CUANTIFICACION DE PROTEINAS EN EL SUERO SANGUINEO

AUTORES
Cruz Sara (217140070)1, Meneses Daniel (21740)2, Revelo Olvery (218140)3
Laboratorio Bioquímica I, Universidad de Nariño, facultad de ciencias exactas y naturales
Departamento de química, Marzo… de 2022

Introducción

El suero sanguíneo contiene una gran variedad de cuantificación de los grupos fenólicos, que
proteínas que suelen agruparse en cinco tipos permiten valorar el aminoácido tirosina, único
clásicos: albuminas y globulinas α 1 , α 2 , β y γ . aminoácido fenólico de las proteínas; el método de
Existen proteínas importantes que se encuentran Bradford, que cuantifica los aminoácidos básicos y
en células sanguíneas debido a su naturaleza aromáticos; el método de biuret, basado en la
enzimática, éstas son de gran interés en el campo reacción coloreada característica del enlace
clínico. Cabe aclarar /que no todas las proteínas peptídico; y el método del ácido bicinconínico,
sanguíneas están en el suero por ejemplo el basado en la propiedad de las proteínas de reducir
fibrinógeno, responsable directo del proceso de la el ion cúprico a cuproso, que es un método mucho
coagulación, están presentes en el plasma, pero no más sensible y fiable que los anteriores [2].
en el suero.
Como se mencionó anteriormente existen varios
Las albuminas tienen importantes funciones como: métodos para la cuantificación de proteínas, pero
el transporte de ácidos grasos, bilirrubina, calcio y la mayoría tiene como principio alguna reacción
aldosterona; regulación de la presión osmótica química de los grupos alquilo o arilo de los
plasmática frente a los líquidos intersticiales; etc. diferentes aminoácidos; el método a utilizar en esta
Por otra parte las globulinas juegan un papel práctica es el de Biuret, la cual es la técnica más
importante en la protección del cuerpo ante simple para la determinación de proteínas solubles.
agentes patógenos. En la fracción proteica que Las sustancias que contienen dos o más enlaces
llamamos γ -globulinas se encuentran la mayoría de peptídicos forman un complejo purpura-violeta con
los anticuerpos o inmunoglobulinas; entre la sales de cobre (II) alcalinas (Rx1).
fracción β y α se encuentra la ceruloplasmina
(transporta cobre) la transferrina (transporta hierro), Es posible que el color se desarrolle por la
las haptoglobinas, etc[1]. formación de un ion coordinado, tetracuprico, con
dos grupos adyacentes. La intensidad del color del
Los métodos directos para la determinación de la complejo se puede determinar
concentración de las proteínas séricas se basan en espectroscópicamente a 540 nm. Existen pocas
algunas características propias de las estructuras interferencias en esta determinación, entre ellas la
proteicas, como la capacidad de reducir presencia del ion amonio puede alterar el
determinados iones, propiedades del enlace desarrollo del color, algunos pigmentos absorben a
peptídico o el contenido de algún aminoácido en la misma longitud de onda, algunos lípidos y
partículas, a partir de estos datos se puede deducir carbohidratos son capaces de formar complejos
la cantidad total de proteínas presentes en con el ion coordinado[3].
determinada muestra.

Entre las técnicas diseñadas para este fin se

encuentran: el método de lowry, basado en la

[Rx. 1]

Resultados y Análisis
Para el desarrollo de este método se inició con la preparación de las muestras a analizar, primero se hizo la
separación de globulinas del suero, el objetivo principal es remover una cantidad importante de remanentes
que pueden ser ácidos nucleicos, toxinas y otros compuestos, existen varias estrategias para precipitar las
proteínas, como el cambio de pH, el incremento en la temperatura, la adición de solventes, las moléculas
cargadas, etc., pero, el método que se empleo es la precipitación por salado con (NH 4)2SO4. El factor a tener
en cuenta en esta etapa es la solubilidad. La solubilidad de una proteína en solución acuosa es sensible a las
concentraciones de sales disueltas, a fuerzas iónicas elevadas se reduce la solubilidad de las proteínas. Este
efecto conocido como salting out (reducción de la solubilidad por sales) es resultado de la competencia por las
moléculas de solvatación entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos, a concentraciones
salinas elevadas están solvatados tantos iones agregados que el grueso del solvente disponible se torna
insuficiente para disolver otros solutos. El sulfato de amonio es el reactivo más utilizado para el salting out de
las proteínas ya que su solubilidad elevada permite obtener soluciones de gran fuerza iónica, además esta
clase iones estabilizan las estructuras nativas de las proteínas de manera que no sufrirán desnaturalización[4].

