos concentraciones de un solo
antibiótico en
orden creciente; así podemos partir con 0.2 ug/ml de por
ejem•
plo penicilina en el 2º tubo de ensayo, 0,4 ug/ml en el 3er.
tubo,
0,8 ug/ml en el 4to. tubo, 1,6/ml en el 5to. tubo, 3,'.?. ug/ml en
el
óto y así sucesivamente hasta llegar al último tubo de ensayo.

153
3. Colocamos un inóculo similar al utilizado en la técnica de
Kirby - B;vcr 008 bacterias/ml) en cada tubo y finalmente lle•
vamos a incubar a 37ºC por 18 horas.
4. Realizar la lectura correspondiente: obviamente en el tubo
testigo si los gérmenes eran viables y las condiciones de cultivo
e incubación ideales obtendremos un desarrollo masivo. En
el resto de los tubos de ensayo observaremos que a
concentra• clones no inhibitorias hay desarrollo.
Y por el contrario obtendremos la concentración inhibitoria
mínima (CIM) que detecta la menor concentración capaz de
inhibir el desarrollo bacteriano {supongamos el tubo N" 3. en el
cual habían 0,8 ug/ml).
COMENTARIO: El lector comprenderá que este método
es d ideal, pues no solo detecta sensibilidad y/o resisten•
cia sino también que nos permite averiguar cual es la
CIM.
Por el contrario estas ventajas se ven igualadas por el
alto costo de este método. pues supone mayor uso de material
por lo cual se hace praciicamcnte inaccesible en nuestro medio.
l. METODO DE CANETTI (PRUEBA DE
SENSIBILIDAD Y RESISTEI'\CIA PARA EL
MICOBACTERIUM TUBERCliLOSISJ:
Este método también llamado de las proporciones de Ca•
ncui consiste en medir la proporción de bacilos resistentes que
existen en cada cepa, para ello la prueba indica el número total
de bacilos cultivables y el número de bacilos resistentes de esa
población total. En función a estos parámetros podremos deter•
minar la sensibilidad y/o resistencia.
l. Tomar 3 ansas de colonias de Micobacteriurn tuberculosis.
que equivalen a 100.000.000 de B.A.A.R.
2. Colocar en un recipiente que contiene 20-30 perlas de vidrio
(diámetro de 3-5 mm) y añadir 10 mi de agua destilada.

154
3. Agitar el recipiente de manera que el movimiento interno
de las perlas de vidrio logren una suspensión homogénea.
4. A partir de la suspensión obtenida (verificada en el
Ne• felómetro) que desde ahora será la Solución Madre,
efectuar di• luciones 1/10, 1/100, lJIOOO. 1/10.000
1/100.000, 1/1.000.000.
S. Inocular 1/10 mi del tubo con la dilución 1/1000 en cada
tubo de Lowenstein - Jensen con su quimioterapico añadido.
Así por ejemplo se tendrán 4 tubos de Lowenstein - Jesen;
donde el 1 ro. lleva incluido además del medio de cultivo. INH.
(hidracida del ácido isonicotinico) 0.2 ug/ml; el 2º con
estreptomicina (SM) 4 ug/ml; el 311 con etambutol (EMB)
2ug/ml y rifampicina (RFP)
40 ug/ml.
Finalmente inoculamos 1/10 ml de la dilución 1/100.000 en
un tubo que contiene solamente Lowenstein - Jenscn,
6. Una vez inoculados los tubos se dejan reposar en forma
incli• nada a 37ºC, para que a las 48 horas se coloquen en
posición vertical ajustando totalmente los tapones.
7. La lectura se realiza a la 4ta. y 6ta
semanas.
8. La interpretación se rige por el siguiente

l
cuadro:

N2 de colonias de N2 de colonias tubo RE

cada uno de los tubos > testigo SIS
-3 -4 = -5 TEN
(10, 10) (10) TE

1 Nº de colonias de N2 de colonias del

cada uno de los tu- tubo de testigo SEN
< SI-
-5

L
-3 -4 (10) BLE
(10,10)

(Tomado de Microbiología e Inmunobiología de las

enfer•
medades infecciosas J. del Rey Calero. Editorial MARBAN).

155
J. METODO DE ANTIBIOGRAMA
PARA ANAEROBIOS.-
Básicamente en estos métodos el común denominador es
el factor de anerobiosis.
l. En la primera variante efectuamos todos los pasos de1 méto•
do Kirby - Baver, manteniendo un tiempo de predífusión de 3
horas después de colocados los discos y antes de empezar el
tiempo de incubación; esto debido a que la Estreptomicina y
Neomicina se inactivan en condiciones anaeróbicas.
Posteriormente verificamos la incubación en el jarra de Gas•
pack donde tendremos las condiciones de anacrobiosis reque•
ridas.
2. En caso de bacteroides podremos utilizar el método de mez•
cla del agar que nos sirve perfectamente para este fin.
Estos son los métodos mas conocidos, algunos de los cuales se
realizan en nuestro medio.
K. FACTORES QUE AFECTAN LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBJ ANA EN VITRO.
l. pH del Medio.-
La Nitrofurantoina actúa más en un medio ácido. Los ami•
noglucósidos lo hacen en un medio alcalino.
2. Composición del medio.-
Las sales pueden Uegar a inhibir a los aminoglucosídos, El
ácido para amlnobenzoíco (PABA) antagoníza con las sulfo•
namidas (Peptona de los medios de cultivo).
3. Termoestabilidad.-
A temperatura de estufa la clomtetraciclina se inactiva
rápidamente. mientras que la Penicilina lo va haciendo lenta•
mente.
4. Tamaño del inóculo.-
A mayor tamaño de1 inoculo, menor se hará la sensibili•
dad, pues es más factible estadísticamente encontrar un mutante
resistente en una población bacteriana mayor.

156
S. Duración de la incubación.-
Es importante mantener el tiempo de incubación en un lap•
so de tiempo que vaya de las 18 a las 24 horas (gérmenes co•
munes) pues si la duración es inferior a este plazo no
tendremos una lectura fidedigna; y mucho más inexacta será
nuestra apre• ciación si la lectura se realiza pasadas las 24
horas.
6. Metabolismo bacteriano.-
Se acepta el hecho de que aquellas bacterias cuyo creci•
miento es más rápido serán susceptibles a la acción de las drogas.
Es también conocido el hecho de que las células Lister
(L) son metabólicarnente inactivas, siendo por lo tanto
excluídas de estudios de sensibilidad y resistencia, pues una
vez que reco• bran su pared celular nuevamente reanudan sus
procesos me• tabólicos haciéndose por lo tanto sensibles a los
antlbóticos.
7. Aireación.-
Ya se ha indicado anteriormente que en condiciones de
anerobiosís sufren ínactivación tanto la estreptomicina como
la neomicina.
L. MECANISMO DE ACCION DE LOS
ANTIBIOTICOS Y QUIMlOTERAPICOS.
l. Inhibición de síntesis de la pared bacteriana.
2. Inhibición de la selectividad de la membrana bacteriana y
sustitución de metabolitos.
3. Inhibición en la síntesis de proteínas.
4. Inhibición en la síntesis de los ácidos nucleicos.
M. ORIGEN DE LA RESISTENCIA.-
l. Origen no genético (adquirida)
2. Origen genético:
a. Resistencia extra
cromosómica b. Resistencia
cromosórnica

157
N. MECANISMOS DE RESISTENCIA.-
1. Enzimas que destruyen al antibiótico
2. Alteración de permeabilidad a la droga
3. "Blanco" estructural alterado para la droga.
4. Ruta metabólica alterada.
5. Enzimas modificadas con función metabólica.
L. CONCLUSION.-
A lo largo de este capítulo hemos advertido la
importancia de hacer una buena elección en el uso de los
antibióticos, por otro lado los peligros de que se produzca un
estado de resisten• cia bacteriana y primariamente el hecho
de trabajar con el la• boratorio a fin de tener la posibilidad de
llegar a una elección venturosa para el paciente. Por demás
está el indicar que el tra• bajo de investigación de sensibilidad
y resistencia a partir de muestras debe ser realizado dentro de
la más rigurosa actitud profesional.

158
 CAPITULO XI

FLORA MICROBIANA NORMAL

Todos los macroorganismos se hallan colonizados por una

flora compuesta de microoganismos. los cuales
prácticamente llegan a interactuar con su huésped.
Si bien debernos aceptar que un macroorganismo al
mo• mento de su nacimiento es prácticamente estéril. también
debe• mos aceptar el hecho de que a medida que transcurre el
tiempo, este va siendo colonizado por la flora que lo
acompañara por el resto de su ciclo vital.
Podemos indicar que el cuerpo humano se halla
cubierto por microorganismos. salvándose algunos segmentos.
los cuales tienen que mantenerse estériles para que exista
compatibilidad con la vida. Sin duda alguna han tenido que
transcunir muchos "experimentos" y un lapso de tiempo muy
grande por parte de la evolución, para que llegue a
establecerse este tipo de interac• ción.
Así pues podemos observar que se establecen tres tipos
de asociación biológica entre el macroorganismo y los
microorga• nismos; el parasitismo, el comensalismo y la
simbiosis.
La nora microbiana que coloniza la economía humana a
su vez, puede ser saprofita si no causa enfermedad. patógena si
es capaz de producir enfermedad y patogena circunstancial.
cuan• do bajo ciertas circunstancias el génnen es capaz de
producir patología. Nunca debemos olvidar que parte de
nuestra flora normal esta constituída por gérmenes
patógenos. Sin embargo el equilibrio ecológico microbiano se
halla tan bien balanceado que existen algunos bacterios que
son antagonistas de otros y por este mecanismo impiden el
desarrollo de éstos: el mecanis• mo utilizado es el proceso de
"interferencia microbiana".
159
a presente 2da. ecliclÓll se terrriné de impr,m)(
en noviembre ele 1997 81' los talleres de

(/•]uella:~!1
E<lit Suipacha .oc a 5
Av. Argent,,,_. Nº 2075 (Mi1attQfes)
Teléfono 224987, Castl;a 4168
La Paz - Bolivia
2. Flora microbiana transitoria.-
Es aquella compuesta de microorganismos diversos
que colonizan por períodos con.os de tiempo y que se hallan
gene• ralmente en la piel y las mucosas. Esta es insignificante
pero co• bra importancia cuando la flora pennancnte es
removida pues si la transitoria es significativa puede llegar a
producir enferme• dad.
C. ES UTIL CONOCER LA FLORA NORMAL DE
PERSONAS SANAS, POR LAS RAZONES
SIGUIENTES:
l. Estos conocimientos nos dan idea de los tipos de
infección que pueden aparacer cuando los tejidos se dañan.
2. Dan indicación del origen posible y de la significación de
los microorganismos que aparecen en algunas infecciones
clínicas.
3. Pcnniten apreciar mejor las infecciones debidas a
microorga• nismos que constituyen esta llora normal debido a
la incidencia de gérmenes provenientes de otro origen.
D. ORIGEN DE LA FLORA HUMANA.-
Se ha demostrado que el feto es estéril hasta el
momento del parto. En condiciones normales la llegada de
microorganis• mos al feto humano tiene lugar a su paso por el
conducto vagi• nal. A estos gérmenes se unen enseguida otros
provenientes del ambiente en que se desenvuelve. Por tanto, a
las pocas horas, de nacer el niño adquiere una flora
microbiana que constituirá su flora indígena.
La flora en el intestino del recién nacido está determinada
por la invasión de microorganismos proveniente del canal del
parto y las heces de la madre . El meconio se coloniza a
partir de las 4 a 7 horas de nacimiento sobre todo de E. coli y
Strepto• coccus spp. El B. bifidus aparece a las 12 horas de
haber recibi• do leche materna en el 75% de los niños y a las
36 horas en el
100%. Los Bacteroides aparecen a las 24
horas.
161
E. DISTRIBUCION.-
1. Flora normal de la piel.-
Se hallan bacilos difteroides aerobios o anaerobios
(por ejemplo Corynebacterium, Propionibacterium)
estafilococos blancos no hemolíticos aerobios y anaerobios.
bacilos esporula• dos gram positivos aerobios (por ejemplo,
bacillus subtilis), es• treptococos alfa hemolíticos, enterococos.
bacilos coliformes gram negativos, Acinetobacter.
micobacterias no patógenas. También se hallan hongos,
levaduras y mohos.
En las superficie de la piel se hallan 85 x 106 hasta
109 microorganismos, aceptándose como cifra crítica hasta 105
bacterias; por encima de este número podemos pensar en que se
puede presentar un cuadro patológico apenas se dañe el revesti•
miento de la piel.
2. Flora normal de las vías respiratorias
Los bronquiolos y los alveolos son normalmente estériles.
además de los senos paranasales. Experimentalmente se de•
mostró que la cantidad de microorganismos que contiene el
aire inspirado es 200-500 veces superior a la que se halla en el
aire espirado. Luego toda esta gran concentración de
bacterias tendrá que quedar atrapada en las vias respiratorias
altas.
En la nariz hallamos coryncbacterias, Estafilococo
dorado y blanco. estreptococo, diplococos saprofitos gram
negativos, bacterias encapsuladas gram negativas, Hemophilus
influcnzae, Proteus.
En la faringe existen estreptococos no hemolíticos, y alfa
hemolíticos, neisserías, estafilococos. difteroides, Haemophilus,
neumococo. Mycoplasma, bacteroides, peptococos, cándidas.
También es factible hallar virus, los cuales pueden locali•
zarse por períodos largos de tiempo sin causar enfermedad,
par• ticularmente los adenovirus.
3. Flora normal de la cavidad oral.
De 4 a 12 horas después del nacimiento se establecen es•
treptococos alfa-hemolíticos (viridans) como las bacterias
más
162
prominentes de la flora permanente, la que también está com•
puesta luego de algunos días por neisserias. actinomicetos. lac•
tobacilos y otros.
La tlora normal bucal permanente alcanza su madurez
ecológica a partir del tercer mes de vida. Cuando comienza la
dentición se establecen espiroquetas anaerobias, bacteroides y
bacilos fusiformes, también vibnones anaerobios. En general.
en saliva y dorso de la lengua predominan los aerobios y en los
surcos gingivales y placas. los anaerobios.
En la saliva existen 188 bacterias/mi. en la placa. 2 x 1011
bacte ri as/m
l.
Finalmente la llora normal permanente estará compuesta
por: Estreptococos víridans y cntcrococo (S. mitis S.Salivarius
S. mutans, S. sanguis, S. bucalis) que comprenden un 90% del
total de la flora y además hallaremos Veillonella. corynebacte•
rias, Lcptotrix, espiroquetas anaerobicas, vibriones aneróbicos.
estreptococos hemolíticos y no hemólíticos, • actinomicetos,
micoplasmatales, levaduras (Cándida) Neisseria (especies no
patógenas), Bacillus, cntcrobactcrias y bacteroidcs,
El microorganismo más constante de la cavidad bucal es el
estreptococo salivarius que generalmente se halla en el dorso de
la lengua. esto a partir del tropismo (taxis) que posee.
Inclusive en bocas mal higienizadas llegaremos a encon•
trar protozoarios, como la Entamoeba gingivalis y Trichomona
tenax.
Como dato de curiosidad podemos apuntar la aseveración
de Garavelli en el sentido de que en la cavidad bucal se han ha•
llado unos 29 géneros de bacterias.
4. Flora normal del
intestino.
La dicta tiene una influencia marcada sobre la flora micro•
biana; pues en niños amamantados se detecta la presencia de es•
treptococos lácticos y lactobacilos, en cambio en niños que re•
ciben el biberón la flora es mixta, disminuyendo el número de
163
lactobacilos. Finalm ente cuando la alimentación es variada se
establece el patrón definitivo del adulto.
En el esófago existen 1 ()3. 1 ()5 bacterias/g. que llegan
con la saliva y los alimentos.
En el estómago hay de O a I OS /g. de contenido, gracias
a la acidez gástrica.
En el duodeno hay 103 - J06 bacterías/g.
En el yeyuno y en el ileón proximal 1 OS -1 ()8 bacterias/g.
En el ileón distal, ciego y colon transverso, 1 os_ lQlO/ g de
contenido.
En el colón sigmoide, recto y heces fecales 1011 /g de
contenido. En eJ intestino superior predominan los
lactobacilos y enterococos. pero en el ileén y ciego la flora es
fecal.
La composición de la flora microbiana intestinal del
hu• mano consta de 260 especies de microorganismos, cuya
masa principal (96-99%) son anaerobios (bacteroidcs, Bífido•
bacterium, clostridia, y estreptococos anaerobios) y el resto
(l-4%) está compuesta por el bacilo coli, colifonnes gram ne•
gativos, lacto-bacilos, enterococos, Pseudomona, cte.
Menos de un 0,01-0,001 o/o la constituye la flora
residual compuesta básicamente por estafilococos y levaduras.
La persona adulta elimina en 24 horas junto con los
excre• mentos cerca de 17 x 1012 microorganismos, debiendo
tomarse en cuenta de que el 10 - 20% de la masa fecal la
constituyen los microorganismos.
5. Flora normal de las vías urinarias.
En los varones, en la parte anterior de la uretra existen es•
tafilococos, difteroídes y bacterias grarn negativas no
patógenas. En las partes externas de los órganos genitales mas•
culinos se encuentra Micobacterium smegmatis y micoplasmas.
La uretra femenina puede contener la misma flora que la
masculina.
164
6. Flora normal de la vagina.
La flora vaginal depende básicamente del equilibrio hor•
monal femenino.
Los cstrogcnos determinan un aumento del glucógeno en
el epitelio vaginal. La vagina antes del nacimiento es estéril y
poco después del nacimiento aparecen lactobacilos (bacilos de
Doderlein) los cuales persisten mientras el pH sea ácido. Hasta
la pubertad el pH se mantiene neutro consistiendo la llora en
cocos y bacilos. En la pubertad la acción de los estrógenos hace
reaparecer a los lactobacilos, los que mantienen un pH ácido
por la producción de compuestos ácidos a partir del glucógeno;
también pueden observarse estafilococos, cnterococos, bacilos
difteroides y además Estreptococos Víridans y bacilos coli•
forrnes. El pH es más o menos 4,7; valor con el cual se hace
evidente el mecanismo de prevención por el que no desarrollan
gérmenes patógenos. Después de la menopausia, los Iactobaci•
los vuelven a disminuir en número.
La flora normal vaginal incluye también clostridios, es•
treptococos anaerobios, estreptococos hemolíticos del grupo B
y Listeria, pudiendo hallarse también candida.
El moco cervical tiene actividad antibactcriana.
7. Flora normal de mucosas oculares.
Predominan los . difteroides (Corynebacterium xerosis),
neisserias y pequeños bacilos gram negativos (moraxellas).
También se pueden hallar estafilococos y estreptococos no he•
molíticos.
8. Flora del oído e,-terno.•
Similar a la descrita en piel.

165
 CAPITULO XII

FUNDAMENTOS DE
UROCULTIVO, HEMOCULTIVO Y
COPROCULTIVO

UROCULTIVO
A. DEFINICION.-
Es el cultivo de microorganismos a partir de muestras de
orina, mediante técnicas que permitan la cuali-cuantificación de
los gérmenes, asímismo determinar si existe o no patología en
vías urinarias.
B. TOMA DE MUESTRA.-
La muestra debe ser de chorro medio o de 24 horas, en al•
gunos casos se refiere la primera micción.
Si el paciente es de sexo femenino el lavado de la región
vulvar se realiza siete veces con agua tibia y jaboncillo,
posteriormente la muestra se tomará directamente en el frasco
estéril. En el sexo masculino. el lavado de la región prcpucial,
glande y el meato urinario es también necesario.
C. PROCESAMIENTO.-
Se homogeniza la muestra realizando movimientos de ro•
tación sobre una superficie plana y luego se abre el frasco al
lado de un mechero para evitar la contaminación, empicando
uno de los siguientes métodos de siembra.
l. Métodos de Diluciones.
Realizar una dilución l :2D a partir de la muestra: para esto
con una pipeta deposite 1,9 ml. de suero fisiológico estéril en
un tubo de ensayo y agregue con otra O, I ml. de orina.
167
 Sembrar 0,2 ml. de esta dilución en una caja Petri que con•
tenga agar nutritivo. Extender la muestra con la espátula de Dri•
galski sobre toda la superficie del medio de cultivo.
Llevar a incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
2. Método del Asa Calibrada-
Se toma la muestra con un asa de platino que termina en
un aro de 2 cm. de diámetro que equivale a 0,01 ml. (centési•
ma) de la dilución de orina y se siembra sobre el medio de cul•
tivo en toda su extensión, incubar a 379C por 24 a 48 horas.
D. LECTURA E
INTERPRETACION.-
Si a las 24 horas no existe desarrollo de colonias, se debe
dejar otras 24 horas, si al cabo de las 48 horas no existe desa•
rrollo, se reportará como negativo.
Si a las 24 a 48 horas existe desarrollo. éste se debe cuan•
tificar del siguiente modo:
l. Trazar por la parte externa de la contratapa (de la caja Petri)
dos lineas que permitan separar o dividir en cuatro cuadrantes,
el diámetro del medio de cultivo.
2. Contar las colonias, marcándolas para no repetir las exis•
tentes en un solo cuadrante.
3. El resuJtado obtenido en un cuadrante se debe multiplicar por
cuatro (que representa a los otros cuadrantes) el número de co•
lonias encontradas deberá multiplicarse por el factor de dilu•
ción (de la siembra), cuyo resultado será el definitivo, con rela•
ción a la cuantificación.
EJEMPLO:
cuadrante elegido 20 colonias
encontradas
por 4
por 0,01 de dilución 100 (factor
multiplicador)
igual 8000
168
 Lo que signi fica que existen ocho mil colonias por ml. y
que no existe infección.
Si existe igual o mayor a 100.000 colonias por ml. se re•
porta como sugestivo de infección urinaria (POSITIVO).
A veces las cifras son de 90.000 colonias/mi que
significa una infección en sus inicios.
UNA VEZ TERMINADO ESTE
PROCEDIMIENTO SE DEBE ENTRAR AL
DESCUBRIMIENTO DEL GERMEN CAUSANTE DE
LA PATOLOGIA.
a. Realizar a partir de las colonias desarrolladas un frotis y
coloración de Gram.
b. Si la observación es de bacilos Gram (-) se aislará el
gérmen en medios selectivos y será sometido a pruebas
bio• químicas para el diagnóstico de género.
c. Si la observación es de formas redondeadas Gram (+) y
agrupadas a manera de racimos de uva, sospechara de estafilo•
cocos, que también será sometido a pruebas bioquímicas para
la diferencia de especie.
d. Si la observación es de microorganismos no descritos
lineas atrás, se realizará dependiendo del germen, cultivos es•
pecíficos y pruebas selectivas.
Los microorganismos más frecuentes son los
siguientes: Escherichia coli, otros bacilos coliformes, Proteus
- Providen• cia, estafilococos y entcrococos.
HEMOCULTIVO
A. DEFINICION.-
Es el procedimiento laboratorial que permite el
aislamien• to de microorganismos a partir de la sangre
infectada en pa• cientes que cursan con bacteremia,
septicemia. fiebre de origen desconocido, etc.

