154 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 39

APLICACiÓN DE lA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERAlES, OFTÁLMICAS y OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON lA PRUEBA DE ESTERILIDAD

Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase,pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución
estéril adecuada, como por ejemplo el ·Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .•
Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifi-
que y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del pro-
ducto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará
el contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios.

NÚMERO MíNIMO DE ARTíCULOS A ANALIZAR

En la Tabla 3 se indica el número mínimo de artículos a analizar en relación con el tamaño de la partida.

Pruebas y Valoraciones Biológicas

(81) ANTIBIÓTICOS-VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS

INTRODUCCiÓN E INFORMACiÓN GENERAL

En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. Este capítulo
resume los procedimientos para antibióticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valora-
ción microbiológica es el método analítico estándar.
Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo). La
Tabla 7 lista todos los antibióticos que incluyen valoraciones microbiológicas y especifica el tipo de valoración (cilindro-placa o
turbidimétrica).
Tabla 1
Antibiótico Tipo de Valoración
Amfotericina B Cilindro-placa
Bacitraci na Cilindro-placa
Bleomicina Cilindro-placa
Capreomicina Turbidimétrica
Carbenicilina Cilindro-placa
Cloranfenicol Turbidimétrica
Clortetraciclina Turbidimétrica
Cloxacilina Cilindro-placa
Colistimetato Cilindro-placa
Colistina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina Turbidimétrica
Eritromicina Cilindro-placa
Gentamicina Cilindro-placa
Gramicidina Turbidimétrica
Nafcilina Cilindro-placa
Natamicina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina Turbidimétrica
USP 39 Pruebas Biológicas / ) Antibióticos-Valoraciones 155

Tabla 1 (Continuación)
Antibiótico Tipo de Valoración
Novobiocina Cilindro-placa
Nistatina Cilindro-placa
Oxitetraciclina Turbidimétrica
Paromomicina Cilindro-placa I

Penicilina G Cilindro-placa
Polimixina B Ciiindro-placa
Sisomicina Cilindro-placa
--
Tetraciclina Turbidimétrica
Tioestreptona Turbidimétrica
Troleandomicina Turbidimétrica
Tilosina Turbidiméirica
Vancomicina Cilindro-placa

[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografías asépticamenteo Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los fármacos y a que se usan cultivos vivos de organis-
mos en los procedimientos]
Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a
través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de PetrL El crecimiento del microorganismo específico inoculado en
el agar resulta inhibido en un área circular o zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico.
Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en
una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibiótico.
Unidades y Estándares de Referencia: La potencia de los antibióticos se designa en unidades (U) o en /1g de actividad. En
ambos casos, la unidad o ~lg de actividad del antibiótico se establece originalmente contra un Estándar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibiótico en cuestión. El Estándar de Referencia USP correspondiente se calibra en términos del están-
dar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibiótico seleccionado como estándar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad y, por lo tanto, se le una de 1000 En muchos de estos casos, a medida
que los métodos de fabricación y purificación para ciertos antibióticos avanzaron en su fue obtener antibió-
ticos con más de 1 000 ~lg de actividad/rngo Tales antibióticos tenían una actividad a un número determinado de
~lg del estándar de referencia r\lo obstante, la de las veces, ios fl9 de actividad son, exacta-
mente equivalentes a los ~lg de la sustancia purao En ciertas corno las citadas a
dad definidos en términos del estándar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibiótico se presenta como la base libre y en forma de y los pg de actividad han sido definidos en térmi-
nos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibiótica consta de un númeíO de que son similares pero que difieren
en actividad antibiótica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por sí mismo heterogéneo.
No se debe asumir que los /19 de actividad corresponden a los /1g (peso) de la sustancia antibiótica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser esté-
ril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoración (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 »). Usar un méto-
do de esterilización validado tal como caior seco, vapor o irradiación; o usar material de laboratorio estéril y desechableo
Control de temperatura: Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el cul-
tivo de un microorganismo y la preparación de su inóculo, así como durante la incubación en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos específicos de temperatura píOvistos más adelante para cada tipo de valoracióno
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibiótico se lista en la Tabla 3 para la valoración en cilindro-
placa y en la Tabla 8 para la valoración turbidimétricao Los organismos de prueba se especifican mediante su mímero de identi-
ficación en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los [Link] o ATCC).
Para asegurar el desempeño aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento específicas durante la validación o verificación del método.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las características del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solución
de almacenamiento adecuada, tal corno suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de
soja (caldo digerido de caseína y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60 o inferiores; son
0

