EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS DE LA UNAN-MANAGUA
SECCIÓN DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
RENÉ SILVA A.
OBJETIVOS
1. INDICAR LA IMPORTANCIA DE LA EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN
2. INDICAR LOS OBJETIVOS DE UNA BUENA EXTRACCIÓN
3. DESCRIBIR LAS ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN
4. DISTINGUIR ENTRE LOS PRINCIPALES MÉTODOS DE
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN de ADN GENÓMICO Y de
ARN
5. DESCRIBIR LOS MÉTODOS PARA DETERMINAR
CONCENTRACIÓN, PUREZA e INTEGRIDAD
6. SEÑALAR LAS FORMAS DE ALMACENAMIENTO DE LOS
DISTINTOS ÁCIDOS NUCLEICOS
IMPORTANCIA
Todo procedimiento
en biología
molecular comienza
con la extracción de
ácidos nucleicos!!
OBJETIVOS DE UNA BUENA EXTRACCIÓN
• CANTIDAD
• INTEGRIDAD
• PUREZA
LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
DEPENDEN DE
1.ESTADO DE LA MUESTRA
2.ORIGEN DE LA MUESTRA
3.PROPÓSITO DE LA MUESTRA
ETAPAS
1. LISIS
2. CLARIFICACIÓN
3. PURIFICACIÓN
4. CONTROL DE CALIDAD
5. ALMACENAMIENTO
ETAPAS BÁSICAS PARA EXTRAER Y PURIFICAR
ÁCIDOS NUCLEICOS
LOS PASOS GENERALES PARA LA
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN
EXTRACCIÓN:
LISIS CELULAR
DESPROTEINACIÓN (Eucariotas)
INACTIVACIÓN DE NUCLEASAS
CLARIFICACIÓN
PURIFICACIÓN:
De otros ácidos nucleicos no deseados
De Lípidos, carbohidratos
De sales y otros compuestos orgánicos
De proteínas solubles
LISIS
MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA
EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS
MÉTODOS MECÁNICOS MÉTODOS NO MECÁNICOS
FRICCIÓN ENZIMÁTICOS
AGENTES QUÍMICOS
CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN
ULTRASONIDO LISOZIMA
CHOQUE OSMÓTICO GLUCANASA
MANANASA
CELULASA
PECTINASA
MÉTODOS QUÍMICOS
• DETERGENTES
(SDS,TRITON X100, CTAB).
• SOLUCIONES ALCALINAS
• SOLVENTES ORGÁNICOS
(TOLUENO)
MÉTODOS FRECUENTES DE LISIS QUÍMICA
1. CTAB (DETERGENTE): PLANTAS
2. LISIS ALCALINA (SDS + NaOH): PLÁSMIDOS
BACTERIANOS
3. SDS + ARNasa (DETERGENTE): ADN DE
SANGRE Y TEJIDOS FRESCOS DE MAMÍFEROS
4. SDS + DNAsa (DETERGENTE): ARN DE
SANGRE Y TEJIDOS FRESCOS DE MAMÍFEROS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
• LISOZIMA/BACTERIAS
• GLUCANASAS,
MANANASAS/LEVADURAS
• CELULASAS,
PECTINASAS/PLANTAS
DESPROTEINACIÓN (EUCARIOTAS)
E INHIBICIÓN DE NUCLEASAS
• PROTEINASA K
• EDTA
CLARIFICACIÓN
ADN Y PROT. SOLUBLES
CENTRIFUGACIÓN EN FASE ACUOSA
PROT. INSOLUBLES Y
MEMBRANAS
PURIFICACIÓN
Eliminación de:
➢Ácidos nucleicos no deseados
➢Lípidos, carbohidratos
➢Sales y otros compuestos
usados en la extracción
➢Proteínas solubles
PURIFICACIÓN MODERNA
FIJACIÓN A UNA MATRIZ
ADSORCIÓN
MAGNETISMO
INTERCAMBIO IÓNICO
ADSORCIÓN A MATRICES
DE SÍLICA
DNA eluye de
la sílica en
agua
DNA se une
a la sílica
en NaI
TUBO COLUMNA
COLECTOR DE SÍLICA
FIJACIÓN A PERLAS MAGNÉTICAS
MUESTRA PROTEINASA K FIJACIÓN SEPARACIÓN
LISIS PERLAS LAVADO ADN/ARN
INTERCAMBIO IÓNICO
CONTROL DE CALIDAD
• INTEGRIDAD
• CONCENTRACIÓN
• PUREZA
CONTROL DE LA INTEGRIDAD
CONTROL DE CONCENTRACIÓN Y PUREZA
ADN/ARN
PROTEÍNAS
PREGUNTAS
MATERIAL
ADICIONAL
(NO ES OBLIGATORIO)
TERMINOLOGÍA
• Es un proceso por el cual átomos, iones o
ADSORCIÓN: moléculas son atrapadas o retenidas en la
superficie de un material.
• Es una sustancia que desorganiza la
estructura tridimensional en
AGENTE CAOTRÓPICO: macromoléculas como proteínas, ADN o
ARN y las desnaturaliza.
CTAB (BROMURO DE • Es una sal de amonio cuaternario
HEXADECILTRIMETIL
AMONIO):
LISIS CELULAR: • Es la rotura de la membrana celular.
TERMINOLOGÍA
• Para homogeneizar células y tejidos en una
MICROPISTILOS EPPI escala de medición Eppendorf® para tubos de
PARA TUBOS DE ENSAYO: ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta).
• Es una denominación utilizada para referirse a
PELLET pequeñas porciones de material aglomerado o
comprimido.
SDS • Es un compuesto tensoactivo iónico
(SODIODODECILSULFATO)
• Es un tubo de microcentrífuga de forma
de un pequeño contenedor cilíndrico de
TUBOS EPENDORF plástico, con un fondo cónico y una tapa
unida al cuerpo del tubo para evitar su
desprendimiento.
CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN
LA EXTRACCIÓN DE ADN
MÉTODOS
CONVENCIONALES
1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE
GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO
(MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):
Fundamento del método:
Extracción de ácidos nucleicos utilizando una
solución del agente caotrópico de Tiocianato de
Guanidino que genera lisis celular y degradación
de proteínas con la liberación de los ácidos
nucleicos.
Posteriormente el uso de solventes orgánicos
fenol- cloroformo que permiten su separación de
restos de proteínas, lípidos y la posterior
precipitación de los ácidos nucléicos usando
etanol o isopropanol.
EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE
CHONCZYNSKI
Muestra
vegetal - LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR
PULVERIZAR EN - DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E
EL MORTERO INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS.
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO A pH BÁSICO < 11
CENTRIFUGA
FENOL
CLOROFORMO ADN
FASE ACUOSA SUSPENSIÓN
ADN , RESTOS DE
PROTEÍNAS Y LIPIDOS PROTEÍNAS
CENTRIFUGA Y LÍPIDOS
DISUELTOS
FASE SÓLIDA
RESTOS DE ALTO PESO
MOLECULAR
ALCOHOL
ETÍLICO PURO
CENTRIFUGA
ADN EN FORMA
DE FILAMENTOS
PELLET DE ADN
EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE
CHONCZYNSKI
Homogenizado de
muestra vegetal
pulveriza previamente y
conservada en
nitrógeno líquido a
-196°C SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO A pH REDUCIDO -
ACETATO DE SODIO – FENOL -
CLOROFORMO
CENTRIFUGACIÓN A
4°C
ALCOHOL
ISOPROPÍLICO
FASE ACUOSA
ARN TOTAL
FASE ACUOSA PELLET DE ARN
TOTAL
FASE ORGÁNICA ARN TOTAL
ADN, PROTEÍNAS Y
LIPIDOS DISUELTOS
2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
POR LISIS ALCALINA
Fundamento del método:
Se basa en las diferencias
en la desnaturalización y
renaturalización del ADN
plasmídico y el ADN
cromosómico al aplicar
NaOH en presencia de un
detergente fuertemente
aniónico como el
Dodesilsulfato de Sodio
(SDS) y Acetato de
potasio.