169
B. TOMA DE MUESTRA · METODO DE
CASTAÑEDA BIFASICO.-
La muestra a obtener debe ser extraída con mucho cuida•
do, por tanto es bueno recordar ciertas reglas:
l. Utilizar solo equipo estéril y una técnica apropiada.
2. Aplicar sobre la zona a puncionar alcohol yodado 1-2%.
3. Limpiar nuevamente la zona con alcohol a 70% para
eliminar el yodo en forma circular y sin volver al punto de
partida.
4. Preparar el dispositivo de extracción (cánula con una
aguja en cada extremo y carrete de seguridad).
S. Realizar la toma de muestra sanguínea mediante técnica
es•
trictamente aséptica utilizando aguja intravenosa (aguja larga).
6. Limpiar la superficie del tapón de goma del frasco de
Cas•
tañeda con alcohol de 709C.
7. Comprimir la cánula hasta que la sangre alcance la
segunda aguja y atravesar con ella el tapón de goma del frasco.
8. Dejar correr 5 a 1 O ml. de sangre (graduaciones en la
eti•
quetas de 5 en 5 ml.),
9. Llevar a incubación de 35 a 37"C en posición vertical u hori•
. zontal de forma que el caldo no recubra totalmente el agar,
du•
rante l a 2 semanas.
Este método presenta un medio de cultivo en
forma líquida y sólida, que puede ser Soya tripticasa o
Infusión cere• bro corazón, la parte libre del frasco tiene un
5% de anhídrido carbónico a presión reducida y además se
encuentra sulfonato sodico de polianetol al 0,05% que tiene
propiedades anticua• gualantes y anticornplernento y que
inactiva algunos antimicro• bianos como los arninoglucosidos.
C. SISTEMA DE TUBO DE ENSAYO.-
 Este método utiliza un tubo de ensayo con caldo soya
trip• ticasa o infusión cerebro corazón, se siembra e incuba a
37ºC. por 24 horas y se efectua la lectura.
170
D. LECTURA.-
Examinar diariamente durante 5 a 7 días para descubrir
la aparición de cualquier señal que demuestre una posibilidad
de crecimiento microbiano o colonias en el agar.
E. INTERPRET ACION
Si se produce crecimiento microbiano es necesario
hacer una tínción de Gram y subcultivos en medios apropiados.
F. INDICACIONES.-
El hemocultivo es la prueba más útil y más usada para
el hallazgo de infección general debida a bacterias en
pacientes con fiebre, con o sin signos o síntomas de
localización. En sos• pecha de endocarditis bacteriana.
Es una gran ayuda en la orientación del tratamiento anti•
microbiano.
Los microorganismos más comúnmente encontrados
son: Streptococcus Viridans, S. Iaecalis: Staphylococcus
aureus y otros. entercbacterias, proteus, Pseudornona,
Neumococo. Neis• serias, bacteroides y otros.
COPROCUL TlVO
A. DEFINICION.-
Examen bacteriológico de heces fecales que comprende la
siembra, aislamiento e identificación de microorganismos
exis• tentes en dicha muestra para establecer el diagnóstico de
infec• ciones bacterianas intestinales.
B. TOMA DE MUESTRA.-
La muestra puede ser sólida o líquida y en algunos
casos se utiliza hisopos.
C. CULTIVO.-
El cultivo de la muestra para el aislamiento de
microorga•
nismos sigue un proceso paralelo.
171
l. Cultivo de enriquecimiento.
2. Cultivo para aislamiento primario.
D. ENRIQUECIMIENTO.-
Este sistema de cultivo permite aumentar el número
de gérmenes patógenos con relación a los microorganismos
coli• forrnes que se encuentran nonnalmcnte en heces.
La Salmonella es un gérmen patogénico que requiere
de medios de enriquecimiento como por ejemplo.
Caldo Selenito
Caldo bilis-verde-brillante
Caldo tetrationato
La incubación se realiza por un lapso de 24 horas a 45ºC
(Baflo María).
E. AISLAMIENTO PRIMARIO.-
Este sistema de Cultivo permite diferenciar a los microor•
ganismos fermentadores de lactosa de los no fermentadores,
en el laboratorio se utilizan principalmente los siguientes
medios: agar Mac Conkey, agar SS. agar EMB.
Una vez sembrada la muestra se incuba 24 horas a 37ºC.
F. LECTURA DE COLONIAS.-
Al realizar la lectura de colonias nos referiremos
princi• palmente a tres tipos de microorganismos:
salmonellas, shige• llas y coliforrnes.
l. Coliformes.-
En el medio de SS dan colonias:
a. Redondeadas
b. Medianas a
grandes c. Húmedas
d. Cremosa o mucoides
172
 e. Brillantes
f. Color rosado a rojo
g. Bordes bien definidos
h. Convexas
Un ejemplo está dado por Escherichia coli.
2. Salmonella.-
En el medio de enriquecimiento presenta una marcada tur-
bidez.
En el medio de mac conkey da colonias:
a. Pequeñas a medianas
b. Redondas
c. Húmedas
d. Mucoides
e. Translúcidas
f. Incoloras
g. Bordes bien definidos
h. Convexas
En el medio de SS. dan colonias:
a. Pequeñas a medianas
b. Redondas
c. Húmedas
d. Mucoides
e. Brillantes
f. Translúcidas
La parte central negro azabache (ojo de pez). Pasadas las
24 horas. adquieren un color negro en toda la colonia.
g. Convexas
173
3. Shigella.-
Las colonias en agar Mac Conkey y en agar SS. son:
a. Medianas a pequeñas
b. Redondeadas
c. Húmedas
d. Cremosas
e. Brillantes
f. Translúcidas
g. Incoloras
h. Convexas
Una vez identificados los gérmenes mediante las
colonias, son sometidos a pruebas bioquímicas:
a. T.S.I.
b. L.I.A.
c. Citrato Simons
d. Urea
e. Motilidad
f. Rojo de métilo
g. Voges-Proskauer
h. lndol
i. Nitratos
Realizadas estas pruebas, se someten a serología.

174
 CAPITULO XIII

METODOLOGIA DEL
DIAGNOSTICO
BACTERIOLOGICO

El diagnóstico bacteriológico es muy importante dentro de

la práctica médica, pues permite corroborar la etiología de los
cuadros patológicos producidos por bacterias. Por esta razón la
relación médico-laboratorista es de mucha importancia para la
recuperación del paciente.
En función de encontrar el agente causal de ciertas enfer•
medades, desde hace mucho tiempo atrás los investigadores em•
pezaron a contribuir con sus conocimientos empleando cada
uno de ellos un método para llegar al diagnóstico bacterio•
lógico.
Roberto Koch fue uno de los primeros en sentar las bases
del diagnóstico bacteriológico mediante un método y de esta
manera un gérmcn ser considerado como agente etiológico de
una enfermedad; son conocidos como postulados de koch y son
cuatro.
A. POSTULADOS DE KOCH.-
1. Debe encontrarse el mismo m icroorganismo en todos los ca•
sos de una determinada enfermedad.
2. Este debe ser obtenido en cultivo puro "in vitro".
3. El microorganismo procedente de este cultivo puro debe pro•
ducir la enfermedad cuando se inocula a un animal susceptible.
4. Debe recuperarse el mismo microorganismo del animal ino•
culado.
175
 Sin embargo, algunos gérmenes no pueden ser aislados en
medio de cultivo, de tal forma que no llegan a cumplir los Pos•
rulados de Koch. En la actualidad los investigadores han recu•
rrido a otros métodos como por ejemplo la serologia y la
detec• ción de productos bacterianos como exotoxinas y
endotoxinas.
B. OBJETIVOS.-
En la actualidad los principales objetivos del diagnóstico
microbiológico dentro de la medicina son:
l. El diagnóstico etiológico de las enfermedades infecciosas
por medio del aislamiento, identificación y la demostración
de res• puestas inmunológicas.
2. La selección del tipo de tratamiento antimicrobiano sobre
la base de las pruebas laboratoriales.
Cualquier método a emplearse sigue en forma general tres
grandes pasos:
a. Observación del fenómeno
b. Formulación de la
hipótesis c. Verificación de la
hipótesis
El hallazgo microbiológico de un agente etiológico se
basa en los siguientes pasos:
1. Características morfológicas del microorganismo.
2. Caractenstícas del crecimiento y desarrollo del gérmcn
3. Características fisiológicas del microorganismo.
4. Características de la patogenia que causa.
5. Características epidemiológicas
6. Características con relación al pmcedemiento de identi•
ficación.
7. Características de reacción serológica.
8. Características de la clínica resultante.
176
 Esta secuencia nos lleva a definir la presencia de un deter•
minado microorganismo.
C. CONSIDERACIONES
BASICAS.-
1. Obtenga muestras
representativas
2. Anote todo lo que realice. manteniendo una secuencia
lógica en todos los pasos dados.
3. Verifique que personalmente que todo el material de
trabajo se halle en óptimas condiciones.
4. La impaciencia es la madre de todos los errores en el
trabajo laboratorial. No apresure pasos que deben darse
ordenada y se• cuencialmente.
5. Si va a ser incapaz de terminar un trabajo determinado, es
mejor que no lo inicie.
6. No cometa jamás el error de inventar resultados o de
adivi• narlos, pues está jugando con pacientes que en
determinado mo• mento dependerán de su resultado para
iniciar el tratamiento correspondiente.
7. No es delito el hecho ele que consulte ya sea a otros colega"
o fuentes bibliográficas a fin de establecer un buen
diagnóstico.
8. En lo posible trabaje en equipo, pues es difícil que una sol
a persona pueda hacerlo todo, o saberlo en su defecto.
9. Guarde toda la información (resultados) que obtuviera,
pues en el futuro le permitirá analizar la actividad realizada, a
la vez que podrá corregir ciertos desajustes.
lO. Busque la verdad con fe y ahínco, no se rinda jamás,
hágalo todo con excelencia y voluntad.
La metodología comprende dos fases:
a. Fase presuntiva.-
Que incluye desde el frotís directo hasta el aislamiento
se•
cundario. Esta fase nos conduce a un diagnóstico
presuntivo.

177
Pudiendo en algunos casos llevarse a cabo procedimientos de
concentración y/o descontam inación.
b. Fase definitiva-
Que abarca desde las pruebas bioquímicas hasta
la fagotipia. Así llegamos al diagnóstico definitivo.
El diagnóstico bacteriológico en el laboratorio debe
seguir los siguientes pasos a partir de la muestra problema:

r---
-------------------,
CONCENTRACION Y/O 0ESCONTAMINACIOf\i
L -----·----------- -- .J

~-----;......,.....__f FROTIS DIRECTOl

L--------..J
FASE

~--- EXAMEN-EN FRESCO l

PRESUNTIVA
L-----------.J

i AISL].MIEÑTO¡ i AISLAMIENT-
0 ¡
FASE ~---....,~-~R~M_A~~-~ b!-
~:.c~~~A_R~OJ

r PRUEBAS BIOQUIMlc'As
7_rANTl~OGRAMA1

DEFINITIVA
LrFAGOTTP~I:s.;OrTP~-,
--J
L .J L-------.J
1
7
8
 En medios de cultivo líquidos dan enturbamiento difuso
con formación de sedimiento en el fondo.
d. Pruebas bioquímicas.-
Dentro de este sector, es necesario diferenciar
Escherichia coli de Enterobacter aerógenes.

TEST DE PARA TRIPLE AZUCAR HIERRO

TSI
M Vi C FONDO ESTRIA H2S GAS

Escherichia + + Acido Acido +

coli

Enterobacter
aerógenes + + Acido Acido +

7. Test de Parr.•
* Indol (l).-
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas bacterias de poder
formar lndol a partir del triptófano (peptona).
b. Procedimiento.-
1. A partir de un tubo de 1 O ml. de caldo peptona al 1-
2 % con el gérmcn problema de 24 horas: realizar un
fraccionamien• to de 3 ml. en otro tubo (en forma aséptica).
2. Agregar 0,5 ml. de reactivo de Kovacs al tubo donde
se
realizó el fraccionamiento.
3. Realizar la lectura.

206
4. Patogenia.-
Está dada por endotoxinas y presencia en los tejidos.
S. Patología
Resumida. a.
Gastroenteritis
b. Infecciones urinarias
c. Infecciones en vías biliares
d. Meningitis
e. Septicemias y otras
6. Diagnóstico Laboratorial.•
a. Frotis.-
Este procedimiento no ayuda mucho pues tan solo vere•
mos bacilos Gram (-).
b. Tratamiento de la Muestra.-
Las muestras pueden ser procesadas casi de inmediato, te•
niendo la precaución de refrigerarlas si es que se va a retardar la
labor.
c. Características de Cultivo y Desarrollo.- ·
E. coli desarrolla en casi todos los medios de cultivo. sin
embargo al utilizar Medio de Levine (EMB) incubando a 37r a
las 18 horas tendremos el siguiente desarrollo.
Colonias de bordes redondeados. superficie convexa. ª"•
pecto húmedo y brillante. consistencia cremosa. tamaño que va
de 2 - 3 mm. de diámetro, coloración negro verdosa, carac•
terísticamente con brillo metálico.
1. Medio de Mac Conkey.-
Colonias de todas las características antes señaladas, ex•
cepto el color que exhiben pues éste va de rosado intenso a rojo.
205
 - llafnia
- Providencia - Arizona - Citrobacter
- Edwarsiclla
2. Colonias Lactosa H corresponden a:
- Salmonella
- Shigella
- Proteus
- Yibrio
NOTA: Todos estos grupos bacterianos son oxidasa (-)
negativos excepto los vibrios.
Arizona, Citrobacter y Edwarsiella bioquírnicarncnte son
similares a Salmonella.
R. ESCIIERICHIA COLl.-
1. Morfología.-
Bacilo coli es una bacteria Gram (-): pleomórfica, mide
de 1-3 um. por0,2 -0.4 um.
2. Fisiología.-
Escherichia coli puede ser móvil o inmóvil, no forma es•
poras, puede o no poseer cápsulas, desarrolla a un pH de 7,2 -
7,5 y a una temperatura de 30º - 37ºC (aunque también lo hace
a 45ºC). Son anaerobio - facultativos y se dividen por fisión bi•
naria.
Resisten en el medio ambiente durante varias semanas y
meses; a 55"C sucumben en una hora.
3. Clasificación.-
Escherichia coli

204
 Capítulo XV

DIAGNOSTICO DE
ENTEROBACTERIA
S
A. INTRODUCCION.-
En el estudio de las enterobacterias no vamos a regimos
por conceptos taxonómicos sino que vamos a encarar el diag•
nostico a partir de reacciones fáciles y sencillas de reproducir a
través de las cuales, el objetivo microbiológico habrá de ser
cumplido.
Si sembramos una muestra de enterobacterias en un medio
de cultivo diferencial (levine/ernb), Mac Conkey; rápidamente
tendríamos un carácter cultural diferencial, cual es el fenómeno
de la fermentación de lactosa, característica fácil de
reconocer simplemente por la pigmentación o no de las colonias.
Todas las colonias pigmentadas en estos medios corres•
ponden a bacterias que fermentan lactosa; por el contrario
aquellas colonias que no presenten pigmentación (translúcidas)
corresponderán a bacterias que son incapaces de fermentar lac•
tosa.
l. Colonias lactosa (+)corresponden a:
- Escherichia coli
- Enterobactcr aerógenes
- Klebsiella
Fermentan lentamente lactosa:
- Serratia
203
 5. Incubar a 37gC. po r el lapso de l 8-24 horas .
6. R eal izar la le ctur a.
c. Interpretación.-
1. Positiva,-
Indica fermentación, al haber virado el indicador
tomando el medio de cultivo un color amarillo intenso.
2. Negativa-
No hay fermentación, no hay cambio de color en el
medio de cultivo (se mantene rojo).
d. Serotipia.-
Pruebas con antisueros específicos para determinar el tipo
scrológico de neisseria (valor epidemiológico).

202
 b. Procedimiento:
1. Agregar unas gotas del reactivo para oxidasa
(clorhidra•
to de tetrametil - p Fenilen - diamino) en solución acuosa
al
0.5 - 1 % a colonias sospechosas en una caja Petri.
2. Un método alternativo consiste en humedecer un
disco de Oxidasa en agua destilada estéril; posteriormente
proceder a "montar' una colonia problema sobre este disco con
el asa bac• teriológica.
c.- Interpretación.-
1. Positiva.-
Las colonias toman una coloración rosada en primera ins•
tancia para luego hacerse de un color negro intenso.
2. Negativa.-
No hay cambio de color.
2. Fermentación de hidratos de carbono.-
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen las neisserias de fementar
algunos hidratos de carbono con formación de ácido pero no de
gas.
b. Procedimiento.-
1. Se prepara una batería de medios de cultivo
enriqueci- dos con glucosa. sacarosa y maltosa (CT A)..
1 er. tubo con glucosa al 1 % (esterilizar en autoclave)
2do. tubo con sacarosa al 1 % (esterilizar por autoclave).
3er. tubo con maltosa al I % (esterilizar con filtración).
2. Agregar el indicador rojo fenol a cada tubo y
tamponar
a un pH de 7,4.
3. Inocular con asa bacteriológica o aguja bacteriológica a
partir de un cultivo de 24 horas.
4. Sellar perfectamente los tubos.

201
 Precaución.- Tenga mucho cuidado al manipular este tipo
de muestras.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Tanto el gonococo como el meningococo comparten las
mismas características de cultivo y desarrollo.
Estos gérmenes son exigentes y precisan de medios de cul•
tivo enriquecidos (agar chololate) o de selectivos como el me•
dio de Thayer Martin. Se debe proveer de l 0% de C02 (Méto•
do de la vela) y la incubación se ajustará a 17ºC, debiendo
realizarse la lectura a las 18 - 24 horas después de la siembra.
1. Neisseria gonorroheae o ncisseria meningitidís:
Colonias de bordes redondeados.superficie convexa, as•
pecto húmedo y brillante, consistencia mucoide, de l mm. de
diámetro, translúcidas (como gotitas de rocio), o a veces ligera•
mente grisáceas, no hay hemólisis alrededor de las colonias.
H. PRUEBAS BIOQUIMICAS.-

INTRACE- OXI CRECIMIEN. GLU- SACA-

MAL LULAR DASA TO EN AGAR COSA ROSA
TOSA
NUTRITIVO

Neisseria + + +
gonorrhoeae

Neisseria + + + +
meningitidis

Otras Neisserias + + +/- +/- +!-

l. Reacción de la oxidasa.•
a. Fundamento.-
Desenmascarar la producción de Indofenol (citocromo)
oxidasa.

200
rápidamente por la desecación. la luz directa del sol y el calor
húmedo, así a 60ºC sucumben en 8 minutos. o por agentes
químicos (fenol l %) en unos minutos ..
3. Clasificación:
a. Neisseria gonorrhoeae (gonococo)
b. Neisseria meningitidis (meningococo)
c. Otras Neisserias.
4. Patogenia.-
Está dada por su presencia y multiplicación en tejidos y
probablemente por algunas endotoxinas.
S. Patología resumida-
a. Gonorrea (gonococos)
b. Oftalmia neonatorum (gonococos)
c. Meningitis purulenta (meningococo)
d. Faringitis exudariva (meningococo)
e. Otras
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Froris
A partir de los exudados purulentos o del L.C.R. (líquido
céfalo raquídeo) previa concentración: procediendo posterior•
mente a realizar la tinción Gram que nos mostrará diplococos
Gram (-) dentro de piocítos y leucocitos degenerados.
b. Tratamiento de la muestra-
En el caso de meningitis procesar inmediatamente la
muestra pues las neisserias poseen enzimas autolíticas (indofe•
noloxidasa). Centrifugar el L.C.R. a 2000 r.p.m. por el lapso
de
5 minutos, obteniendo un sedimento a partir del cual se hará un
frotis y el cultivo respectivo. Asímismo las muestras donde
haya la sospecha de hallar gonococos serán ser procesadas
rápidamente, realizándose frotis y cultivo simultáneamente.
199
 b. Procedimiento.-
1. Traspase 2 colonias de neumococos a una caja Petri -
para sembrarlas por agotamiento en la mitad del agar sangre
(con asa bacteriológica).
2. Coloque un disco de optoquina (clorhidrato de etil hidro
cupreina) en el centro de la superficie sembrada.
3. Lleve a incubar a 37ºC, añadiendo 10% de C02 por el
lapso de 12-18 horas.
4. Realice la lectura.
c. lnterpretación.-
1. Positiva. -
. Hay zona de inhibición de crecimiento alrededor del dis-
co, de 18 mm incluído el disco.
2. Negativa-
Si existe zona de inhibición, es inferior a los 18 mm.
d. Serotipia.-
G. NEISSERIAS.-
1. Morfología.-
Son diplococos Gram (-), generalmente intracelulares (a
partir de las muestras), miden de 0,6 - 1mm de diámetro. En
forma individual cada unidad tiene forma arriñonada con los la•
dos adyacentes planos o cóncavos. Las neisserias saprofitas son
extracelulares.
2. Fisiología.-
Las neisserias son inmóviles, no forman esporas, a veces
encapsu I adas.
Desarrollan a un pH de 7,2 - 7 ,6 y a una temperatura de
37ºC. Son aerobios estrictos, fermentan varios carbohidratos
con fonnación de ácido pero no de gas. Son destruidos

198
 a. Fundamento.-
Prueba serológica que nos permite averiguar el tipo inmu•
nológico específico de un germen encapsulado, en este caso del
neumococo, a partir de reacciones entre un antisuero y la
cápsula del germen problema.
b. Procedimiento.-
l. A partir de una suspensión ligera de neumococo. co•
loque un ansa sobre un porta-objetos limpio desengrasado.
2. Al lado de esta muestra coloque una gota de Azul de
Mctileno (en solución acuosa al l %).
3. Con el asa bacteriológica proceda a mezclar la muestra
y el colorante.
4. Con el asa bacteriológica coloque una: cantidad de anti•
suero al lado del anterior preparado en el porta-objetos.
5. Proceda a mezclar con el asa bacteriológica el prepara•
do coloreado y el antisuero.
6. Coloque posteriormente un cubre-objetos sobre
este complejo y observe al microscopio (400 X).
7. Antes de dar un informe negativo, debe incubar en
cámara húmeda por lo menos 30 minutos.
8. Lea e informe.
c. Interpretación.•
). Positiva.-
Hay hinchamiento de la cápsula.
2. Negativa.-
No hay hinchamiento de la cápsula
2. Prueba de la optoquina-
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen los neumococos para ser lisados
por el reactivo de esta prueba.

197
vara los diplococos Gram (+) positivos y por refringencia a la
cápsula (pues ésta no se tiñe con estos métodos).
b. Tratamiento de la muestra.-
En lo posible las muestras deben ser procesadas inmedia•
tamente después de obtenidas; debiendo ser refrigeradas si el
retraso en los procedimientos laboratoriales es de 6 horas.
c. Características de cultivo y desarrollo.•
Los neumococos precisan de medios de cultivo enriqueci•
dos, pudiendo utilizar el agar Sangre y debiendo además pro•
veer de 10% de C02 (anhídrido carbónico) a la incubación a
través del método de la vela- que se realiza a 36ºC,
efectuando la lectura a las 18 - 24 horas.
1. Streptococcus pneumoniae.-
Colonias de bordes redondeados. superficie cupulifonne
en un inicio para luego hacerse umbonadas, aspecto húmedo y
brillante, consistencia mucoide, de 1mm de díametro,
translúcidas, con zona de alfa-hemólisis alrededor de las colo•
nias.
En medios de cultivo líquidos no dan enturbiamiento y
presentan sedimento finamente flocular.
F. PRUEBAS BIOQUIMICAS.-

OPTOQUINA QUELLUNG

Streptococcus pneumoniae + +

l. Reacción del Quellung.•

(Prueba de Neufeld)

196
 2. Negativo.-
Si no hay este fenómeno.
d. Serotipia.-
- Método de Lancefield.
E. NEUMOCOCOS (Streptococcus pneumoniae).-
1. Morfologia.-
Los neumococos son diplococos ovalados Gram (+)
donde a la vez es posible observar los extremos ligeramente
puntiagu• dos (lanceolados), además de poseer una cápsula
que envuelve a cada diplococo. Algunas veces pueden
disponerse en cadenas.
2. Fisiología.-
Los neumococos son inmóviles, no forman esporas,
son encapsulados, desarrollan a un pH de 7,2 - 7,6 a una
temperatu• ra de 37ºC. Son aerobios, Iisados por los agentes
tensioactivos como las sales biliares o la optoquina, y se
dividen por fisión bi• naria.
3. Clasificación.-
Streptococcus pneumoniae.
4. Patogenia.-
Está dada por su presencia y multiplicación en los
tejidos, no está comprobado que produzca toxinas.
5. Patología resumida.-
a. Neumonía
b. Sinusitis
c. Otitis
d. Meningitis y otras
6. Dianóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
Que puede ser realizado a partir de la muestra
obtenida
(por ejemplo, esputo), la posterior tinción Gram permite
obser-
195
 2. Negativa.-
El halo de inhibición, si es que existe es inferior a los 15
mm.
En las otras pruebas será simplemente ajustar las condi•
ciones requeridas de manera que si por ejemplo, en el medio de
cultivo líquido a 45ºC. (Baño María) hay desarrollo, serán au•
tomáticamente, enterococos. O bien si el medio de cultivo posee
en su formulación 6,5% de ONa (Cloruro de Sodio) y aún así
hay desarrollo de colonias, cuyos componentes a la microscopía
dan patrón de estreptococos, entonces también pensaremos en
cnterococos. Y finalmente si en el medio de cultivo de leche con
O, 1 % de azul de metileno hay desarrollo, cuyos componentes a la
microscopia se presentan como estreptococos, concluiremos en
Estreptoccoco fecal que corresponden a S. fe-calis.
2. CAMP Test.-
a. Fundamento>
Sinergismo de la zona de hemólisis en el agar sangre a
partir de la camp-proteina que presenta el estreptococo beta•
hernólitico, Grupo B (agalactiae), al ser sembrado junto a una
estría de estafilococo dorado.
b. Procedimiento.-
l. Sembrar una estría del estreptococo problema perpen•
diculannente a otra previamente inoculada correspondiente a
Staphylococcus aureus; en una Caja Pctri con Agar Sangre
(sangre bovina o de camero).
2. Incubar a 37ºC por 24 horas,
3. Realizar la lectura
c. Interpretación.•
!. Positiva-
Si aparece sinergismo de hemólisis entre estos dos desa•
rrollos (punta de flecha). es Estreptococo Grupo B.

194
 En los medios de cultivo líquidos dan crecimiento en for•
ma de floculos. no enturbiando el medio de cultivo.
D. PRUEBAS BIOQUIMICAS.-

Bacitracina Desarrollo CI Na Leche+ 0.1%

452C 6,5% Azul Metileno
------- ---
Estreptococo Beta
hemolítico grupo A +
Estreptococo Beta
hemolítico grupo D + + +

l. Prueba de la bacitracina (Maxted).-

Inhibición del crecimiento que sufren los estreptococos
patógenos al ser confrontados con la bacitracina.
a.- Procedimiento.•
1. Preparar una suspensión de gérmenes problema. traspa•
sando 5 colonias a un caldo de cultivo.
2. Incubar el caldo durante 2 horas. para obtener una sus•
pensión óptima.
3. Con un hisopo proceder a sembrar en una caja Petri que
contenga agar sangre, a partir de la suspensión preparada.
4. Con una pinza flameada colocar un disco de bacitracina
(0.04 unidades) en el centro de 1a zona sembrada.
5. Llevar a incubar a 37"'C por el lapso de 18 horas.
6. Realizar la lectura.
b. lnterpretación.-
1. Positiva-
Si la zona o halo de inhibición del crecimiento alrededor
del disco es no inferior de 15 mm.

193
 b. Tratamiento de la muestra.-
En lo posible las muestras se procesarán
inmediamente después de obtenidas.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Los estreptococos precisan de medios de cultivo enrique•
cidos debiendo usarse de preferencia el agar sangre, así
mismo es indispensable el dotarles de 10% de C02
(anhidrido carbónico) a través del método de la vela. que
consiste en colo• car dentro de un recipiente cualquiera. la
Caja Pctri con la siem• bra ya verificada, debiendo situar
una vela encendida sobre esta y dejando arder la misma 15
segundos para finalmente ce• rrar herméticamente con su
respectiva tapa: de esta manera aún arderá unos segundos más
la vela apagándose cuando tengamos aprox imadamcnte IOo/t
de C02 en el interior del recipiente.
Todo este conjunto es incubado a 37°C donde al cabo de
24 horas veremos el siguiente desarrollo:
1. Estreptococo beta - hcninlñico
Colonia, de bordes redondeados. superficie convexa.
as•
pecto húmedo y brillante, consistencia cremosa o mucoide,
de
1-2 mm. de diámetro. translúcidas o a veces. blanco-pálidas,
con zona de Beta hemolisis alrededor de las colonias (anillo
de color amarillo pajizo intenso).
2. Estreptococo alfa hemolítico
Colonias de bordes redondeados. superficie convexa.
as• pecto húmedo y brillante. consistencia cremosa. de 1-2
mm. de díamerro, translúcidas. con zona de alfa hcmólisis de
ahí tam• bién sean llamados viridans.
3. Estreptococo gamma hemolítico
Colonias de bordes redondeados. superficie convexa.
as• pecto húmedo y brillante. consistencia cremosa. de l
mm de diámetro. translúcidas, sin zona de hemólisis
alrededor de las colonias. Por eso se sanciona como mal
llamados gamma.

192
4. Patogenia.-
Está dada por las toxinas y/o enzimas, en su defecto
por los productos de sensibilización formados después del
contacto con estreptococos.
Algunas toxinas y/o enzimas producidas por estreptoco-
cos:
a. Estrcptocinasa (fibrinolisina)
b. Estrepíodomasa (Dcsoxirribonucleasa cstrcptococica).
c. H ialuronidasa
d. Toxina eritrogéníca
e. Difosfopiridin - nucleotidasa
f. Estreptol isinas (hcmolistnas)
5. Patología resumida.-
a. Faringoamigdalitis estreptocócica
b. Erispela - Escarlatina
c. Fiebre puerperal
d. Endocardítís bacteriana aguda
e. Endocarditis bacteriana subaguda (viridans).
f. Enfermedades Post-estreptocócicas:
- Glomerulonefritis Aguda Hemorrágica.
- Fiebre Reumática
g. Otras.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
Lucgo de la toma de muestra, se realiza el frotis, unción
Gram consecutiva para observar las típicas cadenas de estrepto•
cocos.

191
C. ESTREPTOCOCOS.-
1. Morfología.-
Son células más o menos esféricas de un diámetro de
micrometro aproximadamente, son Gram ( +) positivos. Carac•
terísticamente forman cadenas de cocos, a manera de
"cuentas de un rosario".
2. Fisiología.-
Los estreptococos son inmóviles, no forman esporas.
pueden o no poseer cápsulas, desarrollan a un pH de 7.2- 7.4
a una temperatura de 37ºC: aunque hay estreptococos
(enteroco• cos) que son capaces de desarrollar a temperaturas
de 45ºC. Son anaerobios-facultativos, pudiendo existir también
anaero• bio - estrictos (Pcptostreptococcus).
Los estreptococos no son afectados por las sales biliares y
se dividen por fisión binaria en un plano perpendicular al eje
mayor de la cadena.
3. Clasificación.-
La clasificación se basa en el Manual Bergey. sin embargo
por razones didácticas vamos a utilizar otra más simplificada.
Clasificaremos a los estreptococos a partir de su compor-
tamiento en cuanto a hemólisis sobre el Agar Sangre.
a. Estreptococo beta hemolítico (hemólisis completa).
b. Estreptococo alfa hemolítico (hemólisis incompleta).
c. Estreptococo gamma hemolítico (no hay hemó•
lisis). Dentro de los beta-hemolíticos y gracias a la investigación
del carbohidrato "'C" de la pared bacteriana podemos subdivid•
irlos. en grupos serológicos (Lancefield) desde la A hasta la
le• tra U. De estos grupos nos interesan el estreptococo Beta -
he• molítico grupo A (pyogenes), Grupo B (agalactiae) y el
grupo
D (enterococo).
El estreptococo alfa-hemolítico también es llamado viri•
dans.

190
 4. Precaución: Sea cuidadoso al manipular el Amoniaco
(NH3).
c. Interpretación.•
!. Positiva.-
Las colonias toman casi inmediatamente un color rosado.
2. Negativa-
No hay cambio de color.
11. Prueba de manito!
a. Fundamento.-
La capacidad que poseen los estafilococos patógenos para
fermentar el manitol, degradándolo a ácido. provocando el vi•
raje del indicaóor de pH.
b. Procedimiento.-
Utilizar preferentemente medio de Chapman (indicador
rojo fcnol).
1. Inocule una abundante alícuota de estafilococos
proble• ma en el medio de cultivo que contenga manitol. a
través del proccdínucnto del agotamiento.
2. Lleve a incubar a 3TC por el lapso de 18 horas.
3. Realizar la lectura
c. lnterpretación.-
1. Positiva-
Desarrollo de colonias con halu amarillo luminoso.
2. Negativa-
Desarrollo de colonias con ligero cambio de color o sin
cambio.
d. Serotipia.-
Tiene poco valor práctico. excepto las pruebas de tipifica•
ción por fagos específicos para estafilococos que tienen impor•
tancia epidemiológica.

189
 e. Interpretación.-
Es idéntica a la utilizada para reacciones en porta objetos.
9. Prueba de la hemólisis.-
a. Fundarnento,-
La capacidad que tienen algunos estafilococos para herno•
lizar eritrocitos a través de sus exotoxinas (hernolisinas).
b. Procedimiento.-
!. Siempre una alícuota de estafilococos problema en una
caja Petri que contenga agar sangre.
2. Incube a 37ºC por el lapso de 18 horas.
3. Realice la lectura.
c.-lnterpretación.-
1. Positiva-
Anillo de hemólisis completa (color amarillo pálido) alre•
dedor de cada colonia.
2. Negativa.-
No hay Hemólisis.
10. Prueba de la fosfatasa.•
a. Fundamento.-
La capacidad que poseen cienos estafilococos para produ•
cir la enzima fosfatasa, la cual desdobla el difosfato de
fenolf• taleina a fenolftaleina.
b. Procedimiento:
l. Inocule estafilococos problema en una caja Pctri que
contenga agar nutrítivo en cuya formulación tenga 2% de difos•
fato sódico de fcnolftaleína al 0.5%
2. Lleve a incubar a 37"C por el lapso de 18 horas.
3. Transcurrido este tiempo, exponga las colonias
desarrolladas a los vapores de amoníaco (NH3)

188
 - Posítiva.-
Formación de coágulo de cualquier tamaño en cual•
quier espacio de tiempo.
-Negativa.-
No hay formación de coágulo.
8. Prueba de la catalasa.-
a. Fundamento.-
Permite detectar la presencia de enzima catalasa que
po- seen ciertos estafilococos.
b. Procedimiento.•
En porta - objetos.
1. Sobre un porta-objetos limpio y desengrasado colocar
dos gotas de peróxido de hidrogcno (H202) al 3%.
2. Añadir con el asa bacteriológica una colonia de
gér• menes sospechosos y preparar una suspensión sobre el
porta• objetos._
c. Interpretación.-
1. Positiva.-
Producción inmediata de burbujeo.
2. Negativa.-
No hay producción de burbujas
d. En tubo de ensayo.-
1. Vierta 1 ml de peróxido de hidrógeno (H202) al 3% so•
bre un cultivo dispuesto en "pico de
flauta".
2. Si está trabajando con colonias en caja Petri; simple•
mente añada 1 gota de peróxido de hidrógeno (H202) al 3%
so• bre la colonia en cuestión.
3. Precaución: El agar sangre o el caldo sangre pueden dar
resultados falsos positivos.

187
 d. Pruebas bioquímicas.-
COAGU- CATA- HEMO- PIG• FOSFA·
LASA LAS.A LISIS MEN. MANI- TASA
(202C) TOL

St. aureus +/- + + Dorado + +

Amarillo

St. Epider• + Blanco

midis Aporcelanado

St. sapro• + Blanco

phiticus Aporcelanado

7. Prueba de la coagulasa.•
a. Fundamento.-
facultad que presentan ciertos estafilococos para coagular
el plasma a través de la enzima coagulasa.
b. En tubo de ensayo.-
l.Coíocar en un tubo de ensayo 0,3 mi. de plasma fresco
humano citratado u oxalatado.
2. Con el asa bacteriológica traspasar una colonia sospe•
chosa al tubo antes mencionado o 0.2 mi de una suspensión de
estafilococos preparada en Brain Heart Infusíon e incubada du•
rante 24 horas a 37ºC.
3. lievar :i incubación a 37ºC, teniendo la precaución de ta•
par bien el tubo.
4. Leer a las 12 horas, y si hasta aquí la lectura es
negati- va, leer nuevamente a las 24 horas.
a.
Interpretación.-
Algunos estafilococos pueden ser negativos en esta
reacción a las 12 horas, pero hacerse positivos a ésta a
las 24 horas.

186
 d. Neumonías
e. Endocarditis
f. Meningitis y otras.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotls,-
A partir de la toma de muestra donde asiente la
patología. se obtiene la muestra y se realiza frotis,
posteriormente fa tin• ción Gram y la observación
microscopica.
b_ Tratamiento de la muestra-
Toda muestra obtenida donde se sospeche presencia de es•
tafilococos, debe ser tratada dentro de las 6 horas posteriores
a su obtención, debiendo refrigerar las muestras si no pueden
ser procesadas en este plazo.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Los estafilococos desarrollan en la mayoría de los
medios de cultivo; así por ejemplo en agar sangre
observaremos, a las
18 horas después de la siembra el siguiente desarrollo:
l. Estafilococo dorado.-
Colonias de bordes redondeados, superficie convexa, as•
pecto húmedo y brillante, consistencia cremosa. tamaño
varia• ble de 4-8 mm. coloración amarillo-dorada intensa (a
tempera• tura ambiente 15-2ÓºC) y hemólisis completa
alrededor de la colonia.
2. Estafilococo blanco.-
Colonias de bordes redondeados. superficie convexa, as•
pecto húmedo y brillante, consistencia cremosa, tamaño
varia• ble de 2 - 6 mm. coloración blanco-aporcelanada (a
temperatura ambiente 15-20ºC), no hay hemólisis alrededor de
la colonia.
En medios de cultivos líquidos dan enturbamiento uní•
forme.
185
 Los estafilococos no son afectados por las sales biliares
y
se dividen por fisión binaria
Son microorganismos relativamente resistentes a la dese•
cación y el calor, pueden resistir temperaturas de 50'-'C por 30
minutos; resisten también al fenol al 1% durante 15 minutos.
3. Clasificación.-
Para hacer más fácil el estudio de estos gérmenes vamos
a dividirlos en:
a. Staphylococcus aureus (dorado)
b. Staphylococcus epidermldis (albus blanco)
c. Staphylococcus saprophyticus (saprofitico).
4. Patogenia-
Basicamente por las toxinas y/o enzimas que produce
el
Estafilococo dorado.
Algunas toxinas y/o enzimas producidas por estafilococos:
a. Exotoxina
b. Lcucocidina
c. Entcrotoxina
d. Coagulasa
e. Dosixirribonucleasa
f. Beta - lactamasa.
g. Toxina cxfoliativa
h. Otras
5. Patología resumida>
a. Furúnculo
b. Absceso localizado
c. Osteomielitis
184
 CAPITULO XIV

DIAGNOSTICO DE COCOS
PIOGENOS

A. INTRODUCCION
Denominamos Cocos Piógenos a todas aquellas bacterias
de forma redondeada que son capaces de producir supuraciones
(exudados purulentos).
En este grupo podemos hallar a los cocos Gram ( + ),
corno ser estafilococos. estreptococos y neumococos y también
exis• ten los cocos Gram (-), llamados neisserias (gonococos,
menin• gococos).
B. ESTAFILOCOCOS.-
1. Morfología••
Son células más o menos esféricas de un diámetro de 1 mi•
crometro aproximadamente, son Grarn (+). pudiendo al enve•
jecer transformarse en Gram (-).
Característicamente forman racimos de donde reciben el
nombre de estafilococos; aunque es posible encontrarlos en de•
terminados frotis en parejas o cadenas cortas. Es también facti•
ble el observar tenadas de cocos (gaffkya tetrágena) n masas de
células dispuestas en paquetes regulares tridimensionales (sarci•
nas), o redes rectangulares planas (lampropedias).
2. Fisiología.-
Los estafilococos son inmóviles y no forman esporas;
pueden o no poseer cápsulas; desarrollan a un pH de 6,9 a 7.4;
a una temperatura de 37ºC. Son gérmenes halodúricos. aerobios,
aunque muchas veces se comportan como microaerofflicos
(existen también estafilococos anaerobio-estrictos vg. pcptoco•
cos).
183
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 f K8ú0u0s f K8ú0
0us 8xrxus / 9ry7x+K8txrúu◊ / 9rl
xxr9sús
K7tDrK8ús f K8ú0u0s ◊ xFKtDxrúur7 ÜúpDtDxrúKx /9 rl
psxuÜ9
_t r9s +K8ú0u0s
ÜúpDtDxr
ú8u◊ HúZxt
r9úÜxs

180
 CLAVE PARA EL DIAGJ'.OSTICO BASICO

T~::i-~
r-MÜESTRA7

cocos Estructuras Levaduriformes

1
(5-10 um) \
r-----------1
1 1
Hongos (levaduras)

GRAM (+) GRAM (-)

r-------------~ r-------,
Cocos agrupados Cocos agrupados Diplococos Diplococos
en racimos en cadenas aerobios anaerobios
1 1 Caract. culturales 1
! 1
Pruebas bqmcas. 1
ESTAFILOCOCO ESTREPTOCOCO Serología VEILLONELA
r ---- --- --- ----1
GONOCOCO MENINGOCOCO NEISSER!AS
(lntracel.) (lntracel.) SAPROFITAS
( Extr acel.)

COCOS GRAM (+)

r- J ·------·----~
Aerobio/Anaerobio facultativo Anaerobio estricto
r-----------, 1
r - - - - -- ~ -~
Estreptococo
1
11
Estafilo ocos
-,
Peptostreptococcus Peptococcus
Hemolisis Caract. culturales
r- __ r __ -~ueba~b~Tc_:I:,: -,-
1
AL~A GAMMA BETA Staph. aureus Staph. albus Staph.
sapro
1 : 1
phiticus.
1 1 1
Pruebas 1 Pruebas
Bqfcas. : Bqmcas
1 1 .
SeroI◊.1í
1 1 a 1
1 Sapr'ofitos 1
rL------, r--T--,
Neumococo viridans A B D

179
 3. Agar Selectivo para corinebacterias (rnerck):
a. C. diphtheriae, gravis:
Colonias grandes de bordes irregulares ("en forma de
margaritas") superficie plana con un centro ligera•
mente elevado de aspecto húmedo, consistencia cremo•
sa de 1.5 - 2.5 mm. de díametro, coloración gris con el
centro aobscuro.
b. C. diphtheriae, intermedios:
Colonias pequeñas de bordes escotados. superficie pla•
na. con una ligera elevación central aspecto brillante.
consistencia seca. de 0.5 O - 0.7 mm. de diámetro.
gris con el centro obscuro
8. Pruebas bioquímicas.-
SACA- UREASA
PATOGE- ALMIDON GLUCOSA ROSA
NITRATO NO

C. diphthe-
riae gravis '+ + + +
C. dipht.mitis + + +
C. dipht.
interrnedius
-------- :+-
+ +
--- -
C. xerosis + + +
C. pseudodiph-
thericum + +

• La fermentación del almidón, glucosa y sacarosa se realiza con pro•

ducción de ácido pero no gas.

a. Pruebas especiales.-
Cualquier microorganismo que se cultive y sea parecido
al bacilo de la difteria se debe someter a la prueba de viru-

252
mm. de diámetro. de color gris en la parte central y ne•
gro intenso en la periferie, no hay hernólisis
alrededor de la colonia.
b. C. diphitheriae,
Intermedios:
Colonias de bordes. prácticamente redondeados. super•
ficie con una ligera elevación en la prte central, aspecto
húmedo y brillante. consistencia cremosa. de menos de
1 mm. de diámetro. de color negro intenso. no hay
hemólisis alrededor de las colonias.
c. diphthcriae, mitis:
Colonias de bordes redondeados, bien definidos, super•
fici convexa. con una elevación central notoria. aspecto
húmedo y brillante, consistencia cremosa, de 2-4 mm.
de diámetro de color negro azabache intenso (parecen
ojos de pez). Hay hernólisis alrededor de las colonias.
d. C. diphtheriae.
milis.-
Colonias grandes. bordes lisos bien definidos. superfi•
cie convexa. con una ligera elevación central. aspecto
húmedo y brillante. consistencia cremosa de l.5 - 2 mm
de díarnctro, gris con el centro marcadamente obscuro.
e. C. Xerosis.-
Colonias. negras brillantes. circulares. convexas. aspec•
to húmedo. consistencia cremosa, de diverso tamaño.
f. C. pseudodiphthericum.-
Colonias, pequeñas. redondeadas. de bordes lisos, bien
definidos. convexas, húmedas y brillantes. de consis•
tencia cremosa, de 0.5 - 1 mm de diametro. Son blancas
o gris - negras en siembras masivas.
En medios de cultivo líquidos (caldos), C. Diphtheriae,
gravis tiende a formar película en la superficie; C. diph•
theri ae, intermedius da un sedimento granuloso y C.
diphtheriae. mitis crece en forma difusa dando una tur•
bidez homogenca.
251
1. Prueba de Tato.-
a. Coloque la membrana en un vaso de
precipitación que contenga agua caliente (702C).
b. Deje reposar 18 - 24
horas.
c. Realice Ialectura e
interpretación.
1.
lnte1pretación.-
a.
difteria-
Si es que al término de este lapso de tiempo, la
mem•
brana se mantiene
integra.
b. no es difteria-
Si es que el término de este lapso de tiempo, la
mem•
brana se
destruye.
c. características de crecimiento y
desarrollo.•
Coryncbacterium diphtheriae desarrolla preferente•
mente en el Medio de Loeffler o en Agar Sangre (con
telurito de potasio); también hay un medio
selectivo para coribacterias (Merck), Así pues tras
incubación a
37!1C y al cabo de 24 horas obtendremos el
siguiente desarrollo:
l. medio de Loetller:
Corynebacteriurn diphtheriae da colonias de bordes
irregulares, superficie rugosa, granular aspecto seco,
consistencia pulverulenta de I mm de diámetro,
grisáceas, crecen a manera de napa.
2. medio de agar sangre con telurito de
potasio
(Mc.Leod):
a. C. Diphtheriae,
gravis:
Colonias de bordes finamente irregulares superficie
convexa con radiaciones en la periferie de la colonia,
aspecto húmedo y brillante, consistencia cremosa, 4 -
6

250
 c. Corynebacterium pseudodiphthericum (habita en la mu•
cosa nasofaríngea del hombre).
4. Patogenia
En el caso de Corynebacterium diphtheriae (patógeno) es
por la producción de una exotoxina poderosa.
5. Patología
resumida.- a.
Difteria
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frntls-
A partir de muestras obtenidas de fosas nasales, faringe o
lesiones sospechosas se pueden realizar el correspondiente tro•
tis y tinción Gram al cabo de la cual observaremos la clásica
distribución en "letras chinas" de los bacilos. además de poder
ver la morfología ya explicada anteriormente.
Los corpúsculos metacromáticos son evidenciados con los
métodos de tinción de Albert y el método de Del Vecchio (vea
el capítulo de tinción Gram y otras coloraciones),
b. Tratamiento de la Muestra.-
Es ideal procesar las muestras inmediatamente una vez ob•
tenidas. Recuerde que para esta toma de muestra debe utilizar el
operador barbijo y en lo posible guantes estériles.
Algunas veces es factible desprender la pscudomembrana
que caracteriza a esta entidad patológica, sin embargo no debe
olvidar que a los bacilos los hallará en el lugar de implantación
de la falsa membrana. o sea que necesariamente deberá proce•
der a hisopar, e incluso soltar por lo menos un sector de esta
pseudomembrana. Por otro lado. si fuera posible desprender
parte o toda la membrana. (es sucia, gris. adherente. sangra
mu• cho al desprenderla) puede realizar la prueba de Tato. es
dccí r que con esta prueba podernos orientar si nuestro
diagnóstico corresponde a un proceso diftérico o no.
249,
 - Colocarlos bajo observación diaria en sus
jaulas.
- Si los animales mueren a los 3 ó 5 días por septice-
mia, pudiendo recuperar los microorganismos del bazo,
hígado o corazón del animal, la prueba es positiva.
NOTA: Recuerde que Bacillus cereus es lecitinasa (+},
pudiendo investigarse esta prueba en el medio LE.Y. (lactosa
y yema de huevo).
Bacillus anthracis también responde de manera positiva
(+) en las pruebas de nitratos y Voges-Proskauer.
C. CORYNEBACTERIUM DIPHTIIERIAE.-
L. Morfología.-
Corync bacterium diphtheriae es un bacilo Gram (+)
positi• vo, recto o ligeramente curvo de 1-7 de longitud por
0.3 - O. 7 urn de ancho; en los extremos de estos bacilos se
observan abultamientos que les dan la apariencia de mazos.
Es también corriente el observar que se tiñen con mayor
intensidad en los polos, precisamente donde ~e encuentran los
corpúsculos meta• cromáticos o de Babes - Ernst (merafosfatos
polimerizados).
A veces cuando los cultivos son viejos adoptan formas fi•
lamentosas o cocoides.
2. Fisiología.-
~º forma esporas, no forma cápsulas. son inmóviles. de•
sarrollan a un pH de 7,2 - 7.4 y a 37°C.
Son aerobios y se dividen por fisión binaria. Las corinc•
bacterias resisten relativamente a la acción del medio ambiente.
A 6orc son destruidas en 10 minutos.
3. Clasificación.-
a. Corynebacteríum diphrheriae variedad: gravis, interme•
dius, milis.
b. Corynebacterium xerosis (habita en la conjuntiva del
hombre).
248
 medio de un asa bacteriológica por agotamiento en
cada una de las 2 cajas Petri.
c. Lleve a incubar a 37ºC, para después de 6 horas pro•
ceder a realizar la lectura e interpretación de la caja Pe•
tri con 0.5 Ul/ml de penicilina.
d. La lectura la realizará con una lente de 20x, o con
el objetivo "débil" ( ler objetivo) del microscopio.
e. La caja Petri con 10 Ul/ml de Penicilina debe ser
leída en idéntica forma a las 18 horas.
3. Interpretación•
a. Positiva
Colonias grandes en círculos ("collar de Perlas") en la
caja Petri con 0,5 Ul/ml de penicilina.
Crecimiento mínimo o ausente en la caja Petri con 10
Ul/ml de penicilina.
Resultados: Bacillus anthracis.
b. Negativa
Crecimiento abundante en las dos cajas Petrí, pero sin
formar el fenómeno llamado "collar ~e perlas".
Resultado: Otros Bacillus saprofitos.
4. Investigación de Patogenicidad.- ·
a. Fundamento:
La capacidad que poseen los Bacilos patogénicos para
matar ratones blancos.
b. Procedimiento »
- Preparar una suspensión en l ml. de suero fisiológico
de 2 colonias del Bacilo problema.
- Inyecte vía subcutánea en 10 ratones blancos (2-3 se•
manas de edad).

247
 b. En gelatina bacteriológica, Bacillus anthracis produce
licuefacción, además que el crecimiento adopta un patrón simi•
lar al de un "pino invertido". Los otros bacilos no licuan la gela•
tina.
8. Pruebas bioquímicas.-

---·-
MOTI- HEMO- COLLAR DE CAPSU- GELATI-
LIDAD LISIS PERLAS LAS NA

B. anthracis (-) (-) (+) (+) (+)

- -
B. subtilis (+) (+) (·) (-) (-)

B. csreus (+) (+) (·) (-) (-)

B. niegatherium (+) (+) (-) (-) (-)

a. Motilidad.-
Esta prueba se realiza en agar semísólido y ya fue desa-
rrollada en el capítulo correspondiente a cnterobacterias.
b. Reacción del collar de perlas.-
1. Fundamento:
A partir de la sensibilidad a la penicilina, se buscará la al•
teración en la morfología de las colonias del Bacillus anthracis,
2. Procedimiento.-
a. Preparar 2 cajas Petri con agar soya tripticasa, en la
primera añadir además 0.5 U.1/ml y en la segunda JO
U.1./ml de penicilina.
b. A partir de un caldo nutritivo con los gérmenes
pro•
blema (antigucdad de 24 horas) proceda a sembrar por

246
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
A partir de las muestras obtenidas se puede realizar el
co• rrespondiente frotis y tinción Gram, que nos permite
observar las clásicas células bacterianas en "caña de bambú".
b. Tratamiento de la muestra.-
Las muestras deben ser procesadas en el menor
tiempo posible, aunque las esporas pueden germinar después
de mucho tiempo, en medios de cultivo.
c. Características del cultivo y desarrollo>
El género Bacillus desarrolla en medios habituales; así por
ejemplo en agar soya trípucasa. tras incubación a 37ºC a las
24 horas obtendremos el siguiente desarrollo.
l. Bacillus anthracis.-
Colonias de bordes rizoides (asemejan cabezas de
medu• sa), superficie rugosa, áspera, pero dentro de un
patrón con• vexo. aspecto de "vidrio despulido", consistencia
m ucoide, de
2-6 mm de diámetro, coloración blanquecina, opacas.
Caracte•
risticarnente no hay hernólisis (si está en agar sangre).
En medios líquidos forman precipitados en el fondo
del tubo (a manera de torundas de algodón) mientras que el
resto del medio de cultivo se mantiene transparente.
2. Otros bacilos.-
En medios de cultivo sólidos, dan colonias muy
similares a las del antrax; empero en agar sangre se
muestran he• molíticas.
7. Examenes Alternativos.-
a. Con una lente de 20 x podemos estudiar los bordes
de las colonias. para observar el llamado efecto de "cabeza de
me• dusa".
245
 Las formas vegetativas son destruidas a 55ºC en 40 miau•
tos y a temperaturas de ebullición en 5 minutos.
I .as formas esporuladas resisten hasta decenios, mante•
niendo su visibilidad por lo menos durante 30 años.
Los otros bacilos característicamente son móviles.
3. Clasificación.-
a. Bacillus anthracis (patógeno)
b. Bacillus ccreus (potencialmente
patógeno). c. Bacillus subtilis (sapréfito)
d. Bacillus megatherium (saprofito)
e. Otros Bacilos.
4. Patogenia
A partir del ingreso de las esporas, éstas germinan y pro•
ducen cuadros por su presencia y multiplicación en los tejidos.
además de su capacidad de diseminación a todo el organismo
infectado. ·
Además de la existencia de un complejo toxigénico
que coadyuva en estos cuadros patológicos.
5. Patología Resumida.-
a. Antnrax (Pústula maligna)
b. Neumonía primaria (enfermedad) de los cardadores
de
lana)
c. Septicemia.
Otros Bacilos a veces pueden producir:
a. Meningitis
b. Endocarditis
c. Conjuntivitis
d. Gastroenteritis aguda.

244
 CAPITULO XVII

DIAGNOSTICO DE
BACILOS
GRAM(+)
(BACILOS Y
CORYNEBACTERIUM)

Denominados de esta manera, por teñirse de color violeta

con la tinción Gram y presentar una morfologia similar a un
bastoncito.
A. BACILLUS.-
1. Morfología.-
Son bacilos Gram ( + ). encapsulados, miden 2-5um
de largo por 0.8-1 um de ancho.
Tienen forma característica de "Cañas de bambú" o "va•
gones de tren enganchados", es decir que sus extremos están
re• cortados o finalmente hendidos además de hallarse
dispuestos en largas cadenas. ·
Cuando ha esporulado, las esporas adoptan formas ovales
situadas dentro de la bacteria y precisamente en medio de lacé•
lula. La espora nunca es más ancha que el grosor del
gérmen, no se tiñe con los colorantes de Gram, aunque a veces
presente un ligero tono rojizo en las esporas.
2. Fisiología.-
Bacillus anthracis es inmóvil. forma esporas (Endosporas),
es encapsulado, desarrolla a un pH de 7 ,2 - 7 .4 y a una
tempera• tura de 37ºC. Son aerobios y se dividen por fisión
binaria.
La esporulación es abundante en presencia de oxigeno y a
30 - 40"C . En el organismo humano o animal y a
temperaturas superiores a 40"C e inferiores a 15ºC no hay
espcrulación,

243
sen (Mycobacterium leprae), empero por la obscuridad que aún
rodea a su fisiología. metabolismo y características de cultivo
(aún no se desarrolló un medio de cultivo artificial para este
germen); simplemente indicamos que las técnicas de observa•
ción a partir de frotis se realizan en la misma forma,
teniendo tan solo la precaución de utilizar los decolorantes de
1/3 de la concentración de los utilizados para el bacilo de
Koch.
A la observación microscópica se verán desde bacilos
ais• lados hasta masas ácidoalcohol resistentes donde apenas se
percibe la individualidad bacteriana o finalmente los clásicos
globos o paquetes de bacilos, tan característicos en la lepra.

242
temperaturas que va de 30ºC a 44ºC. Las colonias se hacen visi•
bles algo más rápido que las del bacilo de Koch.

NIACINA REDUCCION DE SIGNIFICADO

NITRATOS CLINICO
Mycobacterium
avium-intrace•
llulare +
Mycobacterium
terrae +
Mycobacterium
xenopi +

4. Grupo IV (De crecimiento rápido):

Las colonias son generalmente incoloras, rugosas, grandes
aunque a veces se observan colonias blandas céreas y butirosas.
Desarrollan a 37ºC y se hacen visibles a las 72 horas. Hay que
tener mucho cuidado en su diagnóstico pues a veces se dejan
pa• sar 15 días y se pueden confundir con Mycobacterium
tuberculo• sis.
Así concluimos este acápite dedicado a las Micobactcrias,
probablemente deberiamos referimos a otra Micobacteria
res• ponsable de la llamada "maldición bíblica", el bacilo de
Han-
NIACINA REDUCC. DE NITRAiO SIGNIFIC.
CLINICO

Mycobacterium
fortuítum + +
Mycobacterium
chelonei +
Mycobacterium
phlei +
Mycobacterium
smegmatis +

241
la pigm entación de las colonias en inicio es de color amarillo
limón, haciendose posteriorrnente anaranjadas y finalmente ro•
jas al envejecerse. Desarrollan a 37ºC y en dos semanas ya son
visibles.

REDUCCION SIGNIFICADO
NIACINA NITRATOS CLINICO
Mycobacteriu + +
m kansasi
Mycobacteriu
m
marinum +

2. Grupo 11 (Escotocromógenas):
Las colonias son de color amarillo o anaranjado
cuando crecen en la obscuridad, haciéndose anaranjado-rojiza
cuando son expuestas a la luz visible. Desarrollan a 37ºC y en
2-3 se• manas de incubación ya son visibles.

NIACINA REDUCCION DE SIGNFICADO

NITRATOS CLINICO
Mycobacteriu +
m
scrofulaceum
Mycobacteriu
m gordonae
Mycobacteriu
m
flavescens +

3. Grupo III: (No fotocromógenas):

Las colonias son de color canela o translúcidas,
pudiendo adoptar formas radialmente lobuladas y delgadas.
Desarrollan a

240
los bacilos virulentos (cepas eugónicas) son capaces de orde•
narse en cadenas paralelas, dando la apariencia de un trono
de serpentina.
c. Fracción Polisacárida-
Los BAAR presentan polisacáridos en su pared, no
ha• biendo aún una explicación total respecto a su papel en l~
pato• genia, empero hoy por hoy se sabe que esta fracción es
capaz de interferir algunas reacciones antígeno - anticuerpo
"in - vitre".
d. Fracción Proteica-
También llamada tuberculo-protcina, ésta es
responsable de las reacciones a la tuberculina, siendo capaz
también de provocar la formación de anticuerpos.
3. Hasta aquí hemos visto el crecimiento y desarrollo de
bacilos típicos, esto es que el cabo de 15 días más o menos den
colonias eugonícas o disgónicas: por otra parte mantienen un
determina• do patrón de conducta en cuanto a las pruebas
bioquímicas. Pero que pasa si por ejemplo, las colonias
aparecen en seis días o adquieren coloraciones en la medida
que juegan con la luz y la obscuridad; este tipo de respuesta
es por completo raro, atípico.
Es así que ingresamos al campo de las micobacterias
atípicas, anónimas o no clasificadas; imagine el lector, era
prácticamente imposible el tratar de clasificarlas y menos
aún de ubicar su patogenicldad; hasta que apareció Runyon
quien agrupó a estos microorganismos logrando al fin hallar
algunos denominadores comunes que permitieron su ulterior
clasifica• ción.
D. CLASIFICACION DE
MICOBACTERIAS ATIPICAS.-
1. Grupo I
(Fotocromógenas):
Aquellas colonias que se vuelven pigmentadas
solamente despues de un tiempo de exposición a la luz
visible. En genera]
239
 2. Negativa:
Mantiene un aspecto lechoso.
NOTA: El bromuro de cianógeno es muy tóxico, por tan-
to se debe manipular con sumo cuidado.
1. Reducción de nitratos a nuritos-
1. Fundamento:
La capacidad que poseen algunas mícobacterías de
poder reducir el nitrato (N03) a nitrito (N02).
El procedimiento se describe en el capítulo de gér•
menes anaeróbicos.
m. Pruebas serológicas.-
- PPD (Detecta hipersensibilidad del paciente).
- ELISA (Detecta anticuerpos del paciente).
C. ANEX0.-
1. La inmunización (relativa) se consigue con el BCG (Bacilo
de Calmctte y Guerin), una cepa bovina atenuada del Mycobac•
terium. Su materia prima la constituyen bacilos tuberculosos
avirulentos vivos.
2. A nivel de la pared celular del Mycobacterium tuberculosis
podemos hallar cuatro fracciones características.
a. Fracción lipídica.-
Entre estas tenemos lípidos complejos, ácidos y ceras. Es•
tas son más abundantes en comparación a cualquier bacteria de
otro género.
b.- Fracción lípoide.-
Esta fracción es reponsable del llamado "factor forma•
dor de cordones". es decir que un lipoide como el ácido tre•
halosa 6 - 6 dimicolato es el responsable de formar "cor•
dones". mismos que se caracterizan por el hecho de que solo

238
 g. Mantenga el tubo en posición vertical durante 5 mi•
nutos y a temperatura ambiente.
h. Realice la lectura.
i. Interpretación>
Medir en milímetros la altura de la columna a burbujear
sobre la superficie del medio de cultivo.
1. Negativa o muy débil:
31 mm. de burbujas
2. Dudosa:
Entre 31 y 45 de burbujas
3 .. Positiva:
45 mm. de burbujas
j. Prueba de la níacina.•
l. Fundamento:
La capacidad que tienen algunas mycobacterias de produ•
cir ácido nicotínico libre en el medio de cultivo.
2. Procedimiento:
a. Depositar sobre las colonias problema l ml. de agua
destilada estéril.
b. Dejar reposar por lO minutos.
c. Con mucho cuidado extraer el líquido sobre un
pequeño frasco o tubo de ensayo.
d. Agregar 1 mí. de anilina al 4% en etanol (95%) y 1
ml. de bromuro de cianógeno al 10% (solución acuosa).
e. Realizar la lectura.
k. Interpretacíón.-
1. Positiva:
Toma una coloración amarillenta.

237
 g. Interpretación.•
1. Positiva:
Hay una produccíón casi instantánea de burbujas o a veces
tardará hasta 15 m in.
2. Negativa:
No hay burbujeo.
NOTA: No olvide flamear el asa antes y después de cada
trabajo.
Una vez concluida la interpretación de esta reacción pro·
ceda a colocar los portaobjetos utilizados (con la muestra ínclu•
sive) dentro de los recipientes preparados para tal efecto (luego
serán esterilizados).
h. Prueba de la catalasa.•
Semicuantitativa (técnica aconsejada).
l. Fundamento:
El mismo que el anterior ya descrito.
2. Procedimiento:
a. En base a medios de cultivo (Lowenstein-Jensen) en
una cantidad de 5 ml destribuidos en tubos estériles de
18 x I 50 mm (con tapa de rosca), adecuados en posi•
ción de Pie (coagulados de esta manera).
b. Inocule la superficie con suspensión de BAAR.
c. Lleve a incubar a 37ºC por el lapso de 2 semanas.
d. Si al cabo de este tiempo hay buen desarrollo, con•
tinue con el siguiente paso, de lo contrario mantenga
un tiempo más en incubación.
e. Mezcle panes iguales de peróxido de hidrógeno al
3% y solución de Tween al l 0%
f Agregue 1 rnl de esta muestra al tubo de
cultivo.

236
 ( ++) = Colonias separadas (más de l 00)
(+++) = Colonias confluentes.
e. Pruebas Bioquímicas.-

CATALASA REDUCCION DE NIACINA

NITRATO

Mycobacterium
tuberculosis +
+ Mycobacterium
bovis

f. Prueba de catalasa.•
Cualitativa Básica.
1. Fundamento:
La ausencia de enzima catalasa en las poblaciones de My•
cobacteriurn, no reaccionando de esta manera con el
peróxido de hidrógeno.
2. Procedimiento:
(antes de llevar a cabo esta o cualquiera de las próximas
reacciones: proceda como requisito indispensable a utilizar
a manera de protección, gorro. barbijo y guantes de goma).
a. Escoja una colonia de Mycobacterium (ahora
más que nunca, dentro del área de protección que le
brinda el mechero) con el asa bacteriológica.
b. Deposítela sobre un portaobjetos donde
previamente ha colocado una gota de agua oxigenada.
(peróxido de hidrógeno) al 3% (10 volúmenes).
c. Observe y proceda a interpretar (espere hasta
15
min.).

235
 Finalmente procedemos a inocular en elmedio de cultivo
de Lowenstein - Jensen por inundación con pipeta de Pasteur
estéril o bien podemos preparar un frous depositando con la
misma pipeta una pequeña cantidad sobre un porta-objetos.
d. Características de cultivo y desarrollo.-
A 37ºC colocamos los tubos con Lowenstein-Jensen ino•
culados en posición horizontal durante 24 horas: para poderlos
colocar luego en posición vertical el resto del tiempo de incuba•
ción. Tener la previsión de no ajustar muy drásticamente las ta•
pas de los tubos.
La lectura se realiza a los 8 días y así sucesivamente, luego a los
15 días de haber incubado, a los 30. 45 y 60 días finalmente.
1. Mycobacterium tuberculosis:
Colonias de bordes irregulares finos. superficie rugosa, as•
pecto seco. céreo, consistencia bnírosa, color amaritlemo, 2-4 mm de
diánetro, aparentan pequeñas colitlores o verrugas (desarrollo
eugónico). El medio de cultivo tienen en su C0111JX)sición glicerina
2. Mycobacterium bovis:
En medio con glicerina no desarrolla o lo hace en forma
mínima: en cambio en medio exento de glicerina. crece perfec•
tamente (desarrollo disgónico). Colonias de bordes bien defini•
dos, circulares. superficie plana, aspecto húmedo y brillante,
consistencia cremosa, no pigmentadas. a veces se observan con
una ligera tendencia a dar colonias umbonadas (a manera de un
pezón). [)(' 2 - 6 mm de diámetro.
3. Lectura de colonias:
(Según la O.M.S.)
C = Contaminado
(-) = No se visualizan colonias
= Nº de colonias. si hay menos de 20.
(+) = 20 - 100 colonias

234
cesar dentro de las 6 horas después de remitida) se deja reposar
en su recipiente por el lapso de 4 horas, de manera que en for•
ma natural logramos un sedimento. Posteriormente se elimina
todo el volúmen de orina, respetándose tan solo el volúmen del
sedimento. Este es colocado en un tubo cónico y sometido a
centrifugación (2000 1pm) por el lapso de 20 minutos.
Obtenido este nuevo sedimento se procede a resuspenderlo
con agua destilada y se halla preparado ya sea para cultivo o
írotís (realizar estos pasos con pipetas de Pasteur estériles).
2. Esputo:
A partir de la muestra se procede a concentrarla y descon•
taminarla por el Método de Pctroff.
c. Método de Petroff:
En un tubo se procede a mezclar la muestra con hidróxido
de sodio al 4% en proporción de 2 a l. luego se agita vigorosa•
mente por el lapso de 30 minutos, de esta manera estamos des•
truyendo a las bacterias acompañantes y sobre todo estamos
fluidificando el esputo de manera que obtengamos un homoge•
neizado. Luego se procede a centrifugar durante 20 minutos
a
3000 1pm. desechando el sobrcnadante: debiendo añadir al sedi•
miento dos gotas de fcnolftaleina (o mejor aún rojo fenol en
so• lución acuosa); inmediatamente tomará un color rojo
intenso. Ya que este pH no es útil deberemos neutralizarlo.
para este fin utilizamos ácido clorhidrico al 4% (o ácido
sulfúrico al 15%) gota a gota, generalmente bastan 2 a 3 gotas.
Nos damos cuenta que tenemos un pH óptimo cuando la
coloración se haga rosada tenue (opcionalmente controlar con
potenciómetro).
De manera eventual podemos lavar el sedimento
quitándole el exceso del ácido utilizado, para esto añadimos 2
o
3 rnl de agua destilada estéril, agitando y centrifugando a 3000
rpm durante 10 minutos desechando finalmente el sobrena•
dante. Obtenido el nuevo sedimento, éste es resuspendido con 2
mi de agua destilada estéril.
233
desarrolla a un pH de 6,8 - 7,2 y a una temperatura de 37QC.
Son aerobios estrictos Se dividen por fisión binaria con un
tiempo de división bastante prolongado (12-30 horas).
Estos gérmenes se mantienen vivos en el agua hasta un
afio, en los esputos desecados se mantienen viables hasta 2
meses y en el jugo gástrico hasta 6 horas. Son muy sensibles a
la luz so• lar.
3. Clasificación.-
- Mycobacterium tuberculosis
- Mycobacterium bovis
- Mycobacterias atípicas.
4. Patogenia.-
Está dada por su presencia y multiplicación en tejidos,
jue• ga un papel importante la resistencia e hipersensibi-lidad
del huésped.
5. Patología resumida.•
a. Tuberculosís-
Pulmonar, renal, meníngea, intestinal, cutánea, ganglionar,
genital, osteo-articular, etc.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis:
Muy útil pues da el diagnóstico (todo el procedimiento
se halla desarrollado en el capítulo correspondiente a Ziehl•
Ncelsen).
b. Tratamiento de la muestra:
En este punto nos vamos a referir a dos muestras específi•
camente; orina y esputo.
l. Orina:
Se debe obtener por el sistema de 24 horas de recolección,
posteriormente y una vez remitidas a1 laboratorio (se debe
pro-

232
 CAPITULO XVI

DIAGNOSTICO DE MICOBACTERIAS

A. INTRODUCCION.-
Estamos a más de cien años desde que se descubriera al
Mycobaterium tubcrcu1osis y pese al tiempo transcurrido, en
nuestro país aún la tuberculosis sigue siendo una de las pato•
logras prevalentes. es triste tener que asistir todavía a
cuadros de tuberculosis pulmonar, pcritoneal o meníngea y
quizás esto se deba a que desde el descubrimiento de este
bacilo, la acción se concentró en un monocausalismo que se
opuso paradójica• mente a1 policausalismo de Virchow y otros
científicos de esa época (para ellos la causa de la tuberculosis
no era un microbio; sino la suma de efectos como ser: La
pobreza, el hacinamiento. la promiscuidad. etc.). Así pues hoy
descubrimos que no es su• ficiente con aislar al bacilo y
suministrar c1 tratamiento, además es necesario transformar
viejas estructuras socioeconórnícas que obligan a que el hombre
de esta patria se vea sumido en la igno• rancia, pobreza. miseria
y condiciones de degradación humana, y por ende a cuadros
infecciosos (verguenza nacional) como la tuberculosis.
B. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
1. Morfología.-
Este bacilo mide 1-3 um por O. 3 - 0.5 urn es ácido-
alcohol resistente (BAAR) por lo que es teñido con tinciones
como la de Ziehl-Neelsen. En medios de cultivo artificiales
adopta mor• fología cocoide o filamentosa.
2. Fisiología.-
Es un microorganismo inmóvil, no forma esporas. posee
microcápsulas (no observables con el microscopio
compuesto),
231
 Shigella A tnalt. A tnalt. .+/- -
flexneri Shigella A A A A
sonnei Shigella lnatt A lnall .+/- -
boydi
Proteu s vulgaris + V 2A-G
A lnatt. + A-G A + + +
Proteu s 3
morga ni. + A-G lnatt. A-GV lnalt, + +
Proteus 2
mirabilis + + A-G lnalt. + A-G + +
Proteus rettgeri + + AAL lnalt. A-GV lnalt. + V
Pseudomona 4

w1\.) aeruginosa + lnalt. "4 lnalt. lnalt. +

o

(-}: Negativo. 1.- Puede a veces dar urea(+}

(+): Positivo. 2.- Acido y producción de gas
A: Acido 3.- Algunas cepa s aícañnizan
Al: Alcalino 4. - Puede tomar color violeta
lnalt: Inalterado 5.- Solo en la parte superior del tondo
V: Variable 6.- Toda la columna
7.- Variable
(Adaptado de Difco y Merck)
 TABLA CON LAS REACCIONES BASICAS

CITRAT TSI
UREA O FONDO ESTRI H2S FONDO ESTRIA s M
SIMONS A
Escherichia coli A-G A A-G A + V
Ente robacte r
aerogenes
,_ + A·G A A-G A V
Klebsiella V A-G lnalt. A-GV lnalt.
N
N pneumoniaetyphi
Salmonella A lnalt. .+5 A lnalt. +
~ +
Salmonella paratyphi A-G lnalt. A-G lnalt.
Salmonella
schottmuelleri + A-G lnalt. .+6 A-G lnalt. + +
Salmonella
·
choleraesuis + A-G lnalt. A-G lnalt. +
Salmonella
typhimurium + A-G lnalt. + A-G lnalt. + +
Salmonella enteritidis + A-G lnalt. + A-G lnalt. + +
Salman ella A lnalt. V A lnalt. V
gallinarum
Salmonella pulloru m A-G lnalt. + A-G lnalt. +
Shigella dysenteriae A lnalt. A lnalt.
 b. Procedimiento.•
En Pico de Flauta.
1. Inocule gérmenes problema en un tubo que contenga
agar y bromuro de cetil trimetilamonio al 0,5% o bromuro
de hexadeciltrimetilamonio al 0.09% (en "pico de flauta").
2. Incubar a 37ºC por 24 horas.
3. realice la lectura
Interpretación:
a. Posuiva-
Hay crecimiento en el medio de cultivo.
b. Negativa.
No hay crecimiento en el medio de cultivo.
c. Serotipia.-
Pruebas con antisueros específicos para detectar
especie.