La etapa siguiente fue la centrifugación, la cual es un método que permite separar sólidos de líquidos, o
líquidos de líquidos de diferentes densidades mediante la utilización de una centrifuga de laboratorio. La
centrifuga obliga a una mezcla a experimentar un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad
que la fuerza gravitacional, provocando la sedimentación de las partículas de mayor densidad [5], en este caso
la centrifugación se usa para recoger la proteína que fue precipitada por la adición de sulfato de amonio.

Seguidamente se desechó el líquido sobrenadante y el precipitado obtenido se disolvió con la adición de

solución de NaCl al 0.85%, el efecto provocado por la solución de NaCl se denomina salting in (incremento de
la solubilidad por sales), a medida que se incrementa la concentración salina de la solución proteica, los
contraiones adicionales recubren con mayor eficacia las numerosas cargas iónicas de la molécula proteica,
con lo que se incrementa la solubilidad de la proteína[6].

Para preparar la solución de proteínas totales se añadió solución salina (NaCl al 0.85%) a 1 mL de suero
sanguíneo, esto con el fin de mantener a las proteínas disueltas.

Posteriormente se midió la absorbancia de las soluciones anteriormente preparadas, para esto se tomaron 4
tubos de ensayo y se añadieron las cantidades descritas en la tabla 1.

Después de adicionar el reactivo de biuret se seleccionó en el fotocolorímetro la longitud de onda de 540 nm y

se llenó la celda con la solución blanco con la cual se ajusta el equipo en absorbancia cero. Se midieron las
absorbancias para los tubos que contienen las muestras y se registraron los resultados en la tabla 1.

Tabla 1.

Tubo No. Rótulo Solución Solución Solución Solución Solución Abs Concentración
de NaCl patrón de de de suero de Biuret g/dL
0.85% Albúmina globulinas

1 Blanco 1.0 ml 4.0 ml 0.000

2 Patrón 1.0 ml 4.0 ml 0.248 0.090

3 Globulinas 1.0 ml 4.0 ml 0.213

4 Prot.Total. 1.0 ml 4.0  ml 0.252

La cuantificación de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio establecido por la
ley de Beer. Cabe resaltar que un ámbito adecuado para la determinación de la masa de proteínas por este
método oscila entre 20 y 40 mg de proteína.

En este paso se marcaron 7 tubos de ensayo como se indica en la tabla y se adicionaron a cada uno de ellos
las soluciones indicadas en la tabla 2. Después de adicionar el reactivo de Biuret, se seleccionó en el
fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia (540 nm) y se ajustó a cero con el blanco, los
resultados se anotaron en la tabla 2.

Tabla 2.

Tubo Solución Solución Solución Concentración Abs

patrón NaCl de Biuret
(g/dL)
Albúmina 0.09%

Blanco   2.0 ml 4ml 0.000 0.000

1 0.3 ml 1.7 ml 4ml 0.023 0.064

2 0.5 ml 1.5 ml 4ml 0.038 0.098

3 0.7 ml 1.3 ml 4ml 0.053 0.151

4 1.0 ml 1.0 ml 4ml 0.075 0.199

5 1.2 ml 0.8 ml 4ml 0.090 0.224

6 1.5 ml 0.5 ml 4ml 0.113 0.255

Para realizar la gráfica de la curva de calibración se calcularon los datos de concentración de la solución
patrón de albumina utilizando la ecuación C 1 V 1=C 2 V 2

5 mL X 0,090 g/dL
Concentración final de proteínas de la solución patrón: C patron= =0,45 g/dL
1 mL

Para el tubo 1 g
0,45 x 0,3 mL
dL
=0,023 g /dL Curva de Calibració n de Albú mina
6 mL
0.300

Se realizó el mismo cálculo para los 5 tubos 0.250 f(x) = 2.31692406692407 x + 0.0118236808236809
R² = 0.981311825913971
restante 0.200
Absorbancia

0.150
Con los datos obtenidos de concentración y
0.100
absorbancia registrados en la tabla 2 se
0.050
realizó la curva de calibración (grafica 1)
0.000
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120
Como se observa la curva patrón arroja un
Concentracion de sln de albú mina (g/dL)
buen R2 por lo que se puede asegurar que la
recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente a la ley de Beer, lo que permite
determinar la concentración de las soluciones problema a través de una regresión lineal, teniendo en cuenta
que la recta de calibrado se encuentra definida por

Absorbancia=mC +b

Ecuación de la recta Absorbancia=2,3169 C+0,0118

Absorbancia−0,0118
C=
2,3169
0,213−0,0118 0,252−0,0118
Entonces C globulina= =0,087 g/dL y C prot= =0,104 g/dL
2,3169 2,3169
Las concentraciones originales de globulinas y proteínas totales se calcularon a partir de las siguientes
ecuaciones