aceptables temperaturas inferiores a -20°0

156 ) Antibióticos--Valoraciones / Pruebas USP 39

Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiíiendo organismos de prueba desde los viales de almacenamien-
to prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2°_ 8 Y desechar
0
, de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo prima-
rio para preparar los cultivos de trabajo pOí un máximo de siete días únicamente.
Cultivos de Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo a medios sólidos apropiados para ob-
tener colonias aisladas. Incubar los cultivos de en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio pa-
ra !a preparación de los inócuios de prueba. Preparar cultivos de nuevos para cada día de análisis.
Crecimiento o no característicos de un de Usar cultivos madre, cultivos o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeño no característicos.
Diseños de valoración: Los diseños experimentales adecuados son clave para incrementar la precisión y minimizar el sesgo.
Controlar los parámetros de incubación, la distribución de temperaturas y el tiempo es crítico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, según se indica en cada valoración.
Valoración en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan ba-
sándose en el tamaño relativo de la zona del estándar comparado con el tamaño medio de la zona del estándar en todas las
placas.
Valoración turbidimétrica: Para evitar un sesgo sistemático, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separa-
das de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propósito de esta configuración es mini-
mizar la influencia de la distribución de la sobre las muestras La valoración turbidimétrica, debido a la
configuración de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
la influencia de la variación de la temperatura se puede disminuir al asegurar un de aire o la convección de calor adecua-
dos durante la incubación. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentración muestra y estándar (un conjun-
to completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez ob-
servados dentro de las gradilias.
Consideraciones sobre Dentro de las restricciones citadas el diseño de valoración recomendado
emplea una curva estándar de cinco concentraciones y una sola concentración de cada muestra.
Para la valoración en cilindro-placa, cada placa únicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estándar, es decir, 53) y una de las otras cuatro concentraciones del estándar 54 y Ss) o la muestra
La concentración de la muestra es una estimación basada en la concentración deseada. La muestra se debe diluir para propor-
cionar una concentración nominal que se estima es a la mediana de la concentración de referencia del estándar
(53)' El propósito de diluir a la mediana de la concentración de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caerá
dentro de la lineal de la curva estándar. La relativa de U3 en función de la curva están-
debe tener una relativa de 100%, La final de la muestra se obtiene
el resultado de U3 por el factor de dilución.
Una valoración debe considerarse si el valor de de la muestra calculado es inferior al 80% o al
125%. En dicho caso, íos resultados que la concentración de la muestra de la solu-
ción madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la se r."''''·.0n,r,,, supuesta de la rnuestra basándo-
se en el valor de potencia la valoración. De otro nnrp",n~ se dHivará de una de la curva
donde ¡as respuestas del estándar y la muestra no serán
Las determinaciones a variables intervaioración e de modo tal que
se requieren dos o más valoraciones para obtener una estimación confiable de la de una muestra de-
terminada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de tanto del estándar como de la muestra, por se-
pardo, llevar a cabo otro día valoraciones adicionales de una muestra determinada. La media debe incluir los resulta-
dos de todas las valoraciones independientes válidas. Ei número de valoraciolles requerido para una estimación de po-
tencia confiable depende de la variabilidad de la valoración y de la incertidumbre máxima requerida para la estimación de po-
tencia. Ésta última se evalúa rnediante la del intErvalo de confianza Cálculos, Urnites de confianza y combinaciones
de cálculos de valoración). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas a lo largo de
varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificación más estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoíiKiones se logra el límite
de confianza requerido con menos valoraciones.

Control de Usar equipo calificado y calibrado de manera para obtener los rangos de temperatura
especificados en la Tabla 3.
Aparato
Placas: Placas de Petri de desechabies o de vidrio 20 x 100 con tapas
Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8 ± 0,1 mm de diámetro externo; de 6 ± 0,1 mm de diámetro in-
terno; de 10 ± mm de altura. [NOTA-Limpiar los ciiindros cuidadosamente para eliminar es necesario
USP 39 Pruebas Biológicas / (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 157

limpiar ocasionalmente en un baño ácido, por ejemplo, con ácido nítrico aproximadamente 2 N o con ácido crómico (ver
Limpieza de Aparatos de Vidrio (1 051 »).]
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP de
un determinado antibiótico o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolven-
te especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentración especificada. Almacenar a 2°_8° y usar dentro del periodo indicado. En
el día de la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concen-
tración entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal ma-
nera que la mediana tenga la concentración sugerida en la Tabla 2.
Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el día de la valoración,
preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solu-
ción madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentración nominal igual a la mediana de la
concentración del estándar (53)'
Tabla 2
Solución Madre Dilución de Prueba
Mediana
Concentra- dela
Disolvente ción Diluyente Concentración Usar Diluyente Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S3)a,b
Anfotericina Bc,d Dimetil sulfóxido - - 1 mg/mL El mismo día B.10 e 1 flg/mL
Ácido clorhídrico
- -
Bacitracinaf 0,01 N 100 U/mL El mismo día B.1 e 1 U/mL
Bleomicina B.16 e - - 2 U/mL 14 días B.16 e 0,04 U/mL
Carbenicilina B.1 e - - 1 mg/mL 14 días B." 20 flg/mL
Cloxacilina B.1 e - - 1 mg/mL 7 días B.1 e 5 flg/mL
Colistemetato C Agua 10 mg/mL B.6 e 1 mg/mL El mismo día B.6 e 1 flg/mL
Colistina Agua 10 mg/mL B.6 e 1 mg/mL 14 días B.6 e 1 flg/mL
Dihidrostreptomicina 9 B.3 e - - 1 mg/mL 30 días B.3 e 1 flg/mL
Eritrom ici na Methanol 10 mg/mL B.3 e 1 mg/mL 14 días B.3 e 1 flg/mL
Gentamicina B.3 e - - 1 mg/mL 30 días B.3 e 0.1 flg/mL
Nafcilina B.1 e - - 1 mg/mL 2 días B.1 e 2 flg/mL
Natamicina Dimetil sulfóxido - - 1 mg/mL El mismo día B.10 e 5 flg/mL
Neomicina 9 B.3 e - - 1 mg/mL 14 días B.3 e 1 flg/mL
Novobiocina alcohol 10 mg/mL B.3 e 1 mg/mL 5 días B.6 e 0,5 flg/mL
Nistatinac,h Dimetilformamida - - 1000 U/mL El mismo día B.6 e 20 U/mL
Paromomicina B.3 e - - 1 mg/mL 21 días B.3 e 1 flg/mL
Penicilina G B.1 e - - 1000 U/mL 4 días B.1 e 1 U/mL
Polimixina Bi Agua - B.6 e 10000 14 días B.6 e 10 U/mL
U/mL
Sisomicina B.3 e - - 1 mg/mL 14 días B.3 e 0,1 flg/mL
Vancomicina Agua - - 1 mg/mL 7 días BAe 10 flg/mL
a Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b flg en esta columna se refiere a >'g de actividad.
c Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 Y 31,2 flg/mL antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
f Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra.
9 Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo,
h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 Y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica.
i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.

Inóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 mL de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de
dos o más placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 mL del me-
dio especificado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
 -158 ) Antibióticos-Valoraciones ~/licrobiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 mL de solución salina SR
estéril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la sección Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio
estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución salina SR estéril. Usando el espectrofotómetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificación del método, comenzando con los volúmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensión madre que se habrán de agregar al medio de inóculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibición de aproxi-
madamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (S3)' [NOTA-Los tamaños de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoración.] Si el por-
centaje de transmitancia de la dilución está por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adición de mi-
croorganismos a la capa de siembra. El factor de normalización se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de trans-
mitancia obtenido de la dilución. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inóculo para
obtener el volumen (mL) de suspensión de recolección que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de
inóculo diariamente, si fuera necesario, para obtener una relación de concentración-respuesta óptima.
Alternativamente, determinar durante la verificación del método la proporción de suspensión de recolección que se habrá
de incorporar al inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcación satisfacto-
ria de las zonas de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar
(S3) y que produzcan una relación de concentración-respuesta reproducible. Preparar el inóculo agregando una porción de
suspensión madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45°_50°. Agitar la mezcla por
rotación suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensión homogénea.
Tabla ~

Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del Il1óClllo
Temperatu-
Número a ra Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de Prueba ATCC Medio b (0) po Medio b (ml/100 mI..)
Amfotericina B 5accharomyces cerevisiae 9763 19 I 29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina lv1icrococcus luteus 10240 1 32-35 24 h 1 0,3
Bleomicina lv1ycobacterium smegmatis i 607 36 36-37,5 48 h 35 , 1,0
I
Carbeniciiina c I Ps€udOrnOno5 aerugínosa II 25619 1 36-37,5 24 h 10 0,5
~ ...;L-
o~ 3-J
,
Cioxacilina
I Colistimetato
Colistina
r- 5taphylococcus aureU5
Bordetella bronchiseptica
Bordetefla bronchiseptica
I
I
I
29737
4617
4617
1
1
1
I 32-35
32-35
, 24 h
24 h
24 h
1
10
10
0,1
0,1
0,1
Dihidroestreptomi-
1
I II I
Según se re-
1 cina I Baciilus subtilis I 6633 I 32 32-35 5 días I 5 I quiera

I Eritromicina
I
.M;crococcus /uteus 9341 1 32-35 24 h 11 1,5
Gentamicina 5taphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Nafcilina 5taphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,3
Neomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,4
Novobiocina 5taphylococcus epiderrnidis 12228 1 32-35 24 h 1 4,0
Nistatina Saccharomyces cere\lisiae 2601 19 29-31 48 h 19 1,0
Paromomicina _Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 2,0
Penicilina G Staphyiococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 1,0

¡--
Polimixina B Bordetella bronchiseptica 4617 I 1 32-35 24 h 10 0,1
Sisomicina 5taphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Según se re-
Vancomicina Bacillus subtilis 6633 32 32-35 5 días 8 quiera ;

a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 ([Link]
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 mL de una dilución 1:25 de la suspensión madre/1 00 mL de Medio 10.

Análisis: Preparar la capa base para el número requerido de placas de Petri para la valoración, usando el medio y el volumen
mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad
apropiada de inóculo para la capa de siembra (Tabla 5), según se indica para el antibiótico correspondiente (Tabla 3), realizan-
do los ajustes necesarios basándose en el análisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrás y hacia adelante para
esparcir el inóculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
USP 39 Pruebas Biológicas / (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 159

Tabla 4 (capa base)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medio a (mL)
Amfotericina Bb - -
Bleomicina 35 10
Carbenicilina 9 21
Colistimetato 9 21
Colistina 9 21
Dihidroestreptomicina 5 21
Eritromicina 11 21
Gentamicina 11 21
Neomicina 11 21
Nistatina b - -

Paromomicina 11 21
Polimixina B 9 21
Sisomicina 11 21
Vancómicina 8 10
Todos los demás 2 21
a Ver Medios y Soluciones, Medios.
b No se usa capa base.
[NoTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.]

Tabla 5 (capa de siembra)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medio a (mL)
Amfoterici na B Referirse a la Tabla 3 8
Bleomicina 6
Nistatina 8
Todos los demás 4
a Ver Medios y Soluciones, Medios.

Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guía mecáni-
ca u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contamina-
ción. Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibiótico que contengan los niveles de prueba (5)-55 y U3 ) espe-
cificados en el párrafo siguiente. Incubar las placas según se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros.
Medir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición del crecimiento con una aproximación de 0,1 mm.
Tabla 6
Antibiótico Temperatura de Incubación n
Amfotericina B 29-31
Carbenicilina 36-37,5
Colistimetato 36-37,5
Colistina 36-37,5
Dihidroestreptomicina 36-37,5
Gentamicina 36-37,5
Neomicina 36-37,5
Novobiocina 34-36
Nistatina 29-31
Paromomicina 36-37,5
Polimixina B 36-37,5
Sisomicina 36-37,5
Vancomicina 36-37,5
Todos los demás 32-35

Se usarán durante la valoración los estándares (5 1-Ss) Y un solo nivel de prueba de la muestra (U 3) correspondiente a 53 de la
curva estándar, según se definen en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estándar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (53) del estándar y cada uno de
160 ) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estándar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estándar, Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la
mediana de la dilución de prueba (S3) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilución de prueba correspondiente (U 3)
de la muestra.