228
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotís.-
No es de utilidad.
b. Tratamiento de la Muestra-
Se deben procesar rápidamente las muestras después
de obtenidas.
c. Características de Cultivo y Desarrollo
Pseudomona aeruginosa da colonias translúcidas en
Mac Conkey; teniendo además la capacidad de desarrollar en
agar nutritivo confiriendo una coloración azul-verdosa a todo
el me• dio de cultivo, merced a sus pigmentos (piocianina y
fluorescei• na). Las colonias aisladas tienen bordes más o
menos regulares. superficie plana. aspecto húmedo y brillante,
consistencia cre• mosa. 4 -6 mm. de diámetro y fuerte olor
dulzón.
d. Pruebas bioquímicas.-
TSI
FON• ES- CETRI- LICUEFAC-
DO TRIA GAS H2S MIDE CION DE IN•
GELATINA INOOL
Pseudo•
mona aeru•
ginosa inalt inalt + +

• O puede tomar color violeta.

7. Reacción de cetrimide
a. Fundamento
La capacidad que tienen las pseudornonas de
desarrollar en presencia de cetrimide.

227
l. PSEUDOMONA.- (Familia Pseudomonadaceae)
l. Morfología.-
Es un bacilo Gram (-), mide de 1-3 um por 0,2 - 0,4
um. Se halla formando pequeña cadenas.
2. Fisiología-
Es móvil, no forma esporas, no capsulado, desarrolla un
pH de 7 ,2 y a una temperatura de 37ºC.
Son aerobio-obligadas, a 60ºC se destruyen en una hora.
3. Clasificación.-
a. Pscudomona aeruginosa
b. Pscudomona fluorescens
c. Pseudomona pútida
d. Pseudomona pseudomallei
e. Pseudomona cepacia
f. Pseudomona maltophilia
g. Pscudomona diminuta
h. Otras
4. Patogenia.-
Endotoxínas y presencia en los tejidos.
S. Patología resumida para Pseudomona aeruginosa.-
a. Infecciones en quemaduras
b. Septicemia
c. Enterocolitis aguda
d. Osteomielitis
e. Sinusitis
f. Otitis
g. Mastoiditis y
otras

226
(indicador que detectara la reacción alcalina resultante de la re•
acción positiva), con una alícuota de gérmenes problema.
2. Incube a 37ºC por el lapso de 24 horas.
3. Realice la lectura e interpretación.
c. Interpretación.•
l. Positiva.-
El tubo toma un color rojo intenso (pH) igual o mayor a
8,4).
~- Negativa.-
El tubo toma un color amarillo intenso (pH igual o menor
a 6,8).
d. Procedimiento.•
En pico de flauta (Sólido)
1. Inocule en Agar urca de Christenscn que se encuentra
dispuesto a "pico de flauta" (a un litro de medio de Christensen
basal se debe añadir 50 ml. de una solución urea al 40%) una
alicuota de gérmenes problema.
2. Lleve a incubar a 37!>C por el lapso de 24 horas.
3. Realice la lectura e interpretación.
e. lnterpretación.-
1. Posítíva-

Medio de cultivo toma color rosado intenso.

2. Negativa.-
Medio de cultivo mantiene el color amarillo pajizo.
f. Serotipia-
l. Pruebas con antisuerus específicos para detectar espe•
cies.

225
 Las colonias aisladas son de bordes redondeados, superfi•
cie convexa, aspecto húmedo y brillante. consistencia
cremosa y de 4-6 mm. de diámetro.
d. Pruebas bioquímicas.-

TSI
FON- ES- URE· LICUE- IN- CI-
DO TRIA GAS H25 ASA FAC- DOL TRA-
CION TO
GELATINA
Proteus "aci- inalt.
Vulgaris do inalt. +!- ++ + + +
+ Proteus "aci-
Mirabilis do inalt. +!- ++ + +
+ Proteus aci-
morganii do inalt. -t/- +
+ Proteus aci-
rettgeri do inalt. + + +
-- -
alcal
* Algunas cepas alcalinizan
** Algunas cepas alcalinizan

7. Prueba de la
ureasa- a.
Fundamento.-
La capacidad que poseen algunos microorganismos de hi-
drolizar la urea a través de una ureasa,
b. Procedimiento.-
En tubo.
1. Inocule un tubo de ensayo que contenga caldo con
sales minerales neutras (amortiguado) más 2% de urca y rojo
fenol
224
3. Clasificación.-
a. Proteos vulgaris
b. Proteos mirabilis
c. Proteus morganii (Morganella morganii)
d. Proteos rettgeri (Providencia rcttgeri)
4. Patogenia
Endotoxinas y presencia en tejidos.
S. Patología resumida-
a.
Gastroenteritis b.
Cistitis
c. Pielitís
d. Colecistitis
e. A bcesos pulmonares
f. Meningitis y otras.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
No es de utilidad
b. Tratamiento de la muestra.-
Se deben procesar las muestras en lo posible dentro de
las
12 horas después de haber sido obtenidas.
c. Características de cultivo y desarrollo-
Proteus en el medio de Mac Conkey dá colonias
translúcidas y en el SS dá colonias transparentes con el
centro de color negro intenso: también es factible observar
en Agar Nutritivo un fenómeno (SWARM) llamado de
diseminación, es decir que los microorganismos tienden a
crecer abarcando toda la superficie del medio de cultivo
formando de tanto en tanto, una especie de oleadas; este
fenómeno puede ser inhibido con p-nitrofenil glicerina o
alcohol fenll - etílico.

223
 1. Colonias de bordes bien definidos, redondeados, super•
ficie convexa, aspecto húmedo y brillante, consistencia cremosa
4-6 mm. de diámetro. transparentes.
d. Pruebas bioquímicas.-

TSI MEDIO DE SIM

FON· ES- SULFU- IND- MOVI- MANI-
DO TRIA GAS H2S RO COL LIDAD TOL
--------
S h. flex- ACI-
neri DO INALT.
+/- Sh. boy- ACI-
dii _ DO _! +/- +
NALT. Sh. so- ACI-
nnei DO +
INALT. Sh. dy- ACI-
senteriae DO
INALT.

e. Serotipia.-
1. Aglutinación con antisueros específicos para
determinar la especie y su sub-especie.
H. PROTEUS.-
1. Morfología.-
Son bacilos muy pleomórficos, Gram (- ). de 1 - 3 um. por
0.4-0.6 urn, se sitúan en parejas o cadenas.
2.- Fisiología.-
Son móviles aunque una especie de Proteus a veces
puede ser inmóvil, no forman esporas. no son capsulados,
desarrollan a un pH de 6,9 - 7 ,2 y a una temperatura de 37ºC.
Son anaero• bio-facultativos. Resisten a 60''C durante 1 hora.

222
2. Fisiología.-
Son inmóviles, no esporulados. no capsulados,
desarrollan a un pH de 6,7 - 7 ,2 y a una temperatura de
37ºC, teniendo la particularidad de detener su desarrollo a
45ºC. Son anacrobío• facultativos, se dividen por fisión
binaria. Estos gérmenes son capaces de sobrevivir en el medio
ambiente 12 días. El fenol al
1 % los destruye en 30 minutos.
3. Clasificación.-
a. Shigella dysenteriae (A)
b. Shigella tlexneri (B)
c. Shigella boydii (C)
d. Shigella sonnei (D)
4. Patogenia.-
. Endotoxinas (también una exotoxina) y su presencia en
los tejidos.
S. Patología.-
a. Disentería bacilar.
6. Diagnóstico de laboratorio.•
a. Frotis.-
No es de importancia.
b. Tratamiento de la muestra-
Es ideal obtener muestras con hisopo (hisopado rectal)
o bien procesar las muestras a partir del moco presente en las
eva• cuaciones, obviamente se deberá trabajar con heces
fecales re• cién emitidas.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Las Siguellas darán en el Mac Conkey colonias pequeñas,
redondeadas y translúcidas. de este medio de cultivo
pasaremos al SS. donde tras 18-24 horas de incubación y a
37ºC obtendre• mos el siguiente desarrollo.
221
 d.Pruebas bioquímicas

TSI SIM PARA

FON- ES- UREA
DO TRIA GAS H2S SULFU- INO MOV l M Vi C SA

S. Typhi ACI-
DO lnalt. + + + + - +/-
S. para- ACI-

..
typhy A. DO lnalt. + + /- +!- + + +/-
-
S. schott- ACI-

mulleri DO lnalt. + + + + - + - +!-

S. typhi- ACI-
murium DO lnalt. + + + + + +!-
S. chole- ACI-
rae suis DO lnalt. + + . + +/-
S.ente- ACI-
ritidis DO lnalt. + + + + - +I• .

• Soto en la parte superior del fondo.

·• Toda la columna.

e. Serotipia.-
l. Tipificación scrológica (Esquema de Kauffmann
-
White) para encontrar la especie.
G. SHIGELLA
l. Morfología.-
Es un grupo de bacilos Gram (-), que mide de 0,6 - 3 um.
por 0,2 - 0,4 um. A veces son coco bacilares.

220
 5. Salmonella choleraesuis
6. Salmonella enteritidis
4. Patogenia-
Endotoxinas y presencia en tejidos.
5. Patología resumida.-
a. Fiebre tifoidea (Salmonella typhi)
b. Gastroenteritis (S. Typhimuriuru. S enrentídis)
c. Septicemias (S. choleraesuis)
d. Fiebres Paratífoideas (S. parathyphi, S. schottmulleri).
e. Meningitis y otras.
6. Diagnóstico Laboratoríal.•
a. Frotis.-
Es de poca utílidad.
b. Tratamiento de la muestra.-
Es ideal colocar las muestras por I ó 2 días en caldo verde
brillante ó caldo tctrationato a fin de enriquecer el desarrollo y
eliminar flora acompañante.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Salmonella en el medio de Mac Conk.ey dá colonias
transparentes. redondeadas, circulares. convexas. de aspecto
húmedo y brillante. consistencia mucoidc.
Haciendo el repique en Agar Bismuto-Sulfito de Wilson
Blair y tras incubación por 48 horas a 37"'C obtendremos la
siguiente lectura: Colonias de bordes bien definidos.
circulares, convexas o ligeramente urnbonadas, de aspecto.
húmedo y brillante, consistencia mucoidc, con un centro de
color negro (ojo de pez). bordes claros y ocasionalmente un
precipitado negro de brillo metálico alrededor de las colonias.
En el medio SS produce un desarrollo similar.

219
 J.
Positiva>
Hay licuefacción de la gelatina en cualquiera de las
for• mas descritas en el capítulo de lectura de colonias
e in• terpretación de desarrollo, (no gelifica por el
mecanis• mo de refrigeración).
2.
Negativa-
Se produce gelíficación al ser refrigerados los tubos.
F. SALMONELLA..-
1. Morfología.-
Características similares a las anteriores
enterobacterias descritas.
2. Fisiología>
Salmonella básicamente es móvil, no form a esporas,
puede poseer o no cápsula; desarrolla a un pH de 6,8-7,2 y
a una temperatura de 37ºC. Son anaerobio - facultativas
Las salmonellas tíficas y paratíficas resisten varios
meses en suelos contaminados. En el agua resisten
varias
semanas. En verduras y frutas 10 días: a ser-e se destruyen en
45 minutos.
3. Clasificación.-
Hay más de 1.300 serotipos.
a. Microorganismos tipo.-
1. Salmonella ryphi
2. Salmonella paratyphi A
3. Salmonella schottmuelleri (Paratifica B).
4. Salmonclla typhimurium
218
describa tan solo un trazo. Así puede inocular hasta
cuatro muestras sospechosas.
La caja Petri debe contener agar ADN al 0.2%.
2. Lleve a incubar a 37ºC por el lapso de 18-24 hrs.
3. Proceda a inundar con una pipeta toda la superficie del
agar donde han desarrollado las colonias con el reactivo de este
test (acido clorhídrico 1 N).
4. Realice la lectura.
c. lnterpretación.-
1. Positiva.-
Se presenta una zona clara (halo) alrededor de las colonias.
2. Negativa-
No se presenta esta zona clara.
2. Reacción de la gelatina.-
a.- Fundamento>
La capacidad que tienen algunos microorganismos
de descomponer la gelatina a través de la gelatínasa.
b. Procedimiento.-
]. Inocule por picada en un tubo de ensayo que
posee caldo nutritivo más 12% de gelatina
bacteriológica.
2. LLeve a incubar a 20ºC por el lapso de 5 días.
Proce•
diendo a realizar lectura e interpretación cada
día.
3. La lectura se realizará sacando los tubos inoculados
de la estufa de incubación y refrigerándolos por 30 mi•
nutos antes de leer los resultados.
c. Interpretación.-
217
mente ya que solo algunas veces está asociada con patología,
no profundizaremos en su estudio.
Scrratia marcescens también fermenta lentamente la lacto•
sa, dotándole de un color rojo intenso a sus colonias que las
as• emeja con gotitas de sangre.
Su pigmento rojo (prodigiosina) que es el
tripinilmeteno hace relativamente sencillo su diagnóstico.
Comparte las características morfológicas y
fisiológicas con los gérmenes antes descritos. Es capaz de
producir infec• ciones hospitalarias graves. infecciones del
aparato respiratorio, otitis, sinusitis, meningitis, etc.

Reacciones Bioqulmicas Resumidas de S.

marcescens.- TSI

PARA
MOV1- FON- ES- GAS M Vi C DN GE
H2S LIDAD DO TRIA A LA
ASA TINA
Serrana ACI- VA-:

marcescens
+ DO RIABLE - + + + +

l. Test de la DNA Asa.•

a. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunos microorganismos
de producir desoxinibonucleasa.
b. Procedimiento.•
l. Inocule por agotamiento desde la periferie hasta el
cen•
tro de la Caja Petri, una muestra sospechosa, de manera
que

216
 c. Interpretación.-
1. Sulfuro. -
a.
Positiva.-
Ennegrecimiento del Medio de cultivo.
b.
Negativa-
No hay cambio de color
2. lndol.-
a.
Positiva»
Al aplicar el reactivo de Kovacs (2 gotas) toma colora•
ción rojo intensa en la superficie del medio de cultivo.
b.
Negativa>
Después de aplicado el reactivo de Kovacs no hay
col•
oración o es de otro color que no sea el
rojo.
3. Movilidad.•
a.
Positiva.-
Turbidez difusa o crecimiento visible que se aparta de
la línea de picadura hacia las paredes del tubo de en•
sayo.
b. Negativa-
El crecimiento se limita a la línea de picadura. no ha•
biendo enturbiamiento difuso.
d. Serotipia.-
1. Prueba oc Quellung (Reacción de Neufeld)
2. Antisueros para detectar tipos antigénicos.
E. HAFNIA - SERRATIA.-
 Hafnia es un grupo bacteriano que se caracteriza por ter•
memar lentamente la lactosa y dado que en su
comportamiento bioquímico es muy parecida a Enterobacter
aerógcncs y final-

215
diámetro, coloración roja a rosada intensa, con brillo casi
metálico. Al tocarlas con el asa bacteriológica y luego levantar
este instrumento, se desprende un filamento mucoide tirante.
d. Pruebas Bioquímicas.-
Tan solo colocaremos las reacciones típicas de
Klcbsíella pneumoniae.

AGARTRIPLE ME0IO0E
AZUCAR-HIERRO TSI SIM

FONDO ESTRIA GAS H2S Sul- In. Moti•

furo dol lidad
Klebsiella Acido Acido +/-
pneumoniae

7. Agar Triple Azucar - Hierro TSI.-

Ya fue discutido en la sección correspondiente a Escheri•
chia coli.
8. Medio de SIM.-
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas bacterias de poder
formar sulfuro de hierro como consecuencia de la reducción
del tiosul• fato a H2S, el cual reacciona con la sal férrica.
También está in• cluida la capacidad de formar indol a partir
del triptófano y fi• nalmente la presencia o ausencia de
movilidad bacteriana (que se aprovecha en este medio semi-
sólido).
b. Procedimiento.-
1. Inocule con aguja bacteriológica por picada a partir
de una colonia problema en el medio de SIM.
2. Lleve a incubar a 37ºC por el lapso de 18 hrs,
3. Realice la lectura.

214
4. Patogenia.-
Endotoxinas y presencia en los tejidos.
5. Patología resumida.-
a. Klebsiella pneumoniae:
1. Gastroenteritis
2. Neumonía Lobar
3. Meningitis Purulenta
4. Otitis ~ mastoiditis
5. Infecciones Urinaria'>
6. Septicemias y otras
b. Klebsiella rhinoscleromatis:
1. Rinocsclcroma
c. Klebsiella ozaenae:
l. Ozena
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
Es de utilidad ya que después de la unción Gram podemos
observar las cápsulas por refringencia.
b. Tratamiento de la muestra-
Las mismas consideraciones que para Eschcrichia coli.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Klebsiella al desarrollar en el Medio de Levine o Mac
Conk.ey, tras incubación a 37ºC y luego de 18 horas presenta el
siguiente desarrollo.
1. Colonias de bordes redondeados superficie convexa. as•
pecto húmedo y brillante. consistencia francamente mucoide,
muchas veces son confluentes, tamaño que va de 6-1 O mm. de

213
 c. Características de Cultivo y Desarrollo.-
Entcrobacter aerógenes al desarrollar en medio de Levine
(EMB) incubado a 37ºC luego de l 8 horas presenta el si•
guiente crecimiento:
1. Colonias de bordes redondeados. superficie convexa.
aspecto húmedo y brillante, consistencia mucoide. tamaño que
va de 4-6 mm. de diámetro con el centro pardo grisáceo, colora•
ción azul-verdosa, con ligero brillo metálico.
d. Pruebas bioqufmicas.-
Ya fueron revisadas al hablar de Escherichia coli.
e. Serotipia.-
Antísucros específicos para detectar tipos antigénicos de
Enterobacter aerógenes.
D. KLEBSIELLA.-
1. Morfología.-
Klebsiella es un bacilo gram ( - ) negativo,
encapsulado mide 1-3 um por 0J 0,5 um.
2. Fisiología.-
Es un microorganismo inmóvil. no forma esporas,
desarrolla a un pH de 7 2 - 7,4 y .a una temperatura de 30º
a
379C.
Es anaerobio - facultativo. y se divide por fisión binaria.
Resiste a los agentes exteriores con relativa constancia. A
55ºC es destruida en 30 minutos.
3. Clasificación.-
a. Klebsiclla pncumoniae
b. Kiebsiclla rninoscleromatis
c. Klebsiella ozaenac

212
C. ENTEROBACTER AEROGENES.-
1. Morfología.-
Es un bacilo Gram (-), pleomórfico, mide de 0,8-3 um por
0,2-04 um. Es frecuentemente encapsulado.
2. Fisiología.-
Puede ser móvil o inmóvil, no forma esporas. desarrolla
a un pH de 7,2-7.5 y a una temperatura de 30º-37ºC.
Son bacterios anaerobio-facultativos.
bioquímicamente muy activos y se dividen por fisión binaria.
En cuanto a su resistencia frente a los agentes del
medio ambiente prácticamente es similar a Escherichia coli.
3. Clasificación.-
a. Enterobacter acrógenes.
4. Patogenia.-
Endotoxinas y presencia en los tejidos.
S.- Patología
re~'Umida.- a.
Cistitis
b. Piclonefritis
c. Pleurccía
d. Meningitis
e. Infecciones hospitalarias y otras.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
Procedimiento que no ayuda a dilucidar el
problema. b. Tratamiento de la muestra.-
Las mismas consideraciones que para Escherichia coli.

211
ficación y/o alcalinización dependiendo del fenómeno bio•
químico que suceda.
b. Procedimiento.-
1. A partir de un cultivo puro de gérmenes problema rea•
lice la siembra en el medio de TSI (pico de flauta) por agota•
miento en la zona de estría y por picada en la zona columnar.
2. LLevc a incubar a 37ºC. por el ; lapso de 18 - 24 horas
(las tapas deben estar sueltas).
3. Proceda a realizar la lectura, comparando con una
tabla especial para tal efecto.
4. Interpretación.•
a. Acido:
Color amarillo intenso
b. Alcalí:
Color rojo intenso
c. Inalterable:
No altera el color original del medio de cultivo.
d. Gas:
Medio de cultivo suspendido quedando en el fondo
un sector de gas, o en su defecto fractura del agar por
for• mación de este.
e. HzS (+).-
Ennegrecimiento.
f H2S (-).-
No hay ennegrecimiento.
c. Serotipia.-
Titulación con antisueros específicos para detectar tipos
antigénicos de Escherichia coli.

210
 NOTA: El alfa-natfol es preparado al 5% en alcohol
etílico de 95º. El hidróxido de potasio (KOH) es preparado en
solución acuosa al 40%.
* Citrato (C).-
a.
Fundamenta-
La capacidad que tienen algunas enterobacterias de
poder utilizar el citrato como única fuente de carbono.
b. Procedimiento=
}. Realice una siembra con gérmenes problema por el
sistema de agotamiento en el Medio de Citrato Simons
(su indicador es el azúl de bromotimol).
2. Incubar a 379C por el lapso de 24 horas (dejar floja
la tapa).
3. Realizar la lectura.
c.
lnterpretación.-
1. Positiva.-
Hay desarrollo y el medio de cultivo toma un color azul
intenso.
2. Negativa=
No hay desarrollo y obviamente no habrá cambio de
color. conservando el medio de citrato Simons su color
original (verde).
8. Triple Azúcar - Hierro TSI.•
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen las diferente enterobacterias de
fermentar glucosa, sacarosa y lactosa o de hacerlo solamente a
partir de uno o dos de estos azúcares. Por otro lado la capacidad
de formar hidrógeno sulfurado (H2S) a partir de la reducción
del tiosulfato, y la capacidad de producir gas o no. Hay que
añadir también que existirán de este modo reacciones de acidí-
209
 3. Negativa» Color Amarillo
NOTA: Reactivo rojo de metilo
Rojo de metilo O, 1 g.
Alcohol etílico 959 300 mi.
Agua destilada 200 ml.
* Voges - Proskauer (Vi).
a.
Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas enterobacterias de
producir acetil-metil-carbinil a partir de la glucosa, el
cual en presencia de un álcali es oxidado a di acetilo.
b.
Procedímiento.-
1. A partir de un tubo que contiene el mismo medio de
cultivo especificado en la reacción del rojo de metilo,
con el gérmen problema e incubado 12 • 18 horas reali•
zar un fraccionamiento de l ml, a otro tubo (en forma
aséptica).
2. Agregar al tubo con el fraccionamiento 0;6 ml de
al•
fanaftol, mezclar suavemente.
3. Luego agregar 0.2 ml. de hidróxido de potasio
(KOH) y agitar.
4. Dejar reposar el tubo 30 minutos.
5. Realizar la lectura.
c.
Interpretación.
l. Positiva.:
Se se produce una capa de color rojo en la parte superior.
2. Negativa.-
Si se produce algún color. el mismo no es rojo.

