BIOQUIMICA 1
SEMINARIO 3: Cuantificación y Purificación de Proteínas
Temario. Métodos de separación y/o concentración de proteínas. Precipitación por solventes orgánicos,
sales, pH. Salting in, salting-out. Importancia del pI. Precipitación por desnaturalización: temperatura,
ácido tricloroacético.
Métodos de separación y/o caracterización basados en el tamaño molecular (masa/forma). Diálisis.
Ultracentrifugación. Cromatografía de exclusión molecular. Electroforesis en geles de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE). Separación en base a la carga (carga/masa). Electroforesis en poliacrilamida.
Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional. Cromatografía de intercambio iónico.
Cromatoenfoque. Otras técnicas cromatográficas: Cromatografía de afinidad, Cromatografía de
interacción hidrofóbica.
Purificación de proteínas. Marcha de la purificación, criterios en la elección de métodos, criterios de
pureza. Esquema experimental, protocolos. Utilización de anticuerpos para detección, purificación y
cuantificación de proteínas
Bibliografía General
“Principios de Bioquímica”, Lehninger, 5da Ed.
“Biochemistry” (Zubay, 4ta Ed.)
“Biochemistry” (Mathews y Van Holde, 2da Ed., 3rd Ed)
“Guide to protein purification: a practical approach” (Deustcher)
“Practical Biochemistry” (Wilson and Walker)
“Cálculos de Bioquímica” – Segel 2ª Ed.
“Physical Biochemistry” - Freifelder 2ª Ed.
“Practical Biochemistry” – Wilson and Walker 4th Ed.
“Instrumentos y técnicas de bioquímica”. T. Cooper
Cuestionario para resolver antes de concurrir a la clase:
1. ¿Cuáles son las características estructurales de las proteínas que permiten su detección y
cuantificación?
2. ¿Cuáles son los métodos más empleados? ¿En qué se fundamentan?
3. Teniendo en cuenta los siguientes métodos de determinación de concentración de proteínas: a)
Lowry, b) Bradford, c) Absorbancia a 280 nm. d) Absorbancia a 205-210 nm.
i) Explique ventajas y desventajas de cada uno de los métodos.
ii) ¿Cuál es el rango de detección de los mismos?
iii) Mencione compuestos biológicos o reactivos comunes en extracción y manipulación de
proteínas, que puedan interferir con cada una de las determinaciones.
iv) ¿Los métodos citados son destructivos o no-destructivos? ¿Por qué?
4. ¿Qué utilidad tiene el conocimiento de los límites de un método de cuantificación de proteínas?
5. ¿Cuál es la dependencia del coeficiente de extinción molar (Ɛ) con la estructura primaria y/o
estructuras superiores de cada proteína? En función de su respuesta ¿es posible determinar un
coeficiente de extinción específico (Ɛ) único para todas las proteínas?
Problemas
Problema 1. A partir de una solución inicial de proteínas (200ml) se han obtenido dos fracciones
diferentes a las que se les determinó la cantidad de proteína por absorbancia a 280 nm. Para realizar
esta determinación, de la fracción I se tomó 1 ml y se llevó a 25 ml totales. De éstos, se tomaron 2,5ml y
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se llevaron a 10 ml. Se tomaron 3 ml y se leyó la absorbancia a 280 nm (A280). Para la fracción II se
tomaron 1,25 ml y se llevaron a 50 ml totales. Se tomaron 3 ml y se leyó A280. Los resultados obtenidos
se detallan en la tabla.
Coeficiente de extinción especifico Ɛ280nm = 1,06 cm2/mg.
Para la determinación de proteínas en la solución inicial usted realizo la medida de absorbancia sobre
una dilución de la misma y el valor que obtuvo fue A280 nm: 0,54.
a- Calcule la cantidad total de proteínas (mg) y la concentración de proteínas (mg/ml) en las
fracciones I y II.
b- .Que dilución de la solución inicial de proteínas se realizó para determinar la absorbancia?
Problema 2. Se tiene una mezcla de cuatro proteínas: ProtA: pI = 5.8, ProtB: pI = 7.0, ProtC: pI = 7.0
ProtD: pI = 6.0 Todas estas proteínas son muy estables a pH cercanos a la neutralidad (5.0 - 8.0).
a. Si se tiene la posibilidad de usar una columna de intercambio iónico para separar las proteínas,
¿Qué tipo de intercambiador elegiría (aniónico o catiónico)? Indique cuál debería ser el pH del
buffer de siembra de la muestra, y con qué buffer haría la elución (pH y/o concentración salina).
c. ¿Qué resultado espera obtener? ¿Se llega a una separación completa? Si no es así, indique qué
otros pasos seguiría para conseguirlo.
d. Una vez separadas ¿qué técnica/s emplearía para evaluar la pureza de las fracciones logradas?
Problema 3. La cápside del virus NMLV está formada por 60 subunidades de la misma proteína. Esta
proteína (CP) es un heterotrímero formado por tres subunidades polipeptídicas: A, B y C de 40, 50 y 15
kDa de PM respectivamente. Se sabe que el péptido B tiene dos dominios, el dominio D1 (27KDa) que
contiene 5 residuos de Cys mientras que el dominio D2 (22kDa) no contiene ninguno. Además, ambos
dominios están unidos por un loop.
Por otra parte el péptido A y el dominio D1 están unidos entre sí por puentes disulfuro, mientras que el
péptido C está unido por interacciones débiles al dominio D2.
De los tres péptidos el único que contiene aminoácidos lisina es el B y los contiene en particular en la
región del loop, además las tres subunidades tienen aproximadamente el mismo porcentaje de residuos
aromáticos y en su composición no se detectó arginina.
a. Esquematice en un diagrama de la estructura de la proteína CP. ¿Qué tipo de estructura
presenta esta proteína? Justifique.
b. Esquematice el perfil de elusión (absorbancia a 280 nm vs Vