UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Química
Laboratorio de Tecnología Enzimática.
“Actividad y cinética enzimática de B- galactosidasa obtenida a partir de
comprimidos de venta comercial”
Briones Montiel Daniela Ixtzel
Chávez Rodriguez Ismael
Pérez Rayo Mariann Odali
22/03/2022
➔ Objetivos:
1. Obtener la enzima -galactosidasa a partir de comprimidos de venta comercial
para caracterizarla posteriormente.
2. Determinar el efecto de la concentración de enzima sobre la actividad
enzimática.
3. Obtener la constante de Michaelis (KM) y la velocidad máxima (Vmax) de la
enzima lactasa de venta comercial a partir de curvas de absorbancia vs
tiempo.
4. Observar el efecto de la inhibición en la enzima.

➔ Introducción:
La lactasa es una enzima beta-galactosidasa, hidroliza la lactosa en el intestino
delgado para que se pueda absorber. La lactosa es un disacárido compuesto por los
monosacáridos glucosa y sacarosa.
Las beta-galactosidasa, son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces
glactosidicos beta-1,4. Estas enzimas se encuentran distribuidas en la naturaleza en
numerosos microorganismos, en plantas y en tejidos animales.
La lactasa ayuda a digerir la lactosa y por lo tanto reduce la flatulencia, hinchazón,
diarrea y otros síntomas asociados al déficit de lactasa en las personas con
intolerancia a la lactosa leve. La lactasa se utiliza en la industria alimentaria con
algunos fines tecnológicos, por ejemplo en leches concentradas o evaporadas,
puede adicionarse para evitar su cristalización, evitando así una textura grumosa y
poco deseable. Además la lactasa produce la disgregación de lactosa en glucosa y
galactosa, por lo que da un sabor más dulce sin aumentar el contenido calórico. La
dosis que normalmente se utiliza para la ingestión oral de lactasa es 6000-9000 UI,
unos 15 minutos antes de tomar productos lácteos con lactosa. También puede ser
añadida a productos que contienen lactosa.
Estructura
La enzima de E. coli se compone de cuatro monómeros idénticos, cada uno con
1023 aminoácidos organizados en cinco dominios más un péptido. El péptido se
denomina "péptido α". El sitio activo, ubicado en un dominio con un motivo de barril
de isómero de triosa fosfato (TIM), se comparte entre las subunidades. La
β-galactosidasa es activa solo como tetrámero.
El sustrato se une inicialmente cerca de la superficie cuando el bucle está "abierto" ,
pero luego se mueve más hacia el sitio y el bucle se "cierra"
Sustrato
O-nitrofenil-beta-D-galactopiranosido (ONPG) es un sustrato artificial
estructuralmente similar a la lactosa, excepto que la glucosa se sustituye por un
grupo o-nitrofenilo. A diferencia de la lactosa, el sustrato ONPG es capaz de entrar
en la célula bacteriana sin la presencia de permeasa.

Durante la hidrólisis, por la acción de la enzima β-galactosidasa, ONPG se divide en

dos residuos, galactosa y o-nitrofenol. ONPG es un compuesto incoloro: O-nitrofenol
es amarillo, proporcionando evidencia visual de hidrólisis.

➔ Hipótesis:
1. Concentraciones enzimáticas más altas, más moléculas están disponibles
para unirse al sustrato y catalizar la reacción.
2. Concentración de sustrato sea mayor que la concentración de la enzima, hay
una relación directa entre la concentración de la enzima y la actividad
enzimática.
3. Aumentar la concentración de inhibidor, disminuye la km
➔ Análisis de resultados:
Concentración de la proteína
Se determinó utilizando la siguiente fórmula:
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ( 𝑚𝐿 ) = 1. 55 𝐴280 − 0. 76𝐴260

Sin embargo la primera toma de absorbancia a 260 nm dio como

resultado 1.187 por lo cual se decidió diluir 1:10 el extracto enzimático.
Concentración de proteína en la dilución 1:10

𝐴280=0.160 𝐴260= 0.042

𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎1:10 ( 𝑚𝐿 ) = 1. 55(0. 16) − 0. 76(0. 042)
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎1:10 ( 𝑚𝐿 ) =0.21608

Para obtener la concentración total de proteína se multiplicó por 10 el

resultado anterior.
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ( 𝑚𝐿 ) =2.1608
Para obtener los gramos de proteína en las tabletas disueltas en 50 ml
el cual fue el volumen al cual se aforó inicialmente el polvo de las
pastillas:
𝑚𝑔
2. 1608 𝑚𝐿
(50 𝑚𝑙) = 105. 34 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
Tomando en cuenta que el peso en polvo de las cuatro pastillas fue de:
 𝑚𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 = 1590 𝑚𝑔

Esto quiere decir que los 105.34 mg representan sólo el 6.6 % de la

muestra total en polvo pesado es proteína probablemente extracto
enzimático, lo demás probablemente sea excipiente.
Medición de actividad enzimática
La actividad enzimática se determinó por medio de un
espectrofotómetro con el cual se siguió la reacción durante 1 minuto.

Considerando la ley de lambert-beer:

𝐴𝑏𝑠
𝐴𝑏𝑠 0.0044 1000000 μ𝑚𝑜𝑙 60 𝑠 μ𝑚𝑜𝑙
𝑈1:10 = ε𝑏
= 𝐿
𝑠
( 1 𝑚𝑜𝑙
)( 1 𝑚𝑖𝑛 )(0.003 L)= 0.176 𝑚𝑖𝑛
4500 𝑐𝑚 𝑚𝑜𝑙
(1 𝑐𝑚)

Considerando el factor de dilución 1:10 la actividad total es

μ𝑚𝑜𝑙
𝑈𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 =1.76 𝑚𝑖𝑛

● Parte 1: Efecto de la concentración de la enzima sobre la

actividad enzimática.
Tabla 1. Datos crudos del experimento.

Muestra A Muestra B Muestra B Muestra C Muestra D Muestra E Muestra F Muestra G

t (s) Abs Abs Abs Abs Abs Abs Abs

0 0.189 0.643 0.351 0.364 0.513 0.959 0.797

2 0.216 0.405 0.513 0.594 1.121 0.824

4 0.243 0.5 0.567 0.635 1.189 0.945

6 0.27 0.527 0.608 0.756 1.243 1.027

8 0.31 0.54 0.621 0.81 1.351 1.108

10 0.337 0.829 0.621 0.689 0.878 1.418 1.162

12 0.364 0.635 0.662 0.932 1.432 1.216

14 0.324 0.716 0.689 1.1 1.486 1.256

16 0.364 0.797 0.77 1.054 1.527 1.27

18 0.337 0.77 0.743 1.121 1.527 1.31

20 0.405 0.998 0.797 0.729 1.121 1.581 1.31

22 0.445 0.824 0.783 1.121 1.635 1.351

24 0.432 0.864 0.797 1.189 1.635 1.364

26 0.445 0.932 0.81 1.202 1.675 1.364

28 0.472 9.45 0.864 1.202 1.702 1.391

30 0.486 1.127 9.59 0.851 1.256 1.729 1.391

32 0.51 1 0.864 1.256 1.743 1.405

34 0.527 1.04 0.878 1.27 1.716 1.405

36 0.54 1.067 0.878 1.27 1.756 1.418

38 0.567 1.0675 0.878 1.297 1.756 1.418

40 0.554 1.23 1.081 0.891 1.297 1.77 1.418

 42 0.567 1.108 0.891 1.297 1.77 1.445

44 0.567 1.148 0.891 1.31 1.783 1.432

46 0.594 1.175 0.905 1.31 1.81 1.456

48 0.608 1.1756 0.905 1.324 1.81 1.456

50 0.635 1.305 1.189 0.905 1.324 1.864 1.472

52 0.621 1.189 0.959 1.364 1.878 1.432

54 0.648 1.121 0.945 1.337 1.878 1.418

56 0.675 1.189 0.905 1.337 1.878 1.472

58 0.662 1.229 1.4 1.85 1.472

60 0.648 1.362

Tabla 2. Absorbancia corregida.

Muestra Muestra Muestra Muestra Muestra Muestra

A B C Muestra D E F G

t (s) Abs Abs Abs Abs Abs Abs Abs

0 0 0 0 0 0 0 0

2 0.027 0.054 0.149 0.081 0.162 0.027

4 0.054 0.149 0.203 0.122 0.23 0.148

6 0.081 0.176 0.244 0.243 0.284 0.23

8 0.121 0.189 0.257 0.297 0.392 0.311

10 0.148 0.186 0.27 0.325 0.365 0.459 0.365

12 0.175 0.284 0.298 0.419 0.473 0.419

14 0.135 0.365 0.325 0.587 0.527 0.459

16 0.175 0.446 0.406 0.541 0.568 0.473

18 0.148 0.419 0.379 0.608 0.568 0.513

20 0.216 0.355 0.446 0.365 0.608 0.622 0.513

22 0.256 0.473 0.419 0.608 0.676 0.554

24 0.243 0.513 0.433 0.676 0.676 0.567

26 0.256 0.581 0.446 0.689 0.716 0.567

28 0.283 9.099 0.5 0.689 0.743 0.594

30 0.297 0.484 9.239 0.487 0.743 0.77 0.594

32 0.321 0.649 0.5 0.743 0.784 0.608

34 0.338 0.689 0.514 0.757 0.757 0.608

36 0.351 0.716 0.514 0.757 0.797 0.621

38 0.378 0.7165 0.514 0.784 0.797 0.621

40 0.365 0.587 0.73 0.527 0.784 0.811 0.621

 42 0.378 0.757 0.527 0.784 0.811 0.648

44 0.378 0.797 0.527 0.797 0.824 0.635

46 0.405 0.824 0.541 0.797 0.851 0.659

48 0.419 0.8246 0.541 0.811 0.851 0.659

50 0.446 0.662 0.838 0.541 0.811 0.905 0.675

52 0.432 0.838 0.595 0.851 0.919 0.635

54 0.459 0.77 0.581 0.824 0.919 0.621

56 0.486 0.838 0.541 0.824 0.919 0.675

58 0.473 0.878 0.887 0.891 0.675

60 0.459 0.719

Gráfico 1. Absorbancia vs tiempo. (primeros 20 s)

Gráfico 2 [Vin/S] y 3 [1/Vin/1/S]
 ● Cálculo de la Vmax y Km
−5
𝑦 = 4𝑥10 𝑥 + 0. 0135
1
𝑉𝑖𝑛
= 4𝑥10 ( ) + 0. 0135
−5 1
𝑆
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 0. 0135
−1 −1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 74. 074 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑚 −5
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 4𝑥10
𝐾𝑚 −5
74.074
= 4𝑥10
−3
𝐾𝑚 = 2. 9629𝑥10 𝑚𝑀
En cualquier reacción catalizada, el sustrato debe unirse primero con la enzima para
formar el complejo enzima-sustrato. Para una concentración de sustrato particular,
un aumento en la concentración enzimática aumenta la velocidad de la reacción
catalizada. A concentraciones enzimáticas más altas, más moléculas están
disponibles para unirse al sustrato y catalizar la reacción.
Pero al comparar los resultados obtenidos en el experimento con los de la literatura,
el valor de km se queda por debajo del rango (el valor de la literatura tiene un rango
de 0.0381-35 mM). El valor obtenido es 2.9629e-3 mM. El porcentaje de error es de
92.223%. Lo cual no hace cumplir la teoría y podría deberse a un mal manejo del
sustrato o malas condiciones de la lectura de absorbancia.
Inhibición.
Datos sin inhibición.

Datos con inhibición.

 𝑦 = 1. 725𝑥 + 0. 0002
1
𝑉𝑖𝑛
= 0. 0002

−1 −1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 5000 µ𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑖𝑛 = 5 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛 𝑐𝑜𝑛 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛
𝐾𝑚
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 1. 725

𝐾𝑚 = 8625µ𝑀 = 8. 625 𝑚𝑀 𝑐𝑜𝑛 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛

−5
𝑦 = 1. 7104𝑥 + 5 * 10
1 −5
𝑉𝑖𝑛
= 5 * 10

−1 −1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 20000 µ𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑖𝑛 = 20 𝑚𝑀 𝑠𝑖𝑛 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛
𝐾𝑚
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 1. 7104

𝐾𝑚 = 34208µ𝑀 = 34. 208 𝑚𝑀 𝑠𝑖𝑛 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛

 ➔ Conclusiones:
A mayor concentración de enzima o de sustrato se incrementa la
velocidad de reacción hasta alcanzar una velocidad máxima en la cual
la enzima se satura de sustrato.
La glucosa disminuye tanto la velocidad máxima como la KM en
comparación con la reacción sin inhibición.
De acuerdo con los datos experimentales la glucosa funciona como un
inhibidor no competitivo ya que las ecuaciones de las rectas se
intersectan en el eje x negativo en el punto [ONPG]=-0.01 mM
La glucosa no bloquea la unión del ONPG con el sitio activo, sino que
se pega a otro sitio y evita que la beta-galactosidasa haga su función.
➔ Referencias bibliográficas

1. Timberlake, K. (2013). Química general, orgánica y biológica: estructuras de

la vida. México: Pearson Educación.
2. Guerrero Eraso, C. A. (2009). Inhibición de la actividad enzimática de la
polifenol oxidasa extraída del banano (Cavendish valery) mediante sistemas
bifásicos acuosos con isoespintanol y ácido ascórbico. Departamento de
Ingeniería Agrícola y de Alimentos.
3. Movahedzadeh, F. (2010). Study on b-galactosidase enzyme produced by
isolated lactobacilli from milk and cheese. African Journal of Microbiology
Research, 4(6), 454-458.to de Ingeniería Agrícola y de Alimentos.