MÉTODO TURBIDlMÉTRICO

Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatu-
ra especificados en la Tabla 8. [NOTA-El contra! de la temperatura se puede lograr con circulación de aire o agua. La mayor
capacidad térmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
Espectrofotómetro: La medición de la absorbancia o transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requie-
re un espectrofotómetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530
nm. Como alternativa, se puede usar un espectrofotómetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de
580 nm o 530 nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubación (ver Aparato a continuación).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rápido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un análisis de flujo continuo.
Ajustar automáticamente el instrumento a ceíO con un caldo no inoculado transparente, preparado según las especificacio-
nes de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de dilución de prueba (incluyendo formaldehído si se especifica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparación de los inóculos se puede medir tanto la absorbancia como la transmitancia.
Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plástico, [Link]., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NoTA-Usar tubos que tengan
una longitud, diámetro y espesor relativamente uniformes y que estén exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el
espectíOfotómetro, usar tubos idénticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar to-
dos los residuos de antibiótico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad del Estándar de Referencia USP de un antibió-
tico determinado o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especifi-
cado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentración requeridao Almacenar a 2°_8° y usar dentro del periodo indicado. En el día de
la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración en-
tre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1:1,25. [NoTA-Puede ser necesario usar relaciones más peque-
ñas para diluciones sucesivas de la solución madre para la valoración Usar el fina! de
manera tal que la mediana de los niveles del estándar tenga la concentración en la Tabla 7.
Soluciones; muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el día de
la valoración, preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP
Diluir la solución madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentración nominal a la mediana de la
concentración del estándar según se en la Tabla 7.
Tabla?
Solución Madre Dilución de [Link]
Concentril- Concentril-
I Usar I Diluyen- I Mediana de la
Disolvente
Antibiótico Inicial
ción
Inicial
Diluyente
Adicional
ción
Madre final
Dentro
I re Concentración
de I Final (S3)'
Capreomicina Agua - - 1 mg/mL 7 días Agua 1 00 ~lg/mL

Cloranfenicol Alcohol 10 mg/mL Agua 1 mg/mL 30 días I Agua 2,5 ,Llg/mL

Clortetraciclina Ácido clorhídrico 0,01 N - - I 1 mg/mL 4 días i Agua O,[Link]/mL
Dihidroestreptomicina b Agua - - 1 mg/mL 30 días Agua 30 flg/ml
Gramicidina Alcohol - - 1 mg/mL 30 días Alcohol 0,04 flg/mL
r'oleomicina b •d 8.3 c - - 100 flg/ml 14 días B.3 C 1,0 ~lg/mL

Oxitetraciclina Ácido clorhídrico 0,1 N - - 1 mg/mL 4 días Agua 0,24 flg/mL

Tetraciclina Ácido clorhídrico 0,1 N - - 1 mg/mL 1 día Agua 0,24 ~,g/mL

Tioestreptona El mismo Dimeti!

- -
Dimetil sulfóxido 1 U/mL día sulfóxido 0,80 U/mL
a )1g en esta columna se refiere a )1g de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 )1g/mL con Solución amortiguadora B.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 pg/mL de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 Y 2,88 mL de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 mL. Agregar 5,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 N a cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 Y 1,44 i19/mL de neomi~
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
USP 39 Pruebas Bioíógicas / ) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 161

Tabla 7 (Continuación)
Solución Madre Dilución de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (53)"
Troieandomicina Alcohol isopropílico yagua
- -
El mismo I
1 (4:1 ) 1 mg/mL día I Agua ! 25 pg/mL
Tilosina Metanol y
Metanol 10 mg/mL B.16 c 1 mg/ml 30 días B.3 C (1:1) 4,Llg/mL
a f l9en esta columna se refiere a flg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
c La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 flg/mL con Solución amortiguadora B.3 para obtener una solución con una concentración equivaiente a 25 flg/mL de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 Y 2,88 mL de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 mL. Agregar 5,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 1'1 a cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 Y 1,44 flg/mL de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.

Inóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 mL de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Enterococcus hirae (ATe e 10541) Y 5taphylococCU5
aureus (ATee 91 se cultivan en un medio líquido, no en agar. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 mL del medio especifi-
cado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo ya la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea
evidente.
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 mL de solución salina SR
estéril, usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un
frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Determinar durante la verificación del método la cantidad de suspensión de recolección que se usará como el inóculo, co-
menzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar también una S3 extra como una prueba de crecimiento. Incubar ¡as
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabia 71. Ajustar la cantidad de inóculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relación de concentración-respuesta óptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoración. Una vez
completados los periodos de incubación especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentración del estándar
deben los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duración exacta de ia obser-
vando el crecimiento en la concentración ele referencia de la concentración) del estiÍndar

iI ene l
r- I
I
II Número
I

Me-
Condiciones de incubación
I
I
Tempera-
tura Tiern-
Sugerida del inóculo

C,"Hd.d , ]
. I

Antibiótico Organismo de prueba ATCca dio b COl po Medio b (mLí100 mL)

Capreomicina Klebsiella pneumoniae 10031 I 1 36-37,5 16-24 h I 3 0,05 I
Cloranfenicol I Escherichia coli - I 10536 1 32-35 24 h 3 0,7
Clortetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1 --
Dihidroestreptomicina /(Iebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h I 3 0,1
Gramicidina Enterococcus hirae 10541 3 36-37,5 16-18 h 3 1,0
hleomicina
-- /(Iebsiella pneumonja_e_____ ----_._-
10031 1 36-37,5 LJ6-24 h
-- 39 I 2
Oxitetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 ~ 0,1
Tetraciclina Staphylococcu5 aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tioestreptona Enterococcus hirae 10541 40 36-37,5 18-24 h 41 0,2
Troleandomicina /(Iebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Tilosina Staphylococcus aureus 9144 I 3 35-39 16-18h 39 2-3
a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 ([Link]
b Ver Medios y Soluciones, Medios.

