UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN
Departamento De Producción Animal Ciencias Agropecuarias
EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE CÉLULAS SANGUÍNEAS POR EL MÉTODO
SALTING OUT
1. INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos, son unas de las macromoléculas más importantes que constituyen a
todo ser vivo, en ellos se encuentran la información necesaria e indispensable para el
desarrollo de los organismos y las funciones que estos cumplen en su medio. Por eso, es
importante estudiar sobre estos empleando y profundizando en algunas técnicas
moleculares que ayudan al conocimiento y estudio de dichos polímeros. En nuestro caso,
nos interesamos por el DNA, que será extraído por el método de salting out, el cual, sigue
un protocolo en el que se presenta ruptura celular, eliminación de proteínas,
concentración de DNA, lavado y resuspensión. Todo esto con el objetivo de obtener un
DNA puro e íntegro, para que así se pueda llevar a cabo procedimientos posteriores con
éste.
2. DESCRIPCION DEL Una vez extraída de la centrifuga, se
LABORATORIO procede a descartar el sobrenadante con
un movimiento preciso, para no descartar
Realizamos la extracción de DNA el botón de DNA, posteriormente se le
mediante el método de SaltingOut, agrega 8 ml de lisis I, se hace agitación
método el cual tiene como ventajas ser por inversión y se procede a la centrifuga
de tipo inorgánico, baja toxicidad en sus por 10 minutos mas a 3100 RPM.
reactivos y fácil visualización de la malla Terminado el tiempo se descarta el
o madeja de DNA. sobrenadante dejante en el fondo del
tubo el botón.
3. PROCEDIMIENTO
3.1 Fase de buffer de Lisis I: En esta
fase se realiza el lisis de glóbulos
rojos
Tomamos una muestra de sangre con
EDTA de 2.5 ml , al cual le añadimos
posteriormente buffer de lisis I en una
cantidad de 5.5 ml, se agito por inversión
y después fue llevada a centrifuga por 10
minutos a 3100 RPM.
Figura 1. Fase buffer de lisis I
3.2. Fase de buffer de Lisis II: En esta
fase se realiza el lisis de glóbulos
blancos
Al botón en el tubo se le agregan 5ml de
Buffer de Lisis II, seguidamente se le
adicionan 300µl de SDS (Dodecil
sulfato de sodio), se le adicionan
también 12,4 µl de Proteinasa k,
posteriormente se le realiza vortex suave
durante un minuto, después de realizar el
vortex se debe incubar la muestra 12 Figura 3. Fase de extracción
horas, a baño maria a 62°.
3.4 Fase de Precipitación: En esta
3.2 Fase de Extracción: En esta fase fase se lavan el exceso de sales.
se despolarizan las proteínas.
A la muestra contenida en el tubo nuevo,
Con una muestra ya refrigerada, se le adicionan 4 ml de etanol a -20° con
procedemos a continuar con el proceso una concentración del 100%, se realiza
de extracción, a la muestra se le agitación por inversión para la observar
adicionan 2 ml de NaCl (Clorato de sodio la madeja, y se procede a la centrifuga a
saturado) y se agita. Luego se lleva a la 3100 RPM durante 10 minutos.
centrifuga por 10 minutos a 3100 RPM;
terminado el tiempo se extrae la muestra Posteriormente, se descarta el etanol, y
y se descarta el sobrenadante. El se le adicionan 2 ml de etanol con una
restante de la muestra se trasfiere a un concentración del 70%, se realiza vortex
nuevo tubo de 15 ml. suave a la muestra para resuspender la
madeja, y luego se lleva a la centrifuga a
3100 RPM durante 10 minutos.
Se extrae la muestra de la centrifuga, se
descarta el sobrenadante y se dejan
secar los tubos durante 20 minutos.
Después de trascurridos los 20 minutos,
se le adiciona 1 ml buffer TE (disolvente),
Y se chequeo en el gel de agarosa.
3.5 Preparación del gel de agarosa
Figura 2. Fase de extracción
Se tomo un molde de 100ml de
capacidad y un peine 26, y se llevo a la
cama de extracción.
En un probeta se le adicionan 50 ml de
TBE 1X(regulador de pH), y se le
adicionan 0.4 gr de agarosa. Se agita la
mezcla y se calienta durante un minuto 4. RESULTADOS
para homogenizar la mezcla.
En la imagen que arrojó el
Después de homogenizada, se deja fotodocumentador, de las dos muestras
enfriar para posteriormente agregarle 5 que depositamos en la electroforesis,
µl de Bromuro de Etidio, se homogeniza vemos una línea levemente brillante, lo
suavemente para evitar la formación de que indica la presencia de DNA. No se
burbujas, y se transfiere a el molde, una ve del todo degradado a lo largo del gel,
vez hecho esto se introduce el peine y se lo cual indica que durante todo el
deja solidificar. procedimiento se extrajo la mayoría de
moléculas que no son de nuestro interés
como lo son las proteínas y en nuestra
muestra quedó un buen porcentaje de
DNA puro. Si la muestra de DNA puro
hubiese sido satisfactoria, se vería dicha
línea muy brillante, en nuestro caso tal
vez no fue así, lo cual pudo ser por algún
error en el procedimiento a la hora de
agregar reactivos.