208
c. Interpretacion.-
1. Positiva.-
Formación de un anillo rojo
2. Negativa.-
Si se formara una capa, ésta no es de color rojo.
NOTA: Reactivo de Kovacs:
Para dimetil amino benzaldehido 5 g.
Alcohol isoamílico 75 ml.
acido clorhídrico 25 ml.
* Rojo de metilo (M).
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas enterobacterias de
poder bajar el pH de su medio de cultivo a 4,5 o por de•
bajo de éste.
b. Procedimiento>
]. A partir de un tubo que contiene caldo pcptonado,
glucosado amortiguado (medio de Clark - Lubs ó Me•
dio MR-VP) donde se ha sembrado el gérmen proble•
ma e incubado 48 horas; realice un fraccionamicntode
3 ml. en otro tubo (en forma aséptica).
2. Agregue al tubo donde se verificó el fraccionamiento
5 gotas del reactivo rojo de metilo.
3. Realice la lectura.
c. lnterpretación.-
1.
Positiva.-
Rojo brilJante casi instantáneamente.
2.
Dudosa.-
Color anaranjado
207
 3. C. Septicum
4. C. histolyticum y otras
c. Clostridium botulinum
3. Bacilos Gram (+)No Esporulados.-
a. Actynomices israelii
b. Arachnia propionica
c. Propionibacterium acnes
d. Bifidobacterium eriksonii
e. Eubacterium lentum
4. Cocos Gram {-).-
a. Vcillonella spp.
b. Mcgasphaera spp.
c. Acidaminococcus spp.
S. Cocos Gram ( + ).-
a. Peptococcus niger
b. Peptostreptococcus asachorolyticus
c. Peptostrcptococcus anacrobius ·
B. MORFOLOGIA.-
En general los bacilos de este grupo se presentan píeomor•
ficamente, cocoides y filamentosos. En el caso de Bifidobacte•
rium se puede observar que uno de los extremos se halla bifur•
cado. Las fusobacterias exhiben morfología a la manera de
estructuras gruesas y aguzadas en los extremos, a la vez que se
tiñen de forma irregular. Leptotrichia mantiene una figura
larga y filamentosa, en tanto que Eubacteríum adopta formas
encur• vadas y regordetas al examen directo. En el caso de los
esporu• lados la presentación es la siguiente:

256
 CAPITULO XVIII

DIAGNOSTICO DE
GERMENES
ANAEROBICOS

A. DEFINICION.-
Se denomina microorganismos anaeróbicos a aquellos que
no precisan de oxigeno libre en su habitar para desarrollar y
eventualmente causar patología.
B. CLASIFICACION.-
1. Bacilos Gram (-).-
a. Bacteroides fragilis
b. Bacteroides pigmentados
c. B. Melanínogenicus
d. B. asacharolyticus
e. B. intermedius
f. Leptotrichia buccalis
g. Fusobacterium nucleatum
h. Fusobacteriurn necrophorum
i. Fusobacteriurn mortiferum.
2. Bacilos Gram ( +) Esporulados.-
a. C1ostridium tetani
b. Oostridios de la gangrena gaseosa.
l. C. perfringens
2. C. novyi

255
lencia (prueba de toxigenicidad) antes del diagnostico bacte•
riano.
Existen dos tipos de pruebas:
l. in-vivo.-
El cultivo se emulsiona y se inyecta 4 mi. por vía sub•
cutánea en dos cobayos. Uno de los cuales recibió 250 a 500
U. de antitoxina por vía intraperitoneal.
El cobayo no protegido muere después de la inoculación
a los dos a tres días.
2. in-vitro.-
Se utiliza una tira de papel filtro con antitoxina. se
coloca en el medio de cultivo con suero de caballo al 20%, se
inocula la muestra en estrías formando ángulos rectos, se
realiza la lec• tura a las 18 horas.
Interpretación: cuando el cultivo produce toxina se verá
en la unión con la tira de papel una delgada linea de
precipitación. Este metodo es llamado también eleck.

253
l. Clostrídium
tetani.-
Es clásica la presencia de una espora terminal esférica que
se sitúa en un polo de la bacteria, siendo más ancha que el mis•
mo gérmen; por lo cual le da el aspecto de "palillo de
tambor". No forma cápsula.
2. Clostridium
perfringens.-
Es más gruesa. con extremos redondeados. La espora es
subtermínal, ovalada cuyo diametro es mayor que el del micro•
organismo. Es encapsulado.
3. Clostridium
novyi.-
Es grande, polimorfo y de extremos redondeados; a veces
se dispone en cadenas cortas. no produce capsulas. las esporas
son ovales. subterninales y son más anchas que el bacilo.
4. Clostridium
septicurn-
Es polimorfo, pudiendo dar formas filamentosas. No for•
ma cápsulas, sus esporas son centrales o subtcrminales: defor•
man por sus dimensiones a esta bacteria.
5. Clostridium
histolyticum-
Es polimorfo; las esporas son centrales o subtenninales al•
tetando la morfología de estos bacilos.
6. Clostridium
botulinum.-
Es un bacilo grande, polimorfo con extremos redondeados.
Las esporas son ovales y subterminales, alterando la morfología
regular del bacilo y dándole una forma de "raqueta de tenis".
En lo que respecta a los cocos observamos que Veillonella
se agrupa en masas a la vez que puede también asociarse en pa•
rejas (diplococos). Megasphaera posee un tamaño algo mas
grande que el resto de sus géneros afines. Los Peptococcus pue•
den describir cadenas muy cortas. de cualquier manera la forma
habrá de corresponder a racimos. Los Peptostreptococcus for•
man grandes cadenas donde las unidades pueden presentarse de
forma cocoide.

257
C. FISIOLOGTA.-
Todos estos microorganismos desarrollan a un pH de 6.9 -
7.6 y a una temperatura de 35-37"C. Son anaerobio - estrictos y
se dividen por fisión binaria.
En el caso de los clostrídios, todas sus cepas forman
espo• ras. algunos son encapsulados. muchos son móviles y las
for• mas vegetativas son destruidas a temperaturas de ó0-
7(tC por el I apso de 10 minutos. Las esporas presentan gran
resistencia
a la acción ambiental,
D. PATOGENIA.-
!. Bacilos Gram (-).-
Su presencia y producción de toxinas.
2. Bacilos Gram ( +) No Esporulados.-
Su• presencia en los tejidos y probablemente por toxinas.
Incide grandemente el sistema inmune.
3. Cocos Gram (+) y Gram (-).-
Presencia en los tejidos. probablemente toxinas y dcpau•
pcración inmune.
De manera general también es importante la existencia de
lesiones congénitas que sirvan de "blanco" para estos gérmenes.
En la gangrena gaseosa. es la presencia de los gérmenes y
la producción de toxinas.
En el tetanos, es la presencia de los gérmenes, y
también la producción de toxinas.
En el botulismo. basta tan solo la presencia de toxinas fa•
bricadas fuera del organismo humano.
E. PA TULOGIA RESUMIDA.-
1. Bacilos Gram (-).-
Procesos purulentos en general. asociados sobre· todo a
tórax, pelvis y abdomen.

258
2. Bacilos Gram l +) No Esporulados:
a. Actinomicosis
b. Sepsis
c. Endocarditis bacteriana
d. Colpitis
J. Cocos Gram (+) y Gram (-):
a. Endocarditis bacteriana
b. Sepsis
c. Procesos purulentos
4. Bacilos Gram (+l Esporulados:
a. Clostridium tetani (Tétanos)
b. Clostridium botulinum (Botulismo)
c. Clostridios (otros) (Gangrena Gaseosa)
F. DIAGNOSTICO LABORATORIAL.-
1. Frotis.-
En todos los bacilos no esporulados el pleomorfismo
habrá de ser determinante y asi entonces a partir de muestras
purulen• tas será posible observar este detalle; ~n tanto que en
los casos de sepsis y/o endocarditis este procedimiento no
redundará en mucho beneficio. Para los ClXOS las
consideraciones son las mismas.
Es muy dificil poder visualizar a los clostridios. sin em•
bargo a partir de muestras de heridas (tejidos. exudados puru•
lentos, etc) y después del frotis y tinción Gram podremos obser•
var a los gérmenes de la gangrena gaseosa. aunque no
siempre en estadios de esporulación. Clostridium tctaní es mas
dificil de ser hallado en un frotis directo: empero también lo
buscaremos en el sitio de la probable puerta de entrada al
organismo (heri• das, etc.). Clostridium botulinum debe ser
pesquisado en los
259
restos de alimentos - causa probable de la intoxicación - de
donde se lo obtendrá para ulteriores pasos de identificación;
también es factible buscar la toxina de este gérmen ya sea en el
suero de los pacientes o en los restos de comida no ingerida.
2. Tratamiento de la muestra:
Las muestras una vez obtenidas deben ser rápidamente
procesadas, pudiendo mantenerlas en condiciones de refrigera•
ción y anaerobíosis si fuera preciso retardar su procesamiento.
3. Caracteristicas de cultivo y desarrollo
Todos los anaerobios precisan de medios de cultivo enri•
quecidos (agar sangre) muchas veces suplementados con fac•
tores de crecimiento algo complejos. al igual que el ajuste de
las condiciones de anacrobiosis.
a. Sólidos en caja Petri.-
1 . Agar sangre
2. Agar infusión cerebro-corazón
3. Agar soya tripticasa
4. Agar brewer
b. Sólidos en tubo de ensayo.-
!. Básicamente los mismos citados anteriormente,
2. Agar para clostridios (merck)
e_. Líquidos en tubo de ensayo>
1. Caldo tioglicolato
2. Caldo para esporulación (Mcrck)
3. Crudo con carne picada
d. Semisólidos en tubos de ensayo.-
1. Tioglicolato con adición de 2.5 g. de Agar para estudio
de motilidad.

260
 2. Medio tioglicolato.
Los medios de cultivo en caja Petri y aquellos sólidos en
tubo de ensayo. necesariamente deben ser incubados en siste•
mas de anaerobiosis - Jarras de anerobiosís - que tienen dife•
rentes pricipios, como ser: Desplazamiento del aire por un gas
inerte (gas-pak), la absorsíón química del oxigeno (ácido
pirógalíco e hidróxido de sodio), supresión del oxígeno por
combustión (Jarras Brewer), etc.
En otros casos es factible, si es que se ha utilizado un tubo
de ensayo con medio de cultivo "en pie" el sellar la superficie
de éste con una capa de 2 cm. de parafina. luego de efectuada la
siembra "por picada".
En los medíos de cultivo líquidos o semisólidos (tioglico•
lato), no es necesario el incubarlos en esas jarras, pues merced
al tioglicolato que actúa como agente reductor además de la cis•
teina, se logra la anaerobiosis. El indicador de este medio es la
resazurina sódica que vira hacia el color rojo si es que hay un
aumento eventual del contenido del oxígeno.
Tanto los bacilos Gram (-) como los bacilos Gram (+) no
esporulados tienen la facultad de producir colonias irregulares
en las cajas Petri, pudiéndose destacar Actynomices israellí por
dar colonias con ti pica morfología de un "Molar".
En los caldos exhiben un enturbamicnto uniforme además
de olor pútrido.
Los cocos también enturbian de manera uniforme, excepto
los Peptostreptococus que producen ñóculos y desde ya el olor
característicamente pútrido.
En agar sangre los clostridíos presentan el siguiente de-
sarrollo:
a. Clostridium perfringens>
~roducen colonias de bordes prácticamente redondea•
dos, superficie convexa, aspecto húmedo brillante. con-

261
 sístencia mucoide, 3 - 6 mm de diámetro,
translúcidas,
,_.alrededor de las colonias hay un aspecto de "blanco"
pues existe una zona de hemolisis parcial, donde la
zona interna está causada por la toxina theta y la exter•
na por la toxina alfa.
En los casos de intoxicación alimentaria por C. perfrin•
gens sus colonias son de bordes redondeados. superfi•
cie con una ligera elevación en la parte central. aspecto
húmedo, brillante, consistencia mucoide, 2 - 3 mm. de
diámetro, transparentes, alrededor de las colonias hay
un parcial aclaramiento (no hay hemólisis por la pro•
ducción de Iecitinasa).
b. C/ostridium
novyi-
Produce colonias de borde rizoides. superficie rugosa
con una ligera elevación central. aspecto húmedo, con•
sistencia cremosa, 3-6mm de diámetro, translúcidas, al•
rededor de la colonias hay una zona de hemolisis.
c. Clostridium
septicum.-
Produce colonias de bordes rizoides. superficie plana.
consistencia cremosa, tiende a ocupar casi toda la su•
perficie del medio de cultivo, translúcidas, examinadas
con lente de 20 x se puede ver que el desarrollo es a
manera de una película conformada por filamentos en•
trelazados. Produce hemólisis alrededor de las colo•
nias.
Las colonias de Clostridium histolyticum son muy pa•
recidas a las de Clostridium novyi.
d. Clostridium
tetani.-
Produce colonias de bordes rizoides. superficie plana,
aspecto húmedo brillante, consistencia cremosa, tiende
a ocupar también toda la superficie del agar sangre,
translúcidas. Es para remarcar el hecho de que a partir
de los bordes rizoides éstos se van prologando en fila-

262
memos caprichosamente dispuesto. Producen hernólisis
cuando el crecimiento es masivo.
e. Clostridium botulinum-
Produce colonias de bordes irregulares. superficie
rugosa. aspecto húmedo. consistencia cremosa de 3-6
mm de diámetro, translúcidas. es característico el
observar que alrededor de los bordes irregulares
aparecen unas ramificaciones filamentosas. Producen
hemólisis alrededor de las colonias.
En el medio de· cultivo tioglicolato los clostridios
desarrollan produciendo turbidez. formando gas y
floculación coposa en la mitad inferior del tubo de
ensayo.
G. PRUEBAS BIOQUIMICAS.-

Colonias Pigmentadas Bilis 20%

Bacteroides fragilis Resistente
Bacteroides pigmentados Sensible
+

l. Prueba de Bilis al 20%

a. Fundamentu.«
La capacidad que posee B. fragilis para resistir la bilis al
20%, debido a su constitución.
b. Procedimiento.-
!. Prepare una solución de bilis buey al 40%.
Esterilice en autoclave.
2. Añada 0,5 mi. de ésta a un tubo con 10 mi. de tioglico•
lato fresco. Esto logra una concentración de 2% (bilis-buey)
igual a 20% de bilis.

263
 3. Inocule 2 tubos de tioglicolato:
a , tioglicolato +
suplemento. b ,--· ----· ,- tioglicolato.
4. Incube 24-48 horas a 37ºC.
5. Realice la lectura.
c. Interpretación.-
Resistente, Desarrollo manifiesto
Sensible No hay desarrollo o este
es insignificante.
Los bacteroides pigmentados característicamente son re•
sistentes a la Kanarnicina.
-------------------~----
INOOL LIPASA

Bacteroides melaninogenicus
Bacteroides.asacharolyticus +
Bacteroides interrnedius + +

Bacteroides melaninogenicus constantemente es sensible

a la neomicina y rifampicina, además pigmenta con una
colora• ción negruzca sus colonias caracteríslicamentc.
2. Prueba de la Lipasa.-
a. Fundamento.-
Algunas bacterias tienen la capacidad de fabricar una lipa•
sa capaz de desdoblar los lípidos en glicerol y ácidos grasos.
b. Procedimiento.-
!. Inocule en un medio de cultivo que contenga yema de
huevo una alícuota con una antiguedad de 24- 72 horas.

264
 2. Incube anaeróbicamcnte 24-48 horas a 37 9C.
3. Lea los resultados.
c. lnterpretación.-
1. Positivo.-
Si aparece en ellas una mancha grasosa tornasol aceite/
agua.
2. Negativo.-
No aparece este fenómeno.

--
lndol 20% bilis
lipasa
Fusobacterium nucleatum +
Fusobacterium + +
necrophorum +
Fusobacterium mortiferum

Las fusobacterias son sensibles a la colistina y la kanami•

cina, en cambio son resistentes a la vancomicina.

GAS MOTI- LEC1· GEU-

LIDAD TINA TINA LECHE
SA SA N

C. perfringens + + + F.T. +
C. novyi + + + e
C. septicum + + + e +
C. histolyticum + + + p
C. tetani + + + e +
C. botulinum + + + + p

F.T. Fermentación tormentosa

C. Coagulaclón
P. Peptonización.

265
3. Prueba de la lecitinasa.•
a. Fundamente>
La capacidad que tienen algunos clostridios de
producir lecitinasa (alfa-toxina), la cual opacifica la yema del
huevo.
b. Procedimiento.-
1. Inocule con el gérmen problema una caja Petri con
Agar Nutritivo con 5% de yema de huevo.
2. Realice la lectura e interpretación.
c. Interpretación.-
!. Negativa-
No se observa una zona opaca alrededor de la colonia.
2. Positiva.-
Hay una amplia zona opaca opalescente alrededor de
la colonia.
4. Reducción de nitratos a nitritos.•
a. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas bacterias para reducir
el nitrato (NO3) a nitrito (NO2).
b.- Procedimiento.-
1. Inocule el génnen problema en 5 ml de caldo
peptona
con 0.1 % de nitrato de potasio (KNO3).
2. Lleve a incubar en condiciones de anaerobiosis a
37ºC
por el lapso máximo de 5 días,
3. Cada día a partir de las primeras 24 horas. después
de haber realizado la siembra. proceda a fraccionar
asépticamente
1 ml de caldo, pasándolo a otro tubo.
 4. En el tubo donde tenemos el fraccionamiento ( I
mi). colocar 3 gotas de ter. reactivo (Dimetil alfa-
naftilamina al
0.6%) y luego 3 gotas de 2º reactivo (ácido sulfanílico al
0.8%).

266
 5. Leer e interpretar
6. Cabe decir que podremos realizar hasta 5 pruebas a par-
tir de una muestra.
c. Interpretación.-
1. Negativa.-
No se produce alteración del color
2. Positiva.-
Coloración roja al cabo de 3 minutos.
La investigación de motilidad y gelatinasa ya se discutió
en el tema de Entcrobactcrias.
Actynornices tiene la facultad de formar "granulos de azu•
fre" en el pus que provocan.
. -
Reducción de nitratos lndol
a nitritos

Actynomices israelii +
Arachnia propiónica +
Propionibacterium + +!-
acnes Bifidobacterium
eriksonii Eubacterium +/-
lenturn

Actynomices y Arachnia pueden ser discriminadas por in•

munofluorcscencia.
El indol fue discutido en el capítulo de enterobacterias.

Reducción de
nitratos a nitritos catalasa glucosa

Veillonella spp. + V
Acidaminococcus fermentans
Meaasphaera elsdenii +

V: Variable. En esta prueba el H202 debe estar preparado

al 15%.
267
 Los cocos Gram ( +) anaerobios son sensibles a 5
microgramos de rnetronidazol, si el halo es igual o mayor a
15 mm.

Novobiodna (Disco)

Peptococcus Resistente

Peptostreptococcus Sensible

lndol Polianetol sul

fonato sódico
(discos)

Peptostrepto. asaccharolyticus + Resistente

Peptostrept. anaerobius Sensible

d. Serotipia.-
En algunos casos se podrá realizar la serotipificación.
e. Pruebas especiales.-
A- través de la cromatografia gaseosa se puede llegar
a identificar perfectamente a estos microorganismos.

268
 CAPITULO XIX

DIAGNOSTICO DE BACILOS
HEMOFILOS Y
BORDETELLAS

A. lNTRODUCCION
Estudiaremos dentro de los Hemofilos al Haemophilus in•
fluenzae; Haemophilus ducreyi, además de citar a otros
hemófilos. Y en el grupo de Bordetcllas nos referiremos a Bor•
detella pertussis, BordetelJa parapertussis y Bordetella bronchi•
séptica.
B. HAEMOPHILUS INFLUENZAE.-
1. Morfología.-
Son bacilos cocoides muy cortos, miden 1 um -2um de
longitud y 0,2- 0.4 um de ancho. Son Gram (-), sin embargo hay
un marcado pleomorfismo dentro del cual se pueden ver desde
largas formas filamentosas. bacilos cocoides y hasta grandes
cuerpos balonados.
2. Fisiología.-
Haemóphilus influenzae es inmóvil, no esporulado, forma
cápsulas. desarrolla a un pH de 7,2 - 7 ,4 a la temperatura
de
37QC. Se comporta como aerobio a anaerobio facultativo . Pre•
cisan para desarrollar de dos factores de crecimiento (Factor X
y Factor V).
Se destruye rápidamente bajo condiciones de desecación,
rayos solares y desinfectantes. A 559 C muere rápidamente.
3. Clasificación.-
a. Haemophilus influenzae
b. Otros haemophilus
269
4. Patogenia-
No produce exotoxinas, actúa por su presencia y
multipli• cación en los tejidos, es probable la producción de
una cndoto• xina.
5. Patología
resumida- a.
Faringitis
b. Sinusitis
c. Laringotraqueitis
d. Bronquitis
e. Bronconeumonías
f. Meningitis
g. Endocarditis
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
A partir del esputo se efectúa el frotis y tinción Gram.
Con líquido céfalo raquideo se practica centrifugación y en el
sedi• mento se busca este microorganismo a través de frotis y
tinción ulterior con Gram.
Hoy en día hay métodos especiales de
inmunotluorescen• cia para la observación del gérmcn,
empero todavía no tiene mucha aplicación en nuestro medio.
También se puede realizar pruebas de tumefacción
capsu•
lar (Qucllung) similares a las utilizadas para los neumococos.
b. Tratamiento de la muestra
Debe ser procesada inmediatamente después de obtenida.
Muchas veces es necesario tomar muestras con el método
de "placa de tos".
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Haemóphilus int1uenzae desarrolla en medios líquidos
y
sólidos, es necesario dotarle del factor X (Hemina) y el factor
V

270
(NAO). Así entonces utilizamos medios de cultivo como el
agar Sangre y el agar chocolate, en los cuales podemos
colocar una cstria de estafilococo dorado en el centro de la
caja Petri (nos asegura la producción de estos factores). y
alrededor sembra• mos la muestra.
A 37ºC en 24 horas podemos realizar la lectura.
Haemophilus influenzae: colonias de bordes
redondeados,
superficie convexa, aspecto húmedo y brillante, consistencia
mucoide, tamaño de 1/mm de diámetro, transparentes, no he•
molíticas. Y por desarrollar alrededor de la estría de Estafiloco•
co dorado, dando inclusive colonias algo más grandes, es que
se denominó a este fenómeno "satelítisrno'.
En caldo sangre desarrollan formando copos blanco•
grisáceos dando un Iígero enturbiamiento uniforme concomitan•
temente.
d. Pruebas bioquímicas.•
No tienen mucha aplicación.
e. Serotipificación.-
1: Tipificación con antisueros
NOTA: A continuación se inserta una tabla con los carac•
teres más importantes de este grupo.
HEMO• CAP- FAC. FAC- SATELI-
LISIS SULA TOA X TOR V TISMO

H. lnfluenzae - + + + +
B. Pertussis + +

C. HAEMOPHILUS DUCREYI.-
Tan solo vamos a dar caracteristicas generales.

271
 Descubierto por A. Ducrcy (1889) a partir de los
trabajos de Peterson (1887). Morfologícamcnte es un bacilo
cocoide de
1.5-2 um de longitud y 0.3 - 0.5 de ancho, Gram (- ). No
forma
esporas ni capsulas. Es microaerofílico se cultiva difícilmente
en agar chocolate a un pH de 7,2 - 7.4 y a 37ºC. a las 48
horas de inoculados dan colonias redondeadas, superficie
convexa,
aspecto húmedo y brillante, consistencia cremosa. de 1 mm
de diámetro, transparente.
La enfermedad producida se denomina chancro blando
(chancroide), que es una enfermedad de transmisión
sexual.
1. Diagnóstico
laboratorial.-
Basicamente se realiza frotis a partir de muestras prove•
nientes de exudados de las capas ulcerosas o de los ganglios
(aspiración ganglionar). Posteriormente se realiza la tinción
Gram.
2.
Observación.-
Bacilos Gram (-) negativos en hileras o cadena<; largas ( ca•
racter típico).
Existen otros hemófilos:
a. Haemophilus para - influenza, Haemophilus
hemoglobi• nophilus, Haemophilus suis, Haemophilus
hemolyucus, Hae• mophilus aphrophilus, Haemophilus
aegyptis, etc.
D. BORDETELLA
PERTUSSIS
l.
Morfologia.-
 Bordetella pertussis es un bacilo Gram (-), corto,
pequeño encapsulado, ovoide. Mide 0.5 - 1 um de longitud
por
0.2 - 0.3 um de ancho. Tienen la característica de que los
po•
los de la bacteria se tiñen con mayor intensidad
(corpusculos
metacromáticos bipolares), aunque este detalles no es
constante.