Tabla 9 --
-'
Absorbancia,
Antibiótico No menos de (u.a.)
Capreomicina 0,4
--
Clortetraciclina 0,35
Gramicidina 0,35
Tetraciclina 0,35
162 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas USP 39

Tab!a 9 (Continuación)
Absorbancia,
Antibiótico No menos de (u.a.)
Todos los demás 0,3

Análisis: En el día de la valoración, preparar la concentración necesaria de antibiótico, diluyendo soluciones madre del están-
dar y de cada una de las muestras, según se especifica en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de
prueba, cada uno por triplicado, del estándar (51-55) y un solo nivel de prueba también por triplicado, de hasta 20 mues-
tras correspondientes a 53 (mediana de la concentración) del estándar.
Tabla 10
Volumen de
Dilución de Volumen de
Prueba Inóculo
Antibiótico (ml) (ml)
Gramicidina 0,10 9,0
Tioestreptona 0,10 10,0
Tilosina 0,10 9,0
Todos los demás 1,0 9,0

Colocar los tubos en gradilias para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que con-
tengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibiótico. Agregar los volúmenes de las diluciones de prueba
del estándar y de la muestra, según se indica en la Tabla 7O. Distribuir aleatoriamente un set completo, inciuyendo los contro-
les, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inóculo especificado en la Tabla lOa cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un baño de agua mantenidos a 36,0°-37,5° duran-
te el tiempo especificado en la Tabla 11.

Tiempo de Incubación
Antibiótico I (h)
Capreoírlicina 3-4
Cloranfenicol 3-4
I Cicloserina 3-4
I Dir~droestreptom¡cina 3-4
, Estreptomicina 3-4
I~roieandomicina 3-4
[TlIos¡na 3-5
I Todos ¡os demás 4-5

Después de la incubación, inhibir inmediatamente el Ciecimiento del agregando mL de formaldehído diluido

a cada tubo, excepto para tilosina. Para calentar la gradilla en un baño de agua a 80°_90° durante 2-6 minutos o en
un baño de vapor durante 5-10 minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 ó 580
nm, analizando una gradilla cada vez.

Los medios requeridos para la preparación de los inóculos de los de se preparan con los ingredientes
listados en esta sección. Se permiten pequeñas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar me-
dios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equiva-
lentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estándar similar.
Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L Y ajustar las soluciones con hidróxido de sodio 1 f\J o ácido clorhí-
drico 1 N, según se requiera, de modo que, después de la esterilización con vapor, el pH sea el especificado.
Medio 1
Peptona 6,0 9
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1;0 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1
USP 39 Pruebas Biológicas / (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 163

Medio 2
Peptona 6,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de carne 1,5 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 3
Peptona 5,0 9
Extracto de levadura 1,5 9
Extracto de carne 1,5 9
Cloruro de sodio 3,5 9
Dextrosa 1,0 9
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 9
Fosfato monobásico de potasio 1,32 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,05

Medio 4
Peptona 6,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de carne 1,5 9
Dextrosa 1,0 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 5
Peptona 6,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de carne 1,5 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,9 ± 0,1

MedioS
Peptona 6,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de came 1,5 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 5,9 ± 0,1

Medio 9
Digerido pancreático de caseína 17,Og
Digerido papaínico de soja 3,0 9
Cloruro de sodio 5,0 9
Fosfato di básico de potasio 2,5 9
Dextrosa 2,5 9
Agar 20,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,2 ± 0,1

Medio 10
Digerido pancreático de caseína 17,0 9
Digerido papaínico de soja 3,0 9
Cloruro de sodio 5,0 9
164 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

Medio 10 (Continuación)
Fosfato dibásico de potasio 2,5 9
Dextrosa 2,5 9
Agar 12,6 9
Agua 1000 mL
Polisorbato 80 (agregado después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar) 10 mL
pH después de la esterilización 7,2 ±0,1

Medio 11
Peptona 6,0 9
Digerido pancreático de caseína 4,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de carne 1,5 9
Dextrosa 1,0 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 8,3 ± 0,1

Medio 13
Peptona 10,0 9
Dextrosa 20,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 5,6 ± 0,1

Medio 19
Peptona 9,4 9
Extracto de levadura 4,7 9
Extracto de carne 2,4 9
Cloruro de sodio 10,0 9
Dextrosa 10,0 9
Agar 23,5 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 6,1 ± 0,1

Medio 32
Peptona 6,0 9
Digerido pancreático de caseína 4,0 9
Extracto de levadura 3,0 9
Extracto de carne 1,5 9
Sulfato de manganeso 0,3 9
Dextrosa 1,0 9
Agar 15,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 6,6 + 0,1

Medio 34
Glicerol 10,0 9
Peptona 10,0 9
Extracto de carne 10,0 9
Cloruro de sodio 3,0 9
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1

Medio 35
Glicerol 10,0 9
Peptona 10,0 9
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 9
USP 39 Pruebas Biológicas / 165

Medio 35 (Continuación)
~A~g~a_r __________________________________________________________________________~__________'7,Og
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1

Medio 36
I Digerido panueático de caseína
I
15,0 g ----

Digerido papaínico de soja 5,0 9

Cloruro de sodio 5,0 g
Agar
15,O9~
Agua 1000 mL
pH después de la esterilización 7,3 ± 0,1 .1

Medio 39
Peptona I
5,0 9
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 9
Cloruro de sodio 3,5 9
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 9
Fosfato monobásico de potasio 1,32 9
Agua I 1000 mL
- -------~~----_.
-+-
I pH después de la esterilización I 7,9 ± 0,1

Medio 40
~ Extracto de levadura 20,0 9
--
Poiipeptona 5,0 9
Dextrosa I 10,0 g
i

::~-~:~
Fosfato mono básico de potasio
Poiisorbato 80
Agar 10,0 g ___
Agua
I
1000 mL j
pH después de la esterilización I 6,7 ± 0,2 _

