Trabajo práctico 3
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
Asignatura: Técnicas Analíticas Instrumentales
Alumna: Giudici, Abril
Profesores: Caballero, Gerardo y Martínez, Carolina.
Para la realización de esta actividad acerca del uso y análisis de datos del HPLC se parte
del siguiente procedimiento de laboratorio:
Procedimiento
Usted se encuentra en el laboratorio, el cual posee:
- Equipo HPLC Gilson 321/322 de inyección automática acoplado a detector Gilson
- Columna LichroCART ® Purospher STAR RP-18 endcapped (5 µm), pH: 1,5 – 10,5
- Solventes grado HPLC: Metanol y Agua desionizada y filtrada.
La columna a utilizar, RP-18, corresponde a n-octadecilo (C18) como material de la fase
estacionaria. La cromatografía realizada es una cromatografía de fase reversa, técnica en la
cual se produce la retención por interacciones hidrofóbicas entre la cadena hidrocarbonada
de la fase estacionaria con sectores no polares de las moléculas del analito.
Una buena retención del analito requiere que el mismo posea ciertas características como:
Poca solubilidad en agua, de esta manera al correr el solvente el analito seguirá
interaccionando con la fase estacionaria.
Cadena carbonada, gracias a esta se genera la interacción hidrofóbica con el C18.
Poca ramificación, con este tipo de estructuras la retención es mayor.
Mayor saturación, otorga mayor retención.
Con estas premisas se analiza la estructura de las moléculas que se busca separar.
Imagen 1. Estructura de Uracilo Imagen 2. Estructura de Uridina
Uracilo: base nitrogenada, pirimídica, capaz de realizar 4 puentes de hidrógeno, dos aceptores y dos
dadores. Es soluble en agua y parcialmente soluble en alcoholes.
Uridina: Molécula compuesta por la base nitrogenada uracilo y un azúcar ribosa. Es capaz de realizar
6 puentes de hidrógeno, dos aceptores y cuatro dadores, por lo que constituye una molécula polar, es
por esto soluble en agua y metanol.
Estas dos moléculas son similares en polaridad relativa, lo que las distingue sería su peso
molecular y la interacción que estas generan con la fase estacionaria hidrocarbonada.
1. Análisis de gráficos:
Gráfico 1. Cromatograma de elución de Uridina (1 mM) y Uracilo (1 mM) separados con fase móvil 95:5
Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min.
Gráfico 2. Cromatograma de elución de Uridina (1 mM) y Uracilo (1 mM) separados con fase móvil 85:15
Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min.
i. Efecto de la polaridad de la fase móvil sobre corridas a y b.
El gráfico 1 muestra, según la respuesta del detector de mVoltios en función del tiempo de
retención, la elución de una muestra de Uridina y otra de Uracilo con un solvente 95:5 de
agua y metanol el cual se agregó de a 0,7ml por minuto a la columna.
Según la escala de tiempo se observa que el primer compuesto eluido es el uracilo y el
segundo la uridina, esto puede ser explicado debido a la cadena carbonada de cada
molécula, al ser la uridina una molécula de mayor peso molecular esta posee más cantidad
de carbonos en su estructura siendo más intensas sus interacciones hidrofóbica con el C18
de la fase estacionaria.
Es de esperar que aquella molécula más solvente en agua, como lo es la uridina por su
mayor posibilidad de puentes de hidrógeno con el agua y metanol, eluya primero, pero esto
ocurriría al comparar estructuras con igual proporción de interacción hidrofóbica, es decir,
serían comparables al haber una sola variante en las moléculas, la fuerza de unión con la
fase estacionaria, lo cual no es el caso.
El gráfico 2 muestra la misma técnica anterior con la variación de relación agua:metanol en
la mezcla de la fase móvil, trabajando con un 85% de agua y 15% de metanol.
En este caso los compuestos son retenidos por más tiempo en la columna y con diferencia
de tiempos de retención de cada compuesto es menor, es decir, tienen tiempos de retención
y elución similares. Por lo que al aumentar la proporción de metanol, solvente más orgánico
y menos polar que el agua, se pierde un poco la adsorción superficial de agua por los poros
de la sílica modificada provocando que nuestros analitos se vean más propensos a quedar
retenidos. Es por ello que al aumentarse el tiempo de retención los picos son más anchos
que en la corrida a y b.
ii. Efecto de la concentración de la muestra sobre corridas b y c.