Se usa principalmente para
extracción de ADN plasmídico
de E. coli.
EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS
ALCALINA
-Lisis celular
Crecimiento de
Cultivo bacteriano -Desnaturaliza
de E. coli ✓ Proteínas
✓ ADN cromosómico
Detergente SDS
+ NaOH ✓ADN plasmídico
Cosecha de cultivo
bacteriano
pH FUERTEMENTE
ALCALINO DEL
MEDIO
Acetato
pH NEUTRO DEL
de
MEDIO potasio
-ADN plasmídico -Precipitación:
se mantiene en ✓ ADN cromosómico.
CENTRIFUGAMOS
solución ✓ proteínas .
3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
Fundamento del método:
- Elaborado por Murray y Las células vegetales
Thompson en 1980. pueden lisarse con el
detergente iónico bromuro
- Adecuado para extraer y de cetiltrimetil amonio
purificar ADN de vegetales y (CTAB), que forma un
especialmente indicado para complejo insoluble con los
eliminar los polisacáridos y ácidos nucleicos en medio
los compuestos polifenólicos hiposalino. De ese modo,
que dañarían al ADN. los polisacáridos, los
compuestos fenólicos y los
demás contaminantes
permanecen en el
sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado.
PASOS:
2.- Suspender la
1.- Se debe moler la muestra en
muestra después de solución tampón 3.-Centrifugo, elimino
congelación con de extracción, que el sobrenadante y lavo.
Nitrógeno líquido contiene EDTA,
Tris-HCl y CTAB.
ADN 5.-Añado etanol 4.- Incrementando la
puro y ARNasa concentración salina
EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR
Y NUCLEAR
EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO
INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
4.- CENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE DE BrEt - CsCl
- Técnica usada para la Mini
preparación de ADN plasmídico .
- Requiere de cultivo bacterial a gran
escala.
- Separa ADN plasmídico
superenrrollado del ADN
plasmídico circular que está en
estado relajado, concentrándolos
por centrifugación en una
gradiente de Bromuro de Etidio – Superenrrolado: DNA circular.
Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.) Covalentemente DNA que no se ha
cerrado y muy empacado.
empacado.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
• Fundamento del método:
El BrEt ingresa y se intercala en
la cadena de ADN
disminuyendo su densidad, pero
lo hace en mayor cantidad en el
ADN plasmídico en estado
relajado que en el ADN
plasmídico superenrrollado.
pudiéndose separar por
centrifugación en el gradiente
de densidad de CsCl.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA
GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA
+ BROMURO DE ETIDIO CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE
CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl
4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR
CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)
En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en
que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de
200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli
A+.
Cromatografía de afinidad
Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros
ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en
la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre
sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T
que contiene la resina cromatográfica.
Mediante purificación de
poli(A)-ARN: hay ARNm
con una cola de
poliadeninas, mas de 100,
llamada poli(A), estos ARN
se pueden aislar por
cromatografía en columna
de celulosa de oligo dT
celulosa. La cola poli(A)
hibridará con la cadena
oligo dT, fijándose en la
columna. Después de lavar
los ARN no fijados el
ARNpoli(A) se eluye y se
precipita con alcohol etílico
frío.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE
SÓLIDA
Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los
métodos convencionales.
Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos
en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido
de sales del buffer.
La interacción de los puentes de hidrógeno con una
matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas
El procesode
Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por
absorción está
medio de un intercambio aniónico
basado en los
siguientes principios
y mecanismos de exclusión por afinidad y
tamaño.