Medio 4í
Digerido pancreático de caseínc::a____._____________________________+ ______--"-~2...
9,0 9 _ _ _ _---1I
Dextrosa 20,0 9
Extracto de levadura 5,0 9
Citrato de sodio 10,0 g I
Fosfato monobásico de potasio
Fosfato Dibásico de Potasio
1,0 g
1,0 g ~
Agua
pH después de la esterilización
1000 mL
6,8 ± 0,1 j
Soludones
Soluciones amortiguadoras: Preparar según se indica en la Tabla 12 o por otros medios adecuados. Las soluciones amor-
tiguadoras se esterilizan después de su preparación; el pH especificado en cada caso es el pH después de la esterilización.
Tabla 12. Soludones amortiguadoras

I~:;p",;
Concentración de Concentración de
Fosfato Fosfato Volumen de
Dibásico Monobásico Hidróxido de
de Potasio de Potasio Potasio 10 N de l.
Solución amortiguadora (gil) (gil) (ml) Esterilización a
1---
Solución amortiguadora B.l (1 %, pH 6,0) 2 8 -- I 6,0 ± 0,05
Solución amortiguadora 8.3 (0,1 M, pH 8,0) 16,73 0,523 -- I 8,0 ± 0,1
Solución amortiguadora 6.4 (0,1 M, pH 4,5) -- 4,5 ± 0,05
13,61 I
j
--

¿olución amortiguadora 6.6 (10%, pH 6,0) 20 80 --

I 6,0 ± 0,05
a Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.
166 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

Tabla 12 Soluciones amortiguadoras (Continuación)

Concentración de Concentración de
Fosfato Fosfato Volumen de
Dibásico Monobásico Hidróxido de
de Potasio de Potasio Potasio 10 N pH después de la
Solución amortiguadora (gil) (gil) (ml) Esterilización a
Solución amortiguadora B.1 0(0,2 M, pH 10,5) 35 - 2 10,5±0,1
Solución amortiguadora B.16 (0,1 M, pH 7,0) 13,6 4 - 7,0 ± 0,2
a Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.

Agua: Usar Agua Purificada.
Solución salina: Usar Solución salina SR.
Formaldehído diluido: Solución de formaldehído yagua (1 :3)

CÁLCULOS

Introducción: La potencia del antibiótico se calcula mediante la interpolación de una recta estándar o patrón obtenida por
transformación logarítmica y ajustada por cuadrados mínimos (ver los detalles sobre los cálculos a continuación). El analista
debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibiótico:
1. Las relaciones biológicas de concentración-respuesta por lo general no son lineales. El método de potencia del antibiótico
permite ajustar los datos a una línea recta, evaluando un intervalo de concentración estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoración se considerarán válidos únicamente si la potencia calculada es
80%-125% de la potencia asumida al preparar la solución madre de la muestra. Cuando la potencia calculada está fuera
del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedarfuera del intervalo de concentración estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra según corresponda
y repetir la valoración para obtener un resultado válido.
2. El medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geométrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoración. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes más pequeñas realizadas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más
confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total placas o tubos. Se requieren tres o
más valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibióticos.
3. El número de valoraciones requeridas para obtener una estimación confiable de potencia del antibiótico depende del in-
tervalo de especificación requerido y de la variabilidad de la valoración. El cálculo del límite de confianza descrito a conti-
nuación se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisión. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no será posible tomar una decisión
útil con respecto a si la potencia cumple con su especificación.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estándar un valor máximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor máximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la valida-
ción o la verificación. Si el intervalo de confianza calculado excede este límite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del límite. Se debe tomar en cuenta que la decisión de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino únicamente de la incertidumbre en dicha esti-
mación, según lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoración tiene un impacto mayor en
el límite de confianza calculado que el número de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los cálculos para determinar la potencia de los antibióticos, así como la realización del
cálculo de límite de confianza. Asimismo, se presentan métodos para calcular el error estándar con el propósito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoración. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logarítmica. El Apén-
dice 1 proporciona fórmulas para cálculos manuales cuando las concentraciones están equitativamente espaciadas en la escala
logarítmica. Se pueden usar métodos estadísticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.
Valoración en cilindro-placa: Esta sección detalla el análisis de datos de muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida, usando la valoración en cilindro-placa.
Datos de muestra: La Tabla 13 presenta los datos de una valoración que se usarán a manera de ejemplo a lo largo de esta
sección. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 Y 5 corresponden a la concentración de referencia y las otras tres zonas
son para una de las otras cuatro concentraciones, según se indican. Las otras columnas son necesarias para los cálculos y se
explican más adelante.
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estándar.
Ejemplo (ver la Tabla 13)
15,867 == X(16, 1; 15,6; ... ; 15,8)
USP 39 Pruebas Biológicas I > Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 167

67 = X(14,6; 14,1; oo.; 14,8)

Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviación estándar de los nueve valores de referencia y de la desviación es-
tándar de los nueve valores estándar. Para cada desviación estándar, determinar la desviación estándar relativa [Link]-
te.
Ejemplo: (ver la Tabla 73)

I .•• , 1
1,3% = (0,200/15,867) x 100
0,324 = 0'(14,6, ... , 1
2,3% = (0,324/14,167) x 100
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor máximo aceptable para la desviación es-
tándar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estándar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estándar) sobre-
pasan este máximo predeterminado, los datos de la valoración no serán adecuados y deben desecharse. [NOTA-El límite suge-
rido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Realizar una corrección de variación entre placas.
Esta corrección se aplica para convertir la medición de zona promedio obtenida para cada concentración al valor que se ob-
tendría si la medición de la concentración de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de corrección:
Xc = Xs - - P)