5. CONCLUSIONES
La extracción por el método salting out
resulta efectiva a la hora de obtener
amplicones para su posterior uso en
Figura 4. Preparación gel de agarosa PCR ya que permite obtener buena
cantidad de DNA. Para la extracción de
material genético a partir de sangre
periférica de bovino, resulta también
práctico éste método aunque de cuidado
3.6 Electroforesis por el uso de agentes cancerígenos
como el bromuro de etidio. Es importante
En un papel PARAFILM se agregaron 2 seguir con cuidado cada paso del
ml de buffer de carga y se añaden sobre procedimiento, ya que en una sóla
5 µl del amplicon. Luego se mezcla muestra de sangre, se encuentran varios
mediante pipeteo el buffer y el amplicon, componentes que deben ser apartados
hasta homogenizarlos, y posteriormente con cuidado, ya sea por medios físicos o
se cargan en los pozos del gel de químicos, sin que se afecte el material
agarosa ya solidificado. genético.
Se pone a correr a 75 voltios durante 15
minutos, luego se retira el gel y se lleva a
observar al fotodocumentador PREGUNTAS
(BIOMETRA), se observa el gel y se
1. ¿Es necesario usar EDTA como
detecta la presencia del amplicon.
anticoagulante para la
extracción? ¿Que otros
anticoagulantes existen y cuál es
su función?
Los anticoagulantes son sustancias el objeto de no contaminar la
que previenen la formación de muestra, lo que alteraría la
coágulos. Existen diferentes tipos determinación de trazas en
de ellos en polvo o líquidos. Deben espectroscopia de masas de la
seleccionarse siempre el disolución resultante.
anticoagulante apropiado según el Se usa también comúnmente en
caso. algunas formulaciones para
Los anticoagulantes más comunes polimerización de emulsiones. [2]
son:
-EDTA: (ETILEN-DIAMINO-TETRA-
ACETATO) Este tipo de
anticoagulante es utilizado
principalmente cuando se realizan
estudios en donde se cuentan
células. 3. ¿Cómo puedo obtener una lisis
celular?
-CITRATO DE SODIO:
Generalmente en concentraciones La lisis celular es el proceso de ruptura
al 3.8 % y ser utiliza comúnmente de la membrana celular que produce la
en estudios de coagulación. salida del material intracelular
-HEPARINA: Se utiliza tanto en Los ácidos nucleicos se encuentran
algunos estudios de rutina como dentro de la célula y para separarlos de
especializados. Su presentación ésta es necesario recurrir a
puede incluir heparina con procedimientos de lisis celular, que
concentraciones de sodio o litio. En pueden ser mecánicos, químicos o
general, la heparina con tilio es enzimáticos. Los procedimientos de lisis
utilizada para estudios de química y son diferentes según el tipo de célula de
la heparina sódica se utiliza para la cual queramos obtener los ácidos
estudios de linfocitos. nucleicos y el método de obtención que
queramos usar. A continuación veremos
-OXALATOS: Son anticoagulantes las lisis más comunes:
menos comunes, utilizados Moler con mortero en nitrógeno líquido:
ocasionalmente en las para lisar células de tejidos animales
determinaciones de glucosa. duros (hueso) y blandos (bazo), tejidos
vegetales y hongos. Este método
Debido a esto el EDTA es el más además mantiene la muestra a bajas
apropiado para la extracción de ADN. [1] temperaturas, por lo que se evita que las
nucleasas endógenas degraden el
material de interés.
Homogeneizar en Dounce o Polytron: se
2. El buffer de lisis I contiene entre trata de un instrumento generalmente de
otras cosas Tritón X. ¿Qué es y vidrio que consta de dos piezas, un tubo
cuál es su importancia? de vidrio donde se introduce la muestra y
Es un compuesto químico que tiene una varilla que puede acabar en
muchas aplicaciones en diversas cuchillas (pistón). Ésta se introduce en el
disciplinas. Se usa frecuentemente tubo y se hace girar a la vez que se mete
como un auxiliar de disolución y se saca, sirve para lisar células de
para proteínas integrales en medios tejidos animales duros o blandos, tejidos
acuosos; no obstante debe usarse a vegetales, hongos y bacterias.
la concentración mínima posible con
Molino criogénico: se introduce la Para los ácidos nucleicos se usa el azul
muestra en un molino y se baña con de metileno o, más frecuentemente,
nitrógeno líquido, al pulverizar se obtiene compuestos fluorescentes e
un polvo muy fino. Se usa para lisar intercalantes, como el bromuro de etidio
células de tejidos muy duros. Este
método además mantiene la muestra a
bajas temperaturas, con lo cual se evita
la acción de nucleasas endógenas que -el bromuro de etidio, para los ácidos
pudieran degradar el material de interés. nucleicos, esta sustancia se intercala
Molino de perlas: se usa para lisar entre las bases del DNA y es
células de tejidos semiduros o duros y fluorescente cuando se ilumina con luz
células de la levadura. [3] ultravioleta. Tras la electroforesis, se
visualiza el gel con una lámpara de luz
UV, y se verán las bandas
4. ¿Por qué es posible ver DNA en correspondientes a las muestras de NA
electroforesis? Diga dos agentes aplicado y los marcadores de peso
químicos que permitan molecular.
visualizarlo.
