Electroforesis northern blot
Introducción:
Northern Blotting es una técnica utilizada para el estudio de la expresión génica. Se realiza
mediante la detección de ARN particular (o ARNm aislado). El ARNm generalmente se
representa como el 5% de la secuencia de ARN global. Este método revela la identidad, el
número, la actividad y el tamaño del gen particular. Esta técnica de transferencia también se
puede utilizar para el crecimiento de un tejido u organismo. En diferentes etapas de
diferenciación y morfogénesis, la abundancia de un ARN cambia y esto puede identificarse
utilizando esta técnica. También ayuda en la identificación de condiciones anormales,
enfermas o infectadas a nivel molecular. La técnica de transferencia Northern fue
desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stank en la Universidad de
Stanford. La técnica obtuvo su nombre debido a la similitud del proceso con la
transferencia Southern. La principal diferencia entre estas dos técnicas es que las
transferencias de Northern solo se refieren al ARN.
Principios:
Como toda técnica de transferencia normal, la transferencia norte comienza con la
electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño. La electroforesis separa las
moléculas de ARN en función de la carga de los ácidos nucleicos. La carga en los ácidos
nucleicos es proporcional al tamaño de la secuencia de ácido nucleico. Así, la membrana de
electroforesis separa la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el tamaño de la
secuencia de ARN. En los casos en que d nuestra secuencia diana es un ARNm, la
muestra puede aislarse mediante técnicas cromatográficas de oligo celulosa, ya que el
ARNm se caracteriza por la cola de poli (A). Como las moléculas de gel son de naturaleza
frágil, las secuencias separadas se transfieren a las membranas de nylon. La selección de la
membrana de nylon contribuye al factor de que los ácidos nucleicos están cargados
negativamente en la naturaleza. Una vez que se transfieren las moléculas de ARN, se
inmoviliza por enlace covalente. Luego se agrega la sonda, la sonda puede ser
complementaria y una secuencia de ADN. La formamida se usa generalmente como un
tampón de transferencia ya que reduce la temperatura de recocido.
Técnica:
El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una muestra de
tejido homogeneizado. El ARNm se puede aislar mediante cromatografía para retener
solamente los ARN con colas de poli(A). Las muestras de ARN se separan entonces
mediante electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la dificultad para que las
sondas penetren en la matriz, las muestras de ARN, separadas por tamaño tras la
electroforesis, se transfieren a una membrana de nailon, bien por capilaridad o empleando
un sistema de vacío.
Los sistemas de capilaridad iónica se utilizan pra transferir el ARN desde un gel de
electroforesis a una membrana de northern blot.
Una membrana de nailon cargada positivamente es el soporte más eficaz para realizar la
hibridación en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados
negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El tampón de transferencia
que se usa en el ensayo suele contener formamida, dado que esta reduce la temperatura de
interacción de las muestras, lo que evita la utilización de altas temperaturas que podrían
desnaturalizar las moléculas de ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la
membrana, se inmoviliza mediante enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual
se consigue por medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se
hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la
eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas,
de viscosidad, la presencia de ARN bicatenario, bases desemparejadas y composición de las
mismas. Finalmente, la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de
forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma. Estas
señales pueden cuantificarse mediante densitometría. Para crear controles y poder
asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar
posteriormente la determinación empleando chips de ADN o RT-PCR.
Geles
El RNA puede correr en un gel de agarosa para mostrar las subunidades ribosomales 28s
(banda superior) y 18s (banda inferior).
Las muestras de ARN se separan habitualmente en geles de agarosa que contienen
formaldehído como agente desnaturalizante del ARN. Los geles pueden teñirse con
bromuro de etidio u otro agente intercalante y se visualizan generalmente bajo luz
ultravioleta. También pueden usarse geles de poliacrilamida con urea, aunque esto suele
limitarse a fragmentos de ARN o miARN, ya que poseen un tamaño de poro más pequeño,
por lo que el ARN que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse
además un patrón de ARN con muestras de tamaño conocido para poder estimar el tamaño
de las muestras en estudio.
Sondas
Las sondas para el ensayo northern están compuestas por ácidos nucleicos con una
secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA,
RNA u oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra
secuencia diana. Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a
prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con
cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot.
Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con
quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuales,
tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. El marcaje
por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar
unida a la enzima o bien unida a un ligando ([Link], biotina) para la cual hay un anticuerpo
(avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje. Los
Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes,
siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad
y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.
Aplicación:
El ensayo northern permite observar un patrón particular de expresión genética entre
tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas
por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado
para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en
células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes.
Desde que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una
idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La
variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o
errores en el proceso de transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e
incluso determinar qué región del RNA ha sido delecionada.
Ventajas y desventajas :
El análisis de la expresión génica puede realizarse por diversos métodos, como RT-PCR,
ensayos de protección de RNasa, chips de ADN, análisis seriado de expresión génica así
como el ensayo northern. Los chips de ADN son los más utilizados y son generalmente
consistentes con los datos obtenidos por el ensayo northern. No obstante, en ocasiones éste
es capaz de detectar pequeños cambios en la expresión de genes que los chips de ADN no
pueden identificar.
Ventajas adicionales de usar el ensayo northern incluyen la capacidad de definir el tamaño
de la cadena de ARN, la capacidad de observar los productos del empalme alternativo, la
posibilidad de usar sondas con homología parcial, la habilidad de medir el tamaño y la
calidad del ARN antes de realizar la inmovilización en la membrana y finalmente la opción
de guardar la membrana para ser analizada en repetidas ocasiones en el futuro.2
Un problema común del ensayo northern es la degradación de la muestra por ribonucleasas
(endógenas de la muestra o a través de contaminación ambiental), que puede evitarse con
una apropiada esterilización de los materiales así como el uso de inhibidores de RNasas
como el dietilpirocarbonato.