Xc = media corregida del estándar

Xs = media original del estándar
XR = media de la referencia
P = punto de corrección
Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 13 la corrección es:
14,022 = 1 67 - (15,867 -15,722) = 14,167 - 0,145
Paso 3: Det<:rminar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, !as mediciones corregidas de la zona en función del de los valores
de concentración estándar. Calcular !a ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no
estándar sobre estos usando software adecuado o los cálculos manuales del 7. el
tural o el logaritmo en base 10 para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente de determinación
para una regresión aceptabie. La regresión es aceptable sólo si la %R2 obtenida excede este valor [f'.JOTA-EI
límite sugerido para el coeficiente porcentuai de determinación es no menos de 95%.]
 Tabla 13. Datos de Muestra (Valoración en Cilindro-Placa) 0\
00
Referencia (53) Media Media
Repeti-
Están- ción Zona de la Muestra -----
00
dar de PI a- Zona 1 Zona 3 Zona 5 Media 2 Zona 4 Zona 6 Media Corregida
(U/mL) Concentración ca (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm) »
::::¡
5, 3,20 1 16,1 15,6 15,8 15,867 0,200 1,3 14,6 14,1 13,5 14,167 0,324 2,3 14,022 !:t.
er
2 16,0 15,9 16,2 14,5 14,1 14,4 O~
,..,.
¡:¡.
3 15,7 15,7 15,8 14,0 14,2 14,1 O
VI
4,00 1 15,8 15,6 15,5 15,567 0,158 1,0 14,7 15,1 14,8 14,833 0,265 1,8 14,989
~
52
2 15,7 15,5 15,6 14,7 14,9 15,2 QJ
3 15,7 15,4 15,3 14,8 15,0 14,3 O-
ti]
54 6,25 1 15,6 15,8 16,0 15,789 0,169 1,1 16,6 16,8 16,3 16,578 0,233 1,4 16,511 n
16,6 16,5 16,2
O'
2 15,8 15,6 15,7 ::::¡
ro
3 16,1 15,7 15,8 16,9 16,5 16,8 VI

5s 7,8125 1 15,6 15,6 15,5 15,667 0,141 0,9 17,3 17,0 17,0 17,167 0,224 1,3 17,222 ~
n...,
2 15,6 15,7 15,5 17,3 17,4 17,2 O
er
3 15,9 15,8 15,8 17,3 17,3 16,7 O'
15,722 a O;
[Link]
¡:¡.
U3 desconocida 1 15,7 15,8 15,7 15,678 0,179 1,1 15,3 15,8 15,7 15,478 0,307 2,0 15,522
QJ

--2'
VI
2 15,9 15,7 15,7 15,8 15,8 15,5
,
3 15,5 15,8 15,3 ---- -
_15,L_ 15,1 15,1
a Éste es el valor de la media de ref~rencia general, referida más adelante como el "punto de corrección".
~
S;
~
o'
~
§'

eVl
v
W
\O
USP 39 Pruebas Biológicas / > Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 169

La Tabla 14 resume la porción de la Tabla 13 requerida para esta parte del cálculo.
Tabla 14
Mediciones de la
Conjunto de lona Corregida Concentración
Estándares (mm) (U/m!.)
5) 14,022 3,2
e 14,989 4,0
J2

Referencia (53) 15,722 5

54 16,511 6,25
Ss 17,222 7,8125

Resultados de la regresión lineal

línea de la curva estándar:
Z = [3,551 x in(C)] + 9,978
Z = medición de zona corregida
C = concentración
%R2 = 99,7
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las medicio-
nes de la zona del estándar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variación entre
placas, usando el punto de corrección determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desco-
nocida, TI. [NoTA-Un método alternativo aceptable al uso del punto de corrección consiste en corregir usando el valor en la
línea de regresión estimada correspondiente al logaritmo de la concentración de 53 -] Usar la medición de zona promedio co-
rregida en la ecuación de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra, Lu,
mediante:
Lu=(U-a)/b

a intersección de la línea de regresión

0=

b = pendiente de la línea de regresión

Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el de Lu Y el resultado por cualquier
factor de dilución Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Medición de la zona de la muestra 13) '" 15,522
natural de la concentración de la muestra:
Lu 0= (1 =1
Concentración de la muestra:
Cu = e l •561 = 4,765

Porcentaje de concentración de referencia:

Resultado = (4,765/5,000) x 100 = 95,3%
Valoración turbidimétrica: Esta sección detalla el análisis de los datos de muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida usando la valoración turbidimétrica. El método asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria
dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de tempera-
tura que no es uniforme, se prefiere un diseño en bloques aleatorizados. En dicho diseño, la gradilla se divide en áreas (blo-
ques) de temperatura relativamente uniforme yen cada área se coloca al menos un tubo de cada concentración del Estándar y
de cada muestra desconocida. El análisis de datos del diseño en bloques aleatorizados es diferente del siguiente,
Datos de muestra: La Tabla 15 presenta los datos de una valoración que se usarán como ejemplo a lo largo de esta sec-
ción. Se requieren otras columnas para los cálculos, las cuales se explican a continuación.
Tillbiill 15 [)latos de Muestra (Valoración [Link]étl'ka)
Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (pg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,8545
2 0,8422
5) 64 3 0,8495 0,8487 0,0062
1 0,8142
2 0,8273
52 80 3 0,8392 0,8269 0,0125
170 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

Tabla 15. Datos de Muestra (Valorildóll TUl"bidimétl"icill) (Continuación)

Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (flg/ml) Repetidón (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,6284
2 0,6947 I
5] 100 3 0,7563 0,6931 0,0640 I
I 1 0,6933 1
2 0,6850
S4 125 3 0,6699 0,6827 0,0119 I
1 0,5299
2 0,5779
55 156 3 0,5316 0,5465 0,0272

1 0,7130
2 0,7960
U3 desconocida 3 0,7201 0,7430 0,0460

Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.