Lo que se logra distinguir al comparar las corridas de menor y mayor concentración es que
al utilizar mayor concentración de muestra en el cromatograma se observan picos de mayor
intensidad, relacionados a la mayor cantidad de moléculas en cada elución. A mayor
concentración el detector recibe mayor señal siendo más intensa la respuesta en el sistema,
esto resulta en los picos más intensos. Sin embargo, la concentración de la muestra no
afecta al tiempo de retención del analito por lo que no se ve afectado este factor.
Gráfico 3. Cromatogramas de elución de mezclas de Uridina (0,5 mM) y Uracilo (0,5 mM) separados con
fase móvil 85:15 Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min y 0,5ml/min.
iii. Efecto del flujo de la fase móvil sobre corridas c y d.
Se puede observar en el gráfico 3, como el flujo (cantidad por tiempo) de la fase móvil al
correr por la columna afecta al tiempo de elución de los componentes de la mezcla, siendo
el doble de tiempo de retención para la mitad de caudal. En la primera corrida, se trabaja
con un flujo de 1ml/mín y los componentes salen aproximadamente a los 3 minutos, siendo
que en la corrida con 0,5 mil/mín de flujo el tiempo de eluciòn se extiende hasta los 6
minutos. Por lo que a mayor flujo de fase móvil, menor es el tiempo de retención de los
compuestos. Al disminuir los tiempos de retención la separación de los picos se acorta,
superponiendose y perdiéndose resolución. Se determina que a menor caudal, se obtiene
mejor resolución de los picos incluso si esto supone un ensanchamiento de los mismos, es
primordial que se encuentren separados.
2. ¿Cree que podría optimizar aún más la resolución de los sistemas descriptos? Detalle.
Para optimizar la resolución de los sistemas se busca obtener los picos mas definidos, al
obtener bien separados cada compuesto y el tiempo de retención el justo para no
ensancharlos.
Para las primeras corridas, que se trabajó con cada compuesto de manera independiente,
se observa que la composición 95% agua y 5% metanol devuelve una buena resolución,
compuestos separados y picos de poco ensanchamiento.
Al utilizarse una mezcla de fase móvil con mayor porcentaje de solvente orgánico podemos
notar cómo, al no ser analitos que generen una interacción muy estable con la sílica
modificada, eluyen con tiempos similares. De esta manera es importante que componente
principal sea el agua (solvente muy polar y que solvata el relleno) y que haya solo una
pequeña porción de metanol que influya de forma suave en la interacción del Uracilo y
Uridina con la fase estacionaria logrando acortar los tiempos de eluciòn. O mismo realizar
una eluciòn por gradiente, bajando de a poco la polaridad de la fase móvil podría resolver el
encontrar un punto justo de mejor resolución. Incluso al trabajar con un 100% de agua
podría obtenerse un mejor resultado.
Otra manera de mejorar la resolución sería achicando el tamaño de la partícula de relleno, a
no más de 2um que establece el límite para la técnica de HPLC. De esta manera se podría
conseguir un flujo más uniforme incrementando el número de platos teóricos, afinando los
picos y obteniendo una mayor resolución. Al trabajar con una sílica porosa, al achicar su
diámetro, se optimiza la separación de los compuestos al mantener la separación de
manera superficial al solvatar mejor los poros, aumentando así la cinética de eluciòn
afinando los picos.
Luego, para optimizar la resoluciòn de las mezclas podrìa trabajarse con el porcentaje de
fase móvil inicial, 95% agua y 5% metanol, obteniendo mejor separaciòn de los picos
aunque se aumente el tiempo de eluciòn que podrìa ensancharlos. Asimismo, la separación
de mezclas podría estar acompañada de una columna de mayor longitud y un flujo
constante, de modo que se aumente el tiempo necesario para una separación correcta de
los compuestos.
3. ¿Cuál es el principio de las columnas de afinidad?
Se trata de una técnica de purificación de alta resolución y especificidad.
La cromatografía de afinidad se basa en la afinidad de un analito a un ligando específico. Se
agrega un ligando, ya sea un sustrato o un receptor, como los anticuerpos, en casos más
puntuales, a la matriz en la fase estacionaria. De este modo se logra retener tan solo
aquella molécula específica que interactúe con el ligando o receptor por interacción
selectiva. Para luego, eluirla al correr un solvente que compita por esa misma interacción
específica.
Como ocurre en las diferentes cromatografías aquellas moléculas que no generan una
interacción con la matriz avanzan más rápidamente por la columna siendo las primeras en
eluir, de esta forma se purifica al compuesto de interés de distintos componentes que podría
presentar la muestra.