272
2. Fisiología>
Bordetella pcrtussís es inmóvil. no forma esporas, posee
cápsula, desarrolla a un pH de 6.8 - 7,4 y a una temperatura de
35 - 37'1C. Es aerobia y se divide por fisión binaria.
Es destruida bajo la acción directa de luz solar en l hora.
A 5611C es destruida en 15 minutos;
3. Clasificación.-
a. Bordetella pertussis
b. Bordetella parapertussis
c. Bordetella bronchiséptica
4. Patogenia-
La adhesión del germen y su ulterior multiplicación en la
superficie del epitelio traqueal y bronquial, además de la inter•
ferencia del movimiento ciliar. Se ha comprobado también que
produce por lo menos una endotoxina además de una exotoxina.
S. Patología resumida.-
a. Tos ferina (coqucluche)
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
A partir de muestras provenientes de la tráquea y/o bron•
quios, podemos realizar frotis y posterior tinción Gram: después
de la cual observaremos todas las características en la sección
corrrespondiente a morfología.
h. Tratamiento de la muestra-
Es ideal tomar la muestra en base al procedimiento desig•
nado como "placa de tos", esto significa que en primer lugar de•
beremos colocar una caja Petri con su correspondiente medio de
cultivo a 15 cm. de la boca del paciente, esperando un acceso de
tos; de manera que cuando se efectúe este, destapamos la caja
Petri haciendo que el paciente proceda a toser directamente so•
bre la superficie del medio de cultivo; será también ideal actuar

273
durante este procedimiento dentro del área de seguridad que
nos brinda el mechero.
Una vez obtenida la muestra; con un hisopo estéril hume•
decido en agua destilada esteril, se procede a realizar la dise•
minación de la muestra por "agotamiento".
c. Características de cultivo y
desarrollo.-
Bordetella pertussis, es exigente en cuanto a sus
requeri•
mientos nutricionales.
El medio de cultivo es el de Bordet-Gengou, que está
con• formado por: Infusión de papas, glicerina. cloruro de
sodio, y agar enriquecido con 15% de sangre desfihrinada de
conejo o paloma. Es también ideal añadir a este medio de
cultivo penici• lina (0.5 U .l. /ml de medio)
Después de la siembra incübese a 37ºC en condiciones de
aerobiosis; a las 24 - 72 horas obtendrá el siguiente desarrollo:
- Colonias de bordes redondeados, superficie convexa as•
pecto húmedo y brillante, consistencia mucoide, de l
mm de diámetro, grisáceo con lustre perlado (a manera de
goti• tas de mercurio); producen un halo de hemólisis
relativa• mente estrecho.
En medios de cultivo líquidos (caldo sangre) dan
enturba•
miento y un precipitado poco considerable.
Hay un fenómeno de variación respecto a las colo-nías
en medios sólidos:
l. Fase l.-
Colonias lisas, bacilos encapsulados,
virulentos.
2 Fase Il fase III
Formas
intermedias.
3. Fase
JV
Colonias rugosas, bacilos no encapsulados,
avirulentos,

274
 Estas fases fueron descritas por Hcslier y Gardncr ( 1932)
y se basan primordialmente en la inalterabilidad o la
pérdida de los antígenos de este gérmen.
d. Pruebas bioquímicas-

REDUCCION COLONIAS
MOVIL DE NITRATOS UREASA CITRATO EN BORDET
A NITRITOS GENGOU

Bordetetla
pertussis + (3 • 4) días
Bordetella
parapert ussis + + (1 • 2) días
Bordetella
bronchiseptica + + + + (1 - 2)días

e. Serotipificación.-
Reacciones de aglutinación con antisuero específico para
la identificación de bordctclla.

275
 CAPITIJLO XX

DIAGNOSTICO DE
BACILOS GRAM (-)
PEQUEÑOS
(BRUCELUS, YERSINIAS Y PASTEURELLAS)

A. INTRODUCCION.•
En nuestro país existen casos de brucelosis en todo el
te• rritorio al igual que yersiniosis (Peste), particularmente
en el norte de La Paz y en las regiones de Chuquisaca, Potosí
y Tari• ja. Por otro lado también se detectaron otras
yersiniosis (ente• rocolitica). Así pues es necesario que
sepamos como diagnosti• car con procedimientos
elementales esta patología. Obvia• mente en la actualidad,
es imprescindible recurrir a las reac• ciones serologicas a fin
de tipificar el gérmen en cuestión; em• pero esto no será obice
para que con procedimientos y utensi• lios básicos
establezcamos un diagnostico microbiológico que puede ser
reafirmado con la clínica, la epidemiología y la pato• logía.
B. BRUCELLAS.-
1. Morfología.-
Las brucellas son pequeños cocobacílos que se colocan
en parejas, pequeños grupos o aisladamente: Son Gram (-).
Mide
0.5 - 1.5 um de longitud por 0.4 - 0.6 um de ancho.
2. Fisiología.-
No son esporulados, generalmente no son
encapsulados, son inmóviles, desarrollan a un pH de 6,8 - 7,4 y
a una tempera• tura de 379C. Son aerobios estrictos. En los
medios de cultivo su tiempo de división se halla noto-
riamente alargado. Precisan de ciertos factores de
crecimiento (tiamina, acido nicotínico. etc.) Se dividen por
fisión binaria.
277
 Las brucellas tienen gran resistencia al medio ambiente.
En el estiercol vive hasta 5 meses. en el hielo, mantequilla y
queso, hasta 4 meses; al igual que en la leche.
3. Clasificación.-
a. Brucella melitensís (cabras)
b. Brucella abortus (ganado bovino)
c. Brucella suis (cerdos)
d. Brucella canis (perros)
4. Patogenia.-
Por su presencia y multiplicación en los tejidos,
además por las endotoxinas.
5. Patología resumida>
a. En los animales:
1. Aborto del ganado
2. Brucellosis del ganado
b. En el hombre:
l. Fiebre ondulante (Fiebre de Malta)
6. Diagnóstico laboratorial.-
a. Frotis.-
El Irotis a partir de vísceras de animales muertos
(hígado. bazo) o de fetos de estos mismos, nos permite
observar la clásica morfología ya indicada.
En el caso de infecciones en el hombre. es dificil poder
observarlas en un frotis directo; debiendo realizarse esto a
partir del desarrollo en los medios de cultivo.
b. Tratamiento de la muestra.-
Estas deben ser obtenidas a través de procedimientos
como la punción venosa (hernocultivo): biopsia, aspiración
gan• glionar o de médula osea.

278
 Deberán ser obtenidas en los primeros quince días de ini•
ciado el cuadro (no debe administrarse paralelamente tratamien•
to antibiótico) Una vez recogidas. éstas deben ser procesadas in•
mediamcnte.
c. Características de cultivo y desarrollo.-
Las brucellas precisan de Medios de Cultivo enriquecidos, como
el Agar triptosa o el Agar triptosa con sangre al !Wo.
También se puede utilizar el caldo de Triptosa. Se debe
considerar que la incubación se hará con 10% de COz especial•
mente para Brucclla abortus (método de jarra o vela). La tem•
peratura se ajusta a 37ºC, y se espera para la lectura final hasta
30 días, realizando controles diarios a partir del 5to. de incuba•
ción.
l. Agar triptosa-sangrc. -
Las brucellas dan colonias de bordes circulares. bien de•
finidas, superficie convexa. aspecto húmedo y brillante. consis•
tencia cremosa. de 1-5 mm de diámetro, transparentes. a
veces dan hemólisis (depende de la cepa).
2. Caldo triptosa.-
Dan enturbamicnto homogeneo que se acompaña de un
precipitado mucilaginoso.
d. Pruebas bioquímicas.-

CRECIMIENTO EN PRESENCIA PRODUC- NECESI-

DE CION DAD DE-
FUCSINA TIONINA DE H2S C02 (10%)
------------------
Brucella melitensis + + +/•
Brucella abortus + ++ +
Brucella suis + +++
Brucella canis + ++

+/·: Caracter Variable+: Positiva-: Negativa (merck)

279
 e. Crecimiento en presencia de tionina.-
1. Fundamento.-
La capacidad que tienen algunas brucellas de crecer
en medios de cultivo que poseen colorantes capaces de inhibir
el desarrollo de otros microorganismos.
2. Procedimiento.-
a. Prepare el medio de cultivo Agar Triptosa (Merck)
y en lugar de añadir sangre desfibrinada, añada l mi
de una solución al l % de fucsina básica, o de tionina
(la concentración final será 1: 1000.000). Estas cajas
Petri así preparadas pueden guardarse máximo 24
horas).
b. Inocule con el gérmen problema por agotamiento
en las cajas Petri antes citadas.
c. Lleve a incubar a 379C, con 10% de C02 para
Bru•
cella abortus.
d. Deje incubar hasta 10 días, realizando
lecturas periódicamente. Finalmente lea e interprete.
3. Interpretación.•
a. Positiva»
Hay crecimiento en las cajas Pctri, con colonias
visi•
bles (color rosado).
b.
Negativa
No hay crecimiento en las cajas
Petri.
4. Pruebas Especiales.-
a. Serodiagnóstico de Wright
b. Fijación de
complemento
c. lntradermorreacción con
melitina.
d. Tipificación con fagos.

280
C. YERSINlAS Y PASTEURELLAS.•
l. Morfologia.-
Las Yersinias y Pasteurellas son bacilos ovoides Gram H
negativos, que miden 1-2 um de longitud por 0.3 - 0.6 um de
ancho. Les caracteriza la coloración bipolar que los destaca
a manera de imperdibles o ganchos de ropa; precisamente para
hacer una observación más perfecta se utiliza la tinción de
Way• son. Muchas veces se presenta con cápsulas.
2. Fisiología.-
No son esporuladas, generalmente presentan cápsulas
a
20'!C. Yersinia pscudotuberculosís y yersinia enterocolítíca
son móviles: el resto son inmóviles. Desarrollan a un pH de
6,9 -
7 ,2 y a una temperatura de 28ºC Son anaerobios facultativos.
Se
dividen por fisión binaría.
Yersinia pestis sobrevive a temperatura de O.ºC. Durante
6 meses. En el exudado purulento de los bubones se
mantiene viable hasta 30 días. y en los esputos, 10 días.
La ebullición la destruye en un minuto y bajo la acción
de una solución de fcnol al 3%, se destruye en 15 minutos.
3. Clasificación.-
a. Yersinia pestis.-
1. Variedad orientalis
2. Variedad antiqua
3. Variedad medievalis
b. Yersinia
enterocolitica.- c.
Pasteurella multócida.-
4. Patogenia.-
Por su presencia y multiplicación en los tejidos,
además por la producción de toxinas.
281
S. Patología resumida.•
a. Yersinia pestis.-
1. Peste
b. Yersinia pseudotuberculosis.-
1. Cuadro abdominal inéspecifico con enteritis y
linfadenitis (se presenta como apendicitis)
2. Septicemia.
c. Yersin ia enterocolítica-
Cuadro abdominal inespecífico que sugiere apendicitis
(hay ileitís, adenitis mesentérica).
d.- Pasteurella multócida.-
Pasteureliosis.
6. Diagnóstico laboratorial.•
a. Frotis.-
Estos se realizan con muestras que se obtienen por
pun• ción venosa (hcmocultivos) en las formas septicémicas.
tomas de hisopado faríngeo. además de colección de esputos,
en las formas neumonicas. Muestras provenientes de los
bubones (ganglios linfáticos). y de la secreción de úlceras
dérmicas, en las formas bubónicas. También se pueden
obtener tomas partir de materiales de autopsia (órganos.
ganglios línfaticos, etc.), O finalmente podemos trabajar con
los cadáveres de roedores y pulgas. Todo esto en el caso de
peste.
NOTA: Cuando realice autopsias y deba enviar una
mues• tra al laboratorio, proceda a seccionar la falange de un
dedo del pie, depositando ésta en un recipiente limpio (sin
formol o al• cohol).
ADVERTENCIA: Para manipular estas muestras. deberá
trabajar protegido por barbijo, guantes estériles; teniendo el
cui• dado posterior de desinfectarlo absolutamente todo con
fcnol al
282
3-5% las piezas de autopsia de los animales utilizados deberán
ser incineradas.
En las otras yersiniosis las muestras provienen básica•
mente de heces fecales. Y en la pastcureliosis las muestras
serán básicamente de la puerta de entrada al organismo, sangre
y ganglios linfáticos.
Los frotis posteriormente son teñidos con Gram o la técni•
ca de Wayson.
b. Método de Wayson.-
1. Fijar el frotis (incluso las impresiones de tejidos) con
calor o alcohol metílico.
2. Cubrir con el colorante de Wayson durante 15 segundos.
3. Lavar con agua corriente.
4. Secar y observar
Usted verá los corpúsculos polares de color azul obscuro y
el resto de la bacteria con una tonalidad azul clara o rojiza.
7. Preparación del colorante de
wayson.- a. Solución A:
1. Fucsina básica 0.2 g.
2. Alcohol etilico absoluto 20 ml.
3. Azul de metileno 0.75 g.
* disuelva estos colorantes en alcohol.
b. Solución B
l. Fenol 10 g.
2. Agua destilada 190 ml.
c. Solución para trabajar
1. Viena la solución A en la solución B. lentamente.
2. Deje reposar 48 horas.
3. Filtre y guarde en frascos de color caramelo.

283
 d. Tratamiento de la muestra
En lo posible las muestras deben ser procesadas una
vez obtenidas.
e. Características de cultivo y desarrollo.-
Las yersinias desarrollan en medios enriquecidos como
el agar sangre y el agar soya tripticasa, A 28ºC de temperatura
por el lapso de 24-48 horas podemos observar el siguiente
desarrol• lo:
1. Agar soya - tripticasa.-
Yersinia pestís; dá colonias de bordes irregulares
superfi• cie rugosa, aspecto brillante, consistencia rnucoide, de
2 -4 mm de diámetro, el centro de la colonia es blanco-
turbio rodeado por un borde festoneado (asemeja a un pañuelo
de encaje).
En medíos de cultivo líquidos (caldos) forma una película
superficial con estructuras filiformes que cuelgan a manera de
estalactitas, produciendo un sedimento en forma de copos.
Las otras yersinias y pasteurellas llevan este tipo de desa•
rrollo. aunque dependerá de las cepas.
f. Pruebas bioquímicas.-

MOVILA ROJO PRODUCCION

20!C. UREASA INDOL METILO DE H2S

Yersinia pestis
+ Yersinia Pseudo-
tuberculosis + +
+ Yersinia entero-
colitica + + +!-
+ Pasteurella mul-
tocida +
284
g. Pruebas especiales.-
1. Utilización de antisueros específicos para tipificación.
2. Fagotipia
3. Pruebas de inmunofluoresccncia
4. Reacciones de fijación de complemento.

285
 CAPITULO XXI

DIAGNOSTICO DE
ESPIROQUETAS

A. INTRODUCCION.-
En este acápite vamos a revisar los procedimientos
de diagnóstico laboratorial mas comunes para los siguientes
micro• organismos: Treponema pallidurn, Borrelia
recurrentis y Lep• tospira interrogans, scrovar
icterohaemorragie; haciendo énfasis en los dos primeros
gérmenes por su importancia dentro de la patología nacional.
B. TREPONEMA PALLIDUM.-
1. Morfología.-
Son células delgadas y flexibles que poseen entre 6 y
14 espiras. Miden 0.2 - 0.3 um de ancho por 5.15 um de
largo, las vueltas de espira están espaciadas con una distancia
aproximada de l um. No se tiñen con el método de Gram, es
así que se utili• zan tinciones especiales (Fontana-Tribendeau)
en base a proce• sos de impregnación argéntica o tíncíones
como la de Roma• nowsky-Gíemsa.
2. Fisiología.-
Treponema pallidum es móvil (rotación, avance sinuoso
y por flexiones), no forma esporas ni presentan cápsulas.
Son anaerobios estrictos, se dividen por fisión binaria (más o
menos cada 30 horas).No se los ha podido obtener en
cultivos artifi• ciales; las cepas que logran desarrollar en
medios complejos son saprófitas o probablemente
Treponema pallidum pero que posteriormente pierden su
patogenicidad. Lo más usual es ino• cularlos en animales
(testículos de conejo, etc.) a 55ºC sucumbe
287
en 15 minutos, es sensible a los metales pesados (mercurio,
bis• muto y arsénico). además de los desinfectantes, es también
bas• tante característica su labilidad ante la desecación.
J. Clasificación.-
a. Treponema
pallidum
b. otros:
1. Treponema carateum (mal de
Pinto)
2. Treponema pertenue
(Frambcsía)
3. Treponema
cuniculi
4. Patogenia.-
Está dada por su presencia y multiplicación en los
tejidos del huésped. aunque todavía no está muy claro este
punto.
5. Patología resumida.-
a. Sífilis
(Lues)
6. Diagnóstico
laboratorial.•
a. Frotis.-
Aquí tenemos dos probabilidades, siendo la. primera
aque• lla en que realizamos el examen por campo obscuro y la
segun• da llevando a cabo las tinciones especiales
correspondientes.
1. Campo
obscuro.-
Para esta técnica debemos disponer de un
microscopio que nos permita este procedimiento
(condensador de campo obscuro).
a. Limpie la superficie de la lesión (chancro o condiloma)
retirando cualquier materia purulenta o costra y luego
frótela o erosiónela suavemente con una pipeta Pasteur.
b. De la hase de la lesión recoja exudado seroso, en
lo posible sin sangre.

288
 c. Realice la recolección en un tubo de hemólisis que
contenga 2 ml. de suero fisiológico estéril entibiado.
d. A partir de esta suspensión dcpósite una gota sobre
un porta-objetos nuevo.
e. Coloque sobre la muestra un cubre-objetos y
presione de manera que consiga una capa fina y
homogenea.
f Observe con eJ microoscopio de condensador de
campo obscuro (con el objetivo de 40x).
2. Tinciones especiales.-
Una vez obtenida Ja muestra realice el correspondiente
Irotis con asa bacteriológica y luego proceda a la tinción de
Fontana-Tri bendeau.
a. Calentar el extendido (fijación)
b. Cubrir con solución de ácido tánico y fenol.
c. Calentar hasta desprender vapor (emanaciones).
d. Lavar con agua corriente.
e. Cubrir con el colorante de Fontana.
f Calentar nuevamente hasta que se produzca
evaporación.
g. Dejar reposar 30 segundos (la película tomará un
color castaño).
h. Lavar con agua corriente.
i. Secar
J. Observar
C. INTERPRETACION:
Treponema.-
De color castaño obscuro o negro; con el fondo de color
marrón obscuro.

289
 NOTA: Este procedimiento es muy útil también en el
pro• cesamiento de tejidos obtenidos por biopsia o en casos de
autopsia.
l. Tinciones Negativas lo indirectas)
Permiten observar a los treponemas, aunque con
menor nitidez.
a. Procedimiento de la tinta china.-
1. Mezclar I gota de tinta china con 2 gotas del exudado
seroso obtenido de la lesión sobre un porta objetos.
2. Cubrir con un cubre-objetos y examinar en húmedo
o en su defecto realizar un extendido y dejar secar al aire.
3. Observar con objetivo 40x en cualquiera de los dos
ca-
sos.
a.
Interpretación.-
Treponema se verá por contraste de aspecto
blanco•
grisáceo sobre un fondo gris intenso o
negro.
h. Tratamiento de la
muestra=
Las muestras deben ser procesadas inmediatamente
después de obtenidas. En caso de lesiones orales-
se procede a circundar las de manera que no exista la
po• sibilidad de error en el diagnóstico por la
presencia de treponemas saprofitos de la cavidad
bucal.
c. Característica de cultivo y
desarrollo:
Se halla aún en la obscuridad en cuanto a su
conoci•
miento.
d. Pruebas bioquimicas>
No hay nada
e e. Pruebas
s serológicas.-
t 1. La que demuestran
a reagina:
b -VDRL
l - RPR
e 290
c
i
d
o
.
 2. La que demuestra anticuerpo específico:
- FfA - abs (anticuerpos fluorescentes).
D. BORRELIA RECURRENTIS.-
1. Morfología.-
Células bacterianas de 4 a 10 espiras irregulares. flexuo•
sas. miden de 6-16 um de largo por 0.2 - 0.4 de ancho. Son
(Gram (-).
2. Fisiología.-
Borrelia recurrentis es móvil, no forma esporas ni posee
cápsula, desarrolla a un pH de 7,2 - 7,4 en medios de cultivo en•
riquecidos y a una temperatura de 37'1C. Es anaerobia estricta,
se divide por fisión binaría.
A temperatura de 45"C mucre en 30 minutos.
3. Clasificación.-
a. Borelia recurrentis
(transmitida por piojos)
b. Borrelia duttoni
(transmitida por garrapatas).
4. Patogenia.-
Presencia y multiplicación en el organismo, es probable la
acción de una endotoxina.
5. Patología resumida.-
a. Fiebre recurrente epidémica (B. recurrcntis).
b. Fiebre recurrente endémica (B. duttoni).
6. Diagnóstico laboratorial.-
a. Frotis.-
A partir de sangre obtenida en el momento del pico febril.
Estos Irotis se tiñen con Gram, Giemsa o Wright, así observare•
mos espiroquetas entre los eritrocitos.

291
 b. Tratamiento de la muestra-
Procesarla inmediamente despues de obtenida, aunque a
4ºC sobreviven por varios meses en sangre infectada.
c. Características de cultivo y desarrollo-
Se utilizan generalmente medios de cultivo líquidos enri•
quecidos (Ungermann, Kliger y Robertson) donde después de
colocada la alícuota y bajo las características enumeradas en la
fisiología de este gérmen, observamos su desarrollo en el entur•
bamiento del medio por debajo de la capa de parafina
(anaerobiosis en 5 días aproximadamente.
d. Pruebas bioquímicas.•
No son de utilidad.
e. Pruebas serológicas.-
Pijación de complemento (no muy útil).
f. Inoculación en animales.-
Obtenida una muestra de sangre, ésta es inoculada
intraperitonealmente a ratones blancos, luego de 24 horas y
hasta 5 días más tarde, se-procede a preparar frotis de sangre
obtenida de la cola de ratones, buscando las borrelias.
E. LEPTOSPIRAS.-
Existe un grupo grande de leptospiras, donde la más re•
presentativa es la Leptospira interrogans, serovar. icterohae•
morragie.
Es un organismo espiroqueta! que posee 10-16 espiras
muy finas y que generalmente acaban en los extremos con es•
piras mucho más abiertas a manera de ganchos. Mide de 5 - 15
um de longitud por 0.2 - 0.3 um de ancho.
Es posible teñirlo con Gram, Giemsa, Wright o por méto•
do de impregnación argéntica (Fontana). También se puede
uti• lizar el campo obscuro para destacarlas.

292
 Son aerobio - estrictas, desarrollan a un pH de 7,2 - 7.4 a
30ºC. Los medios más usados son los de Reiter y Korthof.
El desarrollo en medios líquidos se hace patente al término
de 5 días.
El diagnóstico se hace en base al frotis (de orina centrifu•
gada o sangre) que puede ser teñido u observado en campo
obs• curo. Se practica también el hemocultivo y la
inoculación en animales (cobayos) intraperitonealmente,
donde el cabo de 3 días se pueden obtener a las leptospiras de
la cavidad peritoneal y a los 12 días se observan lesiones
hemorrágicas con espiro• quetas en casi todos los órganos.
La serología en nuestro medio está muy limitada.

r\JVUu
Treponema Borrelia
pallidum recurrentis

v\JlMfc)
leptospira interrogans, serovar
icterohaemorragiae

293
 CAPITIJLO XXII

FUNDAMENTOS DE
TECNICAS BASICAS EN
SEROLOGIA
M. Lourdes Zegarra No/asco

A. DEFINICION.-
La Serología es el estudio del suero; en Inmunología
nos permite estudiar las reacciones antígeno-anticuerpo "in
vitre". además de desarrollar y controlar métodos más
sensibles, es• pecíficos y sencillos que permitan demostrar
estas reacciones.
J. Antígeno (Ag).-
Es toda substancia o cuerpo extraño al organismo vivo
que debido a su alto peso molecular y complejidad estructural
es ca• paz de estimular la producción de anticuerpos
específicos.
2. Anticuerpo(Ac).-
Es una proteína especializada formada a partir de un
esti• mulo antigénico y que tiene la capacidad de reaccionar
res• pecíficamente con un antígeno.
B. TIPOS DE REACCIONES SEROLOGICAS.-
1. Aglutinación.-
Es la agregación visible de proteínas. resultado de la reac•
ción específica entre el anticuerpo y el antigeno insoluble.
Los anticuerpos que pueden demostrarse por las técnicas
de aglutinación se llaman aglutinínas y solo pueden ser
identif• icadas si el Ag es paniculado y directamente
aglutinado por el Ac (aglutinación directa) o es adsorbido
en la superficie de partículas de tamaño uniforme - hematíes,
latex, etr.-taglutina• ción indirecta).
295
2. Precipitación.-
Es la forma más fácil y directa de demostrar la reacción
antigenoanticuerpo in-vitro.
Las precipítinas (anticuerpos) interactúan con el antígeno
soluble formando complejos y dando como resultado un preci•
pitado granular fino.
3. Floculación.-
Es una reacción que ocurre por precipitación de una solu•
ción coloidal en forma de copos o flóculos.
Existen otras pruebas serológicas que citaremos simple•
mente:
lnmunofluorescencia, fijación de complemento, ELISA
(Análisis, Inmunosorbente Ligado a Enzimas). inmunoelectro•
foresis, pruebas de difusión en gel y otras.
C. DESCRIPC,ION DE ALGUNAS PRUEBAS
SEROLOGICAS BASICAS.-
1. Prueba para anticuerpos febriles.•
a. Definición.-
Es una prueba serológica mediante la cual es posible de•
tectar anticuerpos contra "antígenos febriles" que son suspen•
siones bacterianas representativas de determinadas especies de
microorganismos patógenos para el hombre y que se presentan
con fiebre en el huésped. entre éstos están incluidos los si•
guientes generos: Salrnonella. Brucella, Franeiseella, Leptospi•
ra y algunas Rickettsias.
b. Fundamento.-
El principio de esta prueba es una reacción inmunológica
entre el "Ag febril" y su anticuerpo específico. Esta reacción
Ag-Ac produce una aglutinación visible a simple vista.