Para cada concentración (incluyendo la muestra); promediar los tres valores de absorbancia.
Ver 57 en la Tabla 15.
0,8487 = )((0,8545; 0,8422; 0,8495)
Para cada concentración, determinar la desviación estándar de las tres lecturas y una desviación estándar combinada para to-
das las concentraciones.
Ejemplo: Ver 57 en la Tabla 15.
0,0125 = 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raíz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = + 25)2 + (0,0640)2 + (0,0119)2 +
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviación estándar combinada máxima acep-
table. Si la desviación estándar combinada excede este máximo predeterminado, los datos de valoración no son adecuados y
se deben descartar. [~,jOTA-E! límite sugerido para la desviación estándar combinada es no más de '10% del valor de absor-
bancia promedio a través de las cinco concentraciones.] Si el número de determinaciones repetidas por concentración es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviación estándar relativa para cada concentración después de verificar valores
)' comparar con una desviación estándar relativa máxima aceptable. [I'JOTA-EI límite sugerido para la desviación es-
tándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando los valores de absorbancia promedio en función del logaritmo de los valo-
res de concentración del estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no pon-
derada sobre estos valores usando software apropiado o los cálculos manuales del Apéndice 1. [NOTA-Usar el logaritmo natu-
ralo el logaritmo en base 10 para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba finaL] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente porcentual de determina-
ción (%R2) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable únicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor pre-
determinado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 90%.]
La Tabla 76 resume la porción de la Tabla 75 requerida para esta parte del cálculo.

¡-
Tabla 16
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentración
Estándares (u.a.) Ülg/ml)
51 0,8487 64
52 0,8269 80
S3 0,6931 100
54 0,6827 125
e 0,5465 156
"5

Resultados de la regresión lineal

línea de la curva estándar:
USP 39 Pruebas Biológicas / (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 171

Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x loglo(concentración)]

%R2 = 93,0%
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres medi-
ciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, U. Usar esta medición promedio en la ecuación
de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra desconocida! mediante:
Lu = (U-
a = intersección de la línea de regresión
b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu Y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 15) = 0,7430.
10glO(Cu) == (0,7430 - 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696
Cu = 10 1 ,9696 = 93,2

Porcentaje de concentración de referencia = (93,2/100,0) x 100 = 93,2%

Cu = concentración de la muestra
límites de confianza y combinación de los cálculos de las valoraciones: Debido a la variabilidad entre valoraciones, se
requieren tres o más determinaciones independientes para una estimación confiable de la potencia de la muestra. Para cada
determinación independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estándar como de la muestra,
preparadas por separado, y repetir la valoración de una muestra determinada otro día.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el método del Apéndice 2 para verifi-
car valores atípicos. Esta determinación debe realizarse en la escala logarítmica.
Para obtener una estimación combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviación estándar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, según se indica a continuación:
antiiog(M - teO,05, N- 1) x sohlN], antilog[M + N - 1) x SO /0NJ
M = promedio
SO desviación estándar
0=

N número de valoraciones
0=

N-l) el punto del 5% de dos colas de una distribución t de Student con N-l grados de libertad
0=

NOTA-El valor t está disponible en de cálculos, textos estadísticos y software estadístico,

w= f\J--l) x
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor máximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el límite de aceptación, continuar con valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logarítmica natural de
1,561; 1,444; 1,517 Y 1,535. Entonces:
N==4
M == X(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514
SO == G(l,561; 1,444; 1 7; 1,535) = 0,050
t= 3,182

El intervalo de confianza en la escala logarítmica es

1,514 ± (3,182 x 0,050/04) == (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es
e 1,514 = 4,546
con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e 1,434, e 1,594 == (4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptación es el cociente 4,924/4,546 ==
1,083.
172 ) Antibióticos--Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 39

Cambio en la redacción:

1, FÓRMULAS PARA CÁLCULOS MANUALES DE REGRESIÓN Y CONCENTRACIÓN DE

LA MUESTRA

Cuando las concentraciones están igualmente espaciadas en la escala logarítmica, los cálculos se realizar usando la
fórmula. Donde:
Sk = media de la medición de zona corregida (valoración en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoración
turbidimétrica) para el conjunto estándar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
"5 = media de los cinco valOíes Sk
Lk = logaritmo de la concentración k correspondiente. [f\lOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10.] La
pendiente de la línea de regresión se calcula mediante:

b = (Yalta - Ybaja)/(Xalta-

Yalta = 1/s(35s + iS4 + 53 - 51)

= 11s(35 1 + 252 + 53 - 55)
= L5
Xbajo = Ll
Combinar y simplificar a:

El logaritmo de la concentración de la muestra se halla usando:

Lu= -I-[(U-S)/b]

Por usando los datos para la valoración en cilindro-placa en la Tabla 73 Y logaritmos naturales:
fj¡b == [(4 x 17,222) + (2 x 1 1) 0_ (2 x 14,989) - (4 x 14,020)]í{5[ln(7,81)- == 3,551 @ ERR(Ol Qct-20í5)
o

s 0= (14,020 + 1 +1 + 16,511 + 1 '" 15,693

natura! de la concentración de la muestra 0= -1- 5,522- 1 ] =: 1
Concentración de la muestra = e1.561 ==

2: DE

Toda medición que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoración deberá ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medición o tabulación. El rechazo o la retención arbitrarios de una
medición aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por ío general, el rechazo de mediciones que
se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medición de potencia sospechada, o atípica, se puede analizar en función del criterio siguiente, el cual se basa en la
variación dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribución normal. En prome-
dio, el criterio rechazará una observación válida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de Yl a YN! donde y¡ es el posible valor atípico, y N es el número de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha relativa usando la Tabla A2-7! Prueba para Detectar Mediciones Atípicas y las fórmulas siguientes:
Cuando N == 3 a 7:

Cuando N == 8 a 10:

Cuando N = 11 a 13:

Si Gl , o G3, según corresponda, excede el valor crítico en la Tabla A2-J I Prueba para Detectar Mediciones para la
N observada, existe una base estadística para omitir la(s) medición(es) atípica(s).