La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el
uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas.
Partículas de vidrio
Tierra de diatomeas
TIPOS soporte sólido (fase estacionaria).
Matrices de sílica
Transportadores de
intercambio aniónico
PASOS DE FASE SÓLIDA
lisis celular, adsorción de ácidos
nucleicos, lavado y elución.
Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas
facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.
La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre
debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de
cromatografía de adsorción.
Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice
y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido
nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones
de sales caotrópicas.
TIERRA DE DIATOMEAS
(DIATOMITA)
Es una roca sedimentaria silícea formada
por micro-fósiles de diatomeas, algas
marinas unicelulares que secretan un
esqueleto silíceo llamado frústula.
PROPIEDADES
• Baja densidad.
• Alta porosidad.
• Dureza .
• Capacidad abrasiva suave.
• Conductividad térmica
muy baja.
• Alta resistencia a la
temperatura.
• Capacidad muy alta para
absorber líquidos.
Filtro-ayuda
PRINCIPALES Porosidad y Poder
USOS Absorbente
Purificación de
ADN
DIATOMITA
La diatomita puede ser utilizado
para la retirada del DNA en
presencia del agente
caotrópico altamente concentrado
tal como el ioduro de sodio,
guanidinium hydrochloride y
guanidinium thiocyanate.
DIATOMITA La diatomita tiene
contenido de sílice
hasta en un 94%. Ha
sido usado para
filtración y en
Quitan el DNA trenzada doble cromatografías.
pero no el ARN o las proteínas.
La diatomita resultante enlazada con el ADN es
luego lavado con un tampón que contiene alcohol.
Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un
tampón bajo en sal o en agua destilada.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDO
NUCLEICO BASADO EN
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS
La separación magnética es una
manera simple y eficiente el cual
es utilizado actualmente en la
purificación de ácido nucleicos.
Se utilizan Preparados A partir de
transportadores biopolímeros.
magnéticos.
Materiales con ✓ Polímeros
una gran área sintético
superficial , son ✓ Vidrio poroso
preferidos para ✓ Basado en
ser usados en la materiales
adherencia de magnéticos
ácidos inorgánicos
nucleicos.
ÓXIDO DE HIERRO
Óxido de hierro (II, III) u
óxido ferroso férrico
(Fe3O4).
Los momentos
magnéticos de los
distintos cationes de
hierro del sistema se
Magnetita encuentran fuertemente
acoplados.
Esta moléculas van
actuar como un
imán.
Purificación de ácido nucleico basado en
partículas magnéticas
Purificación de
ácidos nucleicos
Uso de perlas magnéticas en base
implica cuya superficie tiene a:microesferas
una carga que se puede
cambiar basándose en el pH
magnéticas .
o tampón. A pH bajo, están
cargados positivamente,
atrayendo a las moléculas de El ácido nucleico
ADN con carga negativa y es luego eluído de
permitiendo que las
las partículas
proteínas y los
contaminantes que se magnéticas con un
elimina mediante lavado. tampón de elución.
MATERIAL DE INTERCAMBIO
ANIONÍCO
El ejemplo mas popular que se utiliza en el
principio del intercambio iónico es « Resina
de intercambio iónico».
Se basa
En la interacción entre grupos cargados
positivamente de la celulosa de
dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y
fosfatos cargados negativamente del ADN .
Una resina de intercambio iónico puede
considerarse como una estructura de
cadenas hidrocarbonadas.
Estas cadenas se encuentran unidas
transversalmente formando una matriz
tridimensional que proporciona rigidez a la
resina y entrecruzamiento que determina la
estructura porosa interna de la misma.
AUTOMATIZACIÓN
❖Reduce tiempo
❖Disminuye costos ?????
❖Disminuye riesgo laboral
❖Aumenta calidad y reproducibilidad
❖Minimiza contaminación