296
 c. Reacción serológica para salmonella typhi (Prueba
de Widal).
Emplea suspensiones de Salmonella para detectar
anticuer•
pos contra la fiebre tifoidea y
paratifoidea.
l. Procedimiento:
Una vez obtenido el suero por centrifugación y
teniendo cuidado de no calentarlo por la existencia de
anticuerpos ter-
. molábiles proceder de la siguiente
manera:
a. Con ayuda de una pipeta de 0.2 ml colocar sobre
una lámina de vidrio cuadriculada las siguientes
cantidades de suero: 0.08; 0.04; 0.02; 0.01 y 0.005 mi.
b. Añadir a cada cantidad de suero una gota (0.03
mi) de antígeno (los antígenos O y H se expenden en
las casa comerciales).
c. Mezclar con una varilla comenzando por la
dilución de 0.005 mi hasta llegar a la de 0.08.
d. Tomar la lámina con ambas manos y rotarla
"suave•
mente' de 15 a 20
veces.
e. Observar la aglutinación que se presenta en el
lapso de 1 minuto sobre una fuente de luz (lámpara
para lec• tura).
2. Resultados
4+ Aglutinación
completa
3+ Aproximadamente 75% de las células están
agluti•
nadas
2+ Aproximadamente 50% de las células están
agluti•
nadas.
1 + Aproximadamente 25% de las células están
agluti•
nadas.
+/- trazos de
aglutinación
- no hay
aglutinación.

297
 Las diluciones finales serán:
0.08 de suero 1/20
0.04 de suero 1/40
0.02 de suero 1/80
0.01 de suero 1/160
0.005 de suero 1/320
Título "O" alto o ascendente ( 1/80 o más) infección
activa en el momento.
Título "H" alto o ascendente (1/80 o más) infección o
va•
cunación en el pasado.
Las aglutininas séricas son detectables a partir de los
10
días de infección.
d. Reacción serológica para rickettsias
(Prueba de Weil Felix)
Esta prueba emplea suspensiones de cultivos de
cepas
Oxl9; Ox2; OXK de Protcus. Util para el tifus.
l. Procedimiento:
A partir de una muestra de 3 a 5 ml de sangre obtener
sue-
ro y proceder de la siguiente manera:
a. Preparar una dilución de 1/80: a 0.02 ml de
suero problema, añadir una gota de antígeno.
h. Mezclar en forma homogénea durante un minuto
con ayuda de una varilla.
c. Reportar en cruces una vez observada la aglutina•
ción.
- El título de 1/80 positivo nos da una reacción es•
pecífica.
 NOTA: La prueba habitualmente denominada Widal
- Weil Felix que consiste en la deteccción de anticuerpos
contra

298
"antígenos febriles" actualmente se encuentra en el comercio
como pruebas serológicas separadas para cada género así por ej:
reacción serológica para brucella,
Estas pruebas deben ser solicitadas al laboratorio de
acuer• do a criterio clínico, no en todos los casos se precisa
hacer todas estas pruebas. Un análisis minucioso de la Historia
clínica del paciente nos permitirá orientar nuestra solicitud
para este tipo de exámenes.
2. Grupos sanguineos.-
(aglutinación)
Se determina la presencia o ausencia de los antígenos A
y B en la membrana celular de los hematíes. estableciendo así
la característica de cada grupo sanguíneo,
a. Procedimiento.-
1. Obtener una muestra de sangre mediante punción con
lanceta en el pulpejo digital, eliminar la primera gota y
colocar en forma separada dos gotas sobre una lámiua de
vidrio.
2. Colocar una gota de suero anti A sobre la primera
gota de sangre y sobre la otra colocar una gota de suero anti -
B.
3. Homogeneizar con una varilla de vidrio.
4. Someter a movimientos de rotación durante 3 a 5
minu•
tos.
5. Observar la formación de aglutinación a simple vista
o
con la ayuda del microscopio (segundo aumento) para indicar
la
positividad de la prueba.

Grupo Antígeno en Anticuerpo

glóbulo rojo en plasma
o A,B
A A B
B B A
AB AB

299
3. Proteina C-Reactiva.• (Prueba capilar de precipitación)
La proteina e-reactiva es una globulina alfa anormal; su
nombre se debe a la facultad que tiene de formar un precipitado
con el polisacárido C del neumococo. Esta protéina que se en•
cuentra en personas que sufren de infecciones-distintas de la
neumonía- y trastornos inflamatorios no infecciosos, dió
origen a una prueba capilar y a otra rápida de aglutinación de
placa, que son muy útiles para el diagnóstico y pronóstico de la
fiebre reumática y otras enfermedades inflamatorias. Esta
proteína no se encuentra en sujetos normales, desaparece
cuando la enfer• medad cura.
Este es el método original usado por Anderson y Me.
Carthy:
a. Procedimiento.-
1. Llenar el tubo capilar en partes iguales con protcina
e-reactiva y suero problema.
(Llenar por capilaridad primero con antisuero y después
con suero problema).
2. Mezclar con movimientos de inversión varias veces.
3. Luego colocar en posición vertical sobre plastilína de-
jando una columna de aire en la parte inferior.
4. Incubar a 37ºC por dos horas.
5. Observar en posición vertical sobre fondo obscuro.
b. Resultado.-
1. La prueba es positiva. si observarnos un precipitado
blanco en la solución transparente.
2. Prueba negativa si no existe precipitado.
Sí se necesita un estudio cuantitativo. se coloca el tubo en
refrigeración a SºC durante toda la noche.
La prueba es positiva si existe un precipitado que llena
casi todo el tubo, y se reporta como 6 cruces.

300
4. Prueba de VDRL.- (Floculación)
a. Definición.-
Es una prueba de floculación para el diagnóstico de sifilis.
Utiliza extractos de tejido normal como antigeno y fue desarro•
llada e introducida por el Vcnereal Disease Research Laborato•
ry (VDRL).
b. Fundamento.-
El examen de VDRL utiliza un Ag cardiolipina-lecitina•
colesterol para detectar un Ac llamado Reagina, el cual es pro•
ducido debido a la infección con Treponema pallidum. El com•
ponente reactivo del Ag es la cardiolipina (obtenida de tejido
animal). La lecitina y el colesterol producen un Ag estable.
c. Procedimiento> (Prueba cualitativa)
l. Colocar 0.05 ml de suero inactivado sobre una lámina
de vidrio (porta objetos).
2. Agregar una gota (1/60) de la suspensión de antígeno
sobre el suero.
3. Realizar movimientos de rotación durante cuatro minu-
tos.
a. Lectura-
Inmediatamente después de la rotación, realizar 1a lec•
tura con ayuda del microscopio utilizando objetivo de
bajo poder (lOx).
b.
lnterpretación.-
flóculos medianos
y grandes··-·--·--· reactivo (R)
flóculos
pequeños debilmente
reactivo (DR)
Ausencia
de flóculos no reactivo(NR)

301
Todo suero que da resultado reactivo o débilmente
reactivo debe ser procesado mediante la prueba
cuanti• tal iva de VDRL en la cual se realiza diluciones
del sue• ro ( 1(2, 1/4, etc.) y luego se coloca la
suspensión del antígeno para proceder posteriormente
a realizar la lec• tura como se detalla en la prueba
cualitativa.
El título reportado está en función a la mayor dilución
que da Resultado reactivo (no Débilmente Reactivo).
Esta prueba serológíca para sífilis no es absolutamente
específica, pueden presentarse falsos positivos
biológicos producido por malaria, lupus. eritematoso
generalizado (LEG), rubeola, sarampión. Sin embargo
es una prueba de selección ya que es sensible.
Por todo ello las pruebas tanto positivas como negati•
vas deben ser correlacionadas con la clínica.
Preparación de la suspensión de Ag para
VDRL.-
1. La solución salina amortiguada (viene ya preparada)
y el Ag deben estar a una temperatura de 23ºC a
29ºC en el momento de preparar la suspensión.
2. En un frasco de 30 ml depositar con una pipeta 0.4
mi de solución salina.
3. Utilizando otra pipeta agregar 0.5 mi de Ag
VDRL (a goteo continuo) realizando movimientos de
rotación permanentes y suaves sobre una superficie
plana.
4. Depositar la última gota de Ag sin tocar con la pipe•
ta la solución salina.
5. Continuar rotando el frasco durante 10
seg.
6. Añadir4.1 mi de solución
salina.
7. Tapar el frasco y agitar aprox. 30 veces en un
tiempo
de 10seg.

302
 8. Esta suspensión de Ag debe ser utilizada dentro de
las siguientes 24 horas.
NOTA: Se entiende por inactivación del suero el calenta•
miento del mismo en Baño Maria por 30 min. a 56'1C con la fi•
nalidad de eliminar al complemento (conjunto de proteínas séri•
cas) cuya presencia nos podría conducir a resultados falsos
posit ivos.

303
 CAPITULO xxm

TECNICAS DE INOCULACION
EN ANIMALES DE
LABORATORIO
Hernán Huarita Orozco

A.
INTRODUCCION
Un paso muy importante en el circuito laboratorial micro•
biológico es sin duda la inoculación de gérmenes en
anímales de laboratorio; pues estos son un parámetro para
medir muchas consecuencias e impedir algunas: por otro lado
nos permite es• tudiar el comportamiento de los
microorganismos "in vivo".
B. BIOTERIO.-
Es el lugar (sala) destinada a la crianza de animales, sus•
ceptibles de
experimentación.
C. PR1NCIPALF.,S RECTORES
INTERNACIONALES APLICABLES A LAS
INVESTIGACIONES BIOMEDICAS CON
ANIMALES (O.M.S.)
Principios básicos.- (solo mencionaremos
algunos)
l. El progreso de los conocimientos biológicos, el perfecciona•
miento de los medios de protección de la salud y el
bienestar del hombre y de los animales obliga a hacer
experimentos con animales vivos intactos de especies muy
diversas.
2. Sólo deberán emprenderse experimentos con animales
tras ponderar debidamente si redundan en beneficio de la
salud hu• mana o animal y del progreso de los conocimientos
biológicos.
3. Los animales seleccionados para un experimento deben
ser de la especie y calidad adecuadas y no exceder del
número mínimo necesario para obtener resultados
científicamente válidos.
305
4. Los investigadores y demás personal deberán tratar siempre
a los animales como seres sensibles y como imperativo
ético prestarles la debida atención y cuidado, evitándoles o mi•
nimizando en lo posíble toda molestia, intranquilidad o dolor.
5. Toda manipulación de un animal que pueda causarle más
que un dolor o una molestia momentáneos o mínimos deberá
ha• cerse prevía sedación, analgesia o anestesia adecuada según
las prácticas veterinarias aceptadas. No deberán realizarse
interven• ciones dolorosas, sean quirúrgicas o de otra naturaleza
en ani• males paralizados con agentes químicos.
6. Al final del experimento (o en el curso del mismo) se
matara sin dolor a cualquier animal que, de quedar en vida,
padecería dolores graves o crónicos, trastornos, molestias o
incapacidades irreversibles.
7. Habrá que mantener en las mejores condiciones de vida posi•
ble a los animales que se vaya a destinar a fines biomédicos.
Normalmente el cuidado de los animales debe encomendarse a
veterinarios expertos en la materia de la ciencia de los
anímales de laboratorio. En cualquíer caso, deberá disponerse
de aten• ción veterinaria siempre que se necesite.
Los animales más utilizados en la actualidad son: ratón,
conejo, cobayo, pollo, perro, gato, rata, mono, harnster, Aquí
les describiremos algunos que deben conocer:
a.- Ratón (Mus musculus).-
Es el animal más ampliamente utilizado, es un
mamífero, de sangre caliente, tiene pelo, el periodo de
gestación es de 20 días.
El ratón debe disponer de agua, comida en toda oportuni•
dad. Este método de libre consumo de alimentos y bebida es
llamado Ad libitum. El alimento sólido se puede dar en
forma de pellets o molida.
Las inyeccíones endovenosas en el ratón puede ser admi•
nistradas en las venas caudales. Se puede obtener sangre como

306
muestra por punción cardiaca bajo anestesia o introduciendo
una pipeta capilar en el ángulo interno de la órbita de ojo (lla•
mado también método intraorbitario). Puede tomarse también
muestras de sangre incidiendo sobre la vena de la cola.
b. Cobayo (Cavia porcellus)
Es el anímal más curioso del raboratorio, usado en inves•
tigaciones de Nutrición, Farmacología, Radiología e Inmuno•
logfa.
Existen tres cepas básicas de cobayos:
1. Cobayo inglés, de pelaje corto y liso.
2. Cobayo abisinio de pelaje largo.
3. Cobayo peruano de pelaje corto y revuelto.
La variedad inglesa es la más usada. Las cepas albinas y
otras multicoloreadas de esta variedad se encuentran en el
co• mercio.
El periodo de gestación del cobayo tiene un rango de 58 a
72 días. La alimentación en forma de pellets es beneficiosa
con
el cuidado de que la comida tenga bastante vitamina
C.
Es difícil la inyección intravenosa en las venas de la oreja
del cobayo, por tanto es aconsejable el uso de la vena yugular
y en el macho también la vena pencal, Se puede tomar muestra
de sangre por punción venosa bajo anestesia o por el método
intra• orbitario.
c. Conejo (Oryctolagus cuniculus)
Es uno de los animales utilizados, en la preparación de an•
tisueros, para probar la toxicidad de las drogas y
productos biológicos y para algunas pruebas de diagnóstico.
Existen va• rias cepas que van desde el pequeño Polish de 1,5
libras hasta el gigante Flandés de 20 libras.
El periodo de gestación del conejo es de 30 a 32 días. La
alimentación de los conejos es en base a zanahoria. heno
y
307
vegetales verdes. Estos animales no deben ser levantados por
las orejas ya que éstas se pueden dañar en su parte cartilaginosa
y porque las poderosas garras de las patas traseras pueden res•
guñar al operador.
Los conejos pueden ser inyectados a partir de la vena mar•
ginal de la oreja. Se puede obtener volúmenes apreciables de
sangre seccionando esta vena con una hoja de afeitar estéril,
como el corazón bajo anestesia.
Generalmente una oreja se emplea para las inyecciones
y la otra para tomar muestras.
D. MATERIAL UTILIZADO EN
INOCULACION
l. Plancha de
contención.-
Es una plancha metálica de 60 cm x 30 cm utilizada
pard la disección de los animales. Característicamente posee
cuatro pivotes metálicos atravesados por orificios para sujetar
las patas del animal.
2. Plancha de contención
descartable
Es una plancha fabricada de plastofonno de 30 cm x 15
cm utilizada para la disección de animales pequeños (ratones,
ratas blancas). La sujección del animal se hace atravesando
cada pata del mismo con alfileres.
3.
Bisturí
4.
Pinzasanatómicas
S. Pinzas diente de ratón
6. Tijeras de disección rectas y curvas
7. Hilo de seda
8.
Trocar
9. Jeringas (5cc.)
10. Gasas
11. Balanza

308
E. CONDICIONES DEL OPERADOR.-
1. Debe estar protegido por un
mandil
2. Si es posible llevará un mandil de plástico por fuera o un
de•
lantal plástico.
3. Debe usar gorro y
barbijo.
4. Debe usar guantes
estériles.
ADVERTENCIA: Hay cuadros patológicos que se pue•
den transmitir a través de
ectoparásitos.
[Tenga mucho cuidado con este detalle!
F. PROTOCOLO.-
En el protocolo (cuyo modelo se halla al final de
este capítulo) se debe colocar primero todos los datos
generales.
Luego en la descripción de las manifestaciones
observadas en el animal inoculado se debe investigar y anotar
los siguientes aspectos: aspecto exterior (pelo erizado,
enflaquecimiento, con• tracturas, parálisis, etc.), lesión local
(congestiva, edematosa, destructiva, adenopatías regionales).
Estado general (temperatura, anorexia, adinamia,
astenia, y somnolencia, vómitos etc.) y emuntorios (diarrea,
orina san• guinolenta, etc.) También se debe registrar si el
animal falleció espontáneamente o si se procedió a sacrificar al
mismo.
En el protocolo de autopsia también se coloca los
datos generales exigidos, y posteriormente la descripción
siguiente:
l. Examen exterior de la pieza, anotando las características
más importantes.
2. Descripción segmentarla de todos los órganos revisados, ha•
ciendo constar si se obtuvieron muestras para cultivo y/o pre-
paración de placas. ·
3. Al final se colocará la causa probable de muerte - si ésta
fue espontánea - del animal inoculado.

309
G. VIAS DE INOCULACION.•
l. Vía subcutánea.-
En el lugar dome se va a realizar la inoculación, se corta con
tijera el pelo, para dejar al descubierto una zona de piel que se
desinfecta con tintura de yodo y alcobol, Luego con el dedo pulgar
y el índice de la mano izquierda se toma un pliegue de la piel
mientra; con la maro dere• cha sotenernos la jeringa ya cargada De
esta marera inttoducimos la aguja en la base del pliegue inocularoo
la cantidad necesaria
Finalmente volveremos a desinfectar la zona con
tintura de yodo y alcohol.
2. Vía intramuscular.-
En el caso de los mamíferos elegimos la región de
los muslos; luego cortamos el pelo de esta región en la
misma for• ma tal como lo habiamos hecho en la anterior vía,
realizamos la antisepsia de la zona e introducimos la aguja de
a jeringa pro• fundamente en la masa muscular. Al final
también realizamos la antisepsia.
3. Vía intravenosa.-
En el caso del conejo se busca la vena marginal de la
ore• ja, realizamos la antisepsia y procedemos a inocular.
desinfec• tando posteriormente esta región.
En los animales más pequeños como ser los ratones,
es preferible usar la vía íntracardiaca; o en la base de la cola
reali• zamos un corte parcial con un bisturí. previa
antisepsia de la región, colocando posteriormente con una
aguja en este nivel el inóculo. Es de rigor la desinfección
posterior de la zonas uti-
1 izada. •
4. Vía intraperituneal.-
Para esta técnica utilizamos agujas de bisel corto. Es
siem• pre mejor que una persona oficie de ayudante pues
cogerá entre los dedos meñique y anular la base de la cola del
animal y con los dedor medio y pulgar sostendrá la cabeza por
las panes laterales; presentando la región abdominal del
espécimen al operador.
310
 Este tomara todos los planos de la pared abdominal con
los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, mientras que
con la mano izquierda, sujetará la jeringa - introduciéncola obli•
cuamente hasta llegar a la cavidad - No debe atravesar visceras
abdominales - depositando finalmente a este nivel el inoculo.
La antisepsia antes de inocular y posteriormente, es de ri•
gor en todas las técnicas de inoculación.
5. Vía
intracardiaca.-
Se procede a localizar el corazón del animal por maniobras
palpatorias, para luego introducir rápidamente la aguja entre sus
costillas.
Sabremos que estamos en corazón, por la salida de sangre
y por los movimiento pulsátiles de la aguja.
Debemos indicar que existen otras vías de inoculación,
como por ejemplo: en la cámara anterior del ojo,
intracerebral, etc. Empero no vamos a utilizarlas en nuestra
labor microbio• lógica corriente.
H.
AUTOPSIA.-
1. Examen exterior de la pieza, anotando las características
más importantes.
2. Antes de proceder a abrir el cadáver se debe rociar con un an•
tiséptico (feno1 3%) la región a
incidir.
3. También podemos quemar previamente con el mechero el
pelo de la región.
4. J ,a incisión se la realiza desde la escotadura del hueso
ester•
nal hasta la región pelviana.
5. Se separa todos los planos de un solo corte coo las
tijeras.
6. De esta forma llegamos a abdomen donde hacemos un reco•
nocimiento de los órganos, procediendo a seccionarlo si es pre•
ciso. También podemos obtener muestras para cultivo y/o pre•
paración de placas.

311
7. Luego revisamos corazón y pulmones: siguiendo la
misma metodología anterior.
8. Finalmente suturamos toda la línea de sección y
procedemos a rociar la pieza nuevamente con fenol 3% para
posteriormente someterla a incineración.
9. La plancha de contención (metálica) debe ser esterilizada al
igual que el material usado en la autopsia.
La plancha de contención descartablc debe ser incinerada.

312
 UNIDAD DE ENSEÑANZA DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

LA PAZ· BOLIVIA

PROTOCOLO DE INOCULACION
EXPERIMENTAL

FECHA DE INOCULACION HORA ..

INOCULACION ·-·-····-···. · -·-·----·-·-·-·-·-·-·-····----·--·.ANIMAL W ··-·-·-

·-
PESO DEL ANIMAL ANTES DE LA INOCULACION ··-·· ··-·-··

PESO DELANIMALAL TERMINO DEL EXPERIMENTO .. - -- .. - ---

· PROCEDENCIA DEL MATERIAL INOCULADO -

..

IDENTIFICACION ... ·-·-·· .. ··-·-·--- ..... .. ·-·-·-·-·-·--- ··-·-··-·-··-·-·-·-·· ..

CANTIDAD DEL MATERIAL INOCULADO ------···-·-·-·--·-·-··-·-·····-·-·-·---

VIA DE INOCULACION UTILIZADA _.
_

NOMBRE Y APELLIDO DEL RESPONSABLE DE LA INO-

CULAC ION ··---·-··--·-·--·-·-·----·-·-·-·-·-·····---·---· .. ····-·-·-···-·······"·"
. DESCRIPCION DE LAS MANIFESTACIONES OBSERVADAS EN
EL
ANIMAL INOCULADO (ESPECIFICAR FECHA Y HORA DE LOS
EXAMEN ES)
(SELLO) FIRMA

313
 PROTOCOLO DE AUTOPSIA

FECHA DE MUERTE HORA DE MUERTE.

. FECHA DE AUTOPSIA HORA DE AUTOPSIA
. ANIMAL N2 AUTOPSIA N2 .

PESO TALLA .
NOMBRE Y APELLIDO DEL RESPONSABLE DE LA AUTOP-
SIA .

DESCRIPCION DE LA
AUTOPSIA

(SELLO) FIRMA
314
 Más adelante les ofrecemos cuadros con datos de algunos
animales sobre crianza, fisiología, lugares de inoculación y
toma de muestras extra idos del Manual de animales de
labora• torio publicado por la O.P.S. y la O.M.S.

DATOS DE CRIANZA PARA ANIMALES

DE LABORATORIO
ESPECIE EDAD DELA PERIODO DE
PUBERTAD GESTACION

Ratón 35 - 40 días 20 días

Rata 60 - 72 días 22 días
Cobayo 45 - 70 días 60- 72 días
Conejo 120 - 180 días 30 - 32 días
Hamster 30 días I6-19días
Mono M 3 - 4 afies 159 - 174
Rhesus H 2 1/2 años días

315
 ALGUNAS CONSTANTES FISIOLOGICAS

VALORES PROMEDIO MONO COBA YO HAMSTER AATON CONEJO RATA

RHESUS

Temp. 2c 38.4 38.6 37.5 37.4 39.5 38.2

Recta
l VF 101.1 101.5 99.5 99.3 103.1 100.B
Movimientos

w respiratorios p/min. 39 - 60 69 - 104 33 - 127 84 - 230 38 - 60 66 · 114

q, Frecuencia
Cardiaca 160 · 330 150 - 400 300 - 600 330 · 780 123 • 304 261 -
Peso corporal M ·3.3 M -0.75 0.09 0.025 4 600
M - 0.450
de animales
adultos (kg.) H • 3.6 H · 0.65 H - 0.325
Leucocitos (miles por mm3) 15 10 8 9 14
Temperatura
óptima reg. ºF 68 - 72 65 - 75 65 - 75 68 - 74 62 .68 65.75
Humedad relativa (%) reg. 45 · 55 45 · 55 45 · 55 45 • 55 45 - 55 45 - 55
 LUGARES UTILIZADOS PARA INYECCIONES INTRAVENOSAS

Especie Vena Vena Vena Vena Vena de Vena de Vena

de cefálica safena femoral· yugular la cola afa
oreja

Rata X
Ratón X X
Hamster .x· .x· x·
Conejo x· x· X
w~ Cobayo x· x·
Pollo X
-
Mono X X X
 LUGARES UTILIZADOS PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE

Especies Corazón Vena Vena Vena Venas Venas Venas Seno Vena Sec.
cefálica safena femoral yugular de la oreja de la cola orbitario del ala de la
cola

RATA X x· x· x· X X X
RATON X x· X X X X
HAMSTER X x· X X
CONEJO X x· x· X
_
w COBAYO X x· x·
. POLLO X X
co MONQ X X X X X

• Usualmente requiere incísión de la piel.

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