Electroforesis se usa para describir la
migración de una partícula cargada bajo 5. Importancia de la proteinasa K
la influencia de un campo eléctrico. La proteinasa K se usa porque degrada e
Muchas moléculas importantes inactiva proteínas, lo cual es muy
biológicamente (aminoácidos, péptidos, favorable a la hora de hacer la
proteínas, nucleótidos, ácidos purificación del ADN ya que inactiva
nucleídos…) poseen grupos ionizables y enzimas de restricción que degradan el
existen en solución como especies ADN, y ayuda a romper las membranas
cargadas, bien como cationes, o bien celulares
como aniones. Estas especies cargadas se agrega al buffer de lisis que además
se van a separar en función de su carga tiene SDS, EDTA y buffer, que es la
cuando se aplica un voltaje a través de etapa inicial y al final de la extracción se
los electrodos. Y en el caso de la hace la electroforesis para ver la
electroforesis en gel de agarosa, los cantidad y la calidad del ADN.
geles se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y
forma. Así, moléculas de DNA de 6. Investigue todo lo posible sobre
diferente tamaño, va a emigrar de forma los reactivos EZvision y bromuro
distinta en un gel de electroforesis. [4] de etidio. Cuál es su
composición, para que se
Agentes químicos que permiten utilizan, cuál es su modo de
visualizarlo: Se pueden emplear acción, ventajas y desventajas de
sustancias coloreadas o fluorescentes cada uno y cuál es la
que se unan a las proteínas o los ácidos problemática ambiental que
nucleicos. presenta el bromuro.
Suelen ser colorantes orgánicos que
interaccionan con las proteínas de forma EZ VISION Tinciones para proteínas
poco selectiva, principalmente Protein EZ-Vision® son un reactivo
electrostática. fluorescente e inocuo que produce al
Ejemplos: azul brillante de Coomassie, instante una visualización de bandas
negro amido, rojo Ponceau. proteicas tras la iluminación UV de geles
SDS-PAGE. Suministrado en un tampón
de carga 4x, las Protein EZ-Vision®
migran junto con el complejo SDS- Bibliografía
proteína durante la electroforesis. La
tinción y la decoloración posteriores se [1] Extracción Dna.
eliminan por completo y se pueden ver http://www.biotecnologico.org/centro/
los resultados inmediatamente después manuales/manual.html. 2014
del runing colocando el gel en un [2] Tritón X.
transiluminador UV convencional. Este http://es.wikipedia.org/wiki/Trit
es el colorante menos peligroso. %C3%B3n_X-100. 2014
Bromuro de etidio; Se trata [3] Reactivos empleados en la
de un compuesto intercalante, es electroforesis del DNA
decir, que tiene afinidad para http://biomodel.uah.es/a
unirse al DNA, pues se introduce n/plasmido/0/comp.htm
entre sus bases apiladas. Esto se
debe a su geometría plana y su [4] Electroforesis de ácidos nucleicos en
estructura aromática, que geles de agarosa. Aislamiento y
interacciona favorablemente con caracterización electroforética de DNA
el interior hidrófobo de la doble plasmídico.
hélice. En menor medida, http://www.uco.es/dptos/bioquimica-
interacciona también con DNA biol
monocatenario. mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS
Su utilidad deriva asimismo de %20ACS%20NUCLEICOS%20GELES
su fluorescencia, exaltada al %20AGAROSA.pdf
encontrarse en un entorno
hidrófobo, es decir, al estar unido [5] Reactivos empleados en la
al DNA. Se excita con luz electroforesis del DNA
ultravioleta de onda corta, 254 http://biomodel.uah.es/a
nm, y emite su fluorescencia n/plasmido/0/comp.htm
como luz visible, de color rosado-
anaranjado.
En la electroforesis, se utiliza para "teñir"
el DNA, para revelar su posición en el
gel. Se puede bañar el gel tras la
electroforesis en una disolución de
bromuro de etidio, o bien incorporar éste
a la disolución de agarosa con la que se
prepara el gel.
El bromuro de etidio es tóxico y
mutagénico (T+; R22, R68); el reactivo
EZ-Vision carece de estas propiedades
(R36/37/38). Todos los colorantes de los
ácidos nucléicos deben manipularse con
precaución. [5]
7. ¿Cuántos gramos de agarosa
necesito para preparar un gel de 120
ml al 3%?
Para un gel de 120 ml al 3% se necesitan
adicionar 3.6 gr de agarosa.