C i globulinas=C glob x 5 x 5 [Ec.1]

C i proteinastotales=C prot x 20 x 5 [Ec.2]

g g g g
Por tanto C i globulinas=0,087 x 5 x 5=2,18 y C i proteinastotales=0,104 x 20 x 5=10,4
dL dL dL gL

La concentración de Albumina se calculó como la diferencia entre C i globulinas y C i proteinastotales

C i Albumina=C i proteinas totales−C i globulinas [Ec.3]

g g g
C i Albumina=2,18 −10,4 =8,2
dL dL dL
Otra metodología para la determinación de la concentración de proteínas séricas en el suero sanguíneo es la
medición directa donde se utilizan solo los datos registrados en la tabla 1. Estas concentraciones se
calcularon a partir de la siguiente ecuación:

A desc A pat
=
C desc C pat

Donde A pat y C pat son los valores de absorbancia y concentración de la solución patrón respectivamente, Adesc
y C desc corresponde a globulinas o proteínas totales según sea el caso

g g
0,213 x 0,090 0,252 x 0,090
Por lo tanto dL g y dL g
C glob = =0,077 C prot= =0,091
0,248 dL 0,248 dL
Las concentraciones originales de globulina y proteínas totales se calcularon con las ecuaciones 1 y 2
obteniendo un resultado de 1,93 g/dL y 9,1 g/dL respectivamente. La concentración de albumina fue calculada
con la Ec.3 obteniendo un valor de 7,17 g/dL.

Tabla 3.

Concentración proteínas del suero sanguíneo

 Concentración obtenidas 10,4 9,1 2,18 1,93 8,2 7,17
(%p/v)

g/dL 10,4 9,1 2,18 1,93 8,2 7,17

mg/mL 104 91 21,8 19,3 82 71,7

g/L 104 91 21,8 19,3 82 71,7

g/mL 0,104 0,091 0,0218 0,0193 0,082 0,0717

Concentración fisiológica 6,3 – 8,0 1,5 – 3,5 3,5 – 5,5

normal[7] (g/dL)

Como se observa los resultados de proteínas totales están por encima de los valores normales (tabla 3) en
ambos métodos, mientras que los resultados de la concentración de globulina se encuentran dentro de los
rangos normales y específicamente en el método de la curva de calibración, esto permite concluir en cierta
medida que este método arroja resultados más confiables, lo cual se explica ya que el método de calibración
racionaliza los resultados con base a una serie de patrones a diferentes concentraciones lo que permite
establecer una relación más veraz entre la concentración y la absorbancia, de tal forma que permite
establecer parámetros analíticos como rango de linealidad y límite de cuantificación y detección [8]. Mientras
que el método de calibración directa utiliza un único dato de referencia que no permite conocer con seguridad
los rangos de trabajo.

En torno al análisis de la cantidad de proteínas presentes en el suero sanguíneo se observa un nivel elevado
de proteínas totales, esto como consecuencia de los altos niveles de albumina como se observa en la Ec.3

Los niveles elevados de albumina en la sangre no suelen tener una significación clínica y por tanto no suelen
ser preocupantes. Normalmente se debe a deshidratación por pérdida de agua debido al calor o al ejercicio.
También se observa que existe una ingesta limitada de líquidos o el consumo muy alto de proteínas en a
dieta[9].

Bibliografía

[1] José M. Macarulla, Félix M. Goñi. Bioquímica humana. Curso básico Volumen 5. Reverte, 1994.

[2] Angel G. Hernández. Tratado de nutricion / Nutrition Treatise: Composicion Y Calidad Nutritiva De Los
Alimentos volumen 2. Ed. Médica Panamericana, 2010.

[3] N. Bolaños V. Giselle Lutz C. Carlos H. Herrera. Química de Alimentos: Manual de laboratorio. Editorial
Universidad de Costa Rica, 2003.

[4] D. Voet, Judith G. Voet. Bioquímica. Ed. Médica Panamericana, 2006.

[5] José M. Teijón. Fundamentos de bioquímica estructural. Editorial Tebar, 2006.

[6] Manuel Ruiz A. Bioquimica Estructural: Conceptosfundamentales y 383 Tests. Editorial Tebar, 1992.

[7] William T. Blows. Base biológica de las observaciones clínicas. Manual Moderno.

[8] Carlos M. Fernández. Quimiometría, Volumen 82. Universitat de València, 2005.

[9] Alvaro G. Hernandez. Principios de Bioquímica Clínica Y Patología Molecular. Elsevier Health Sciences,
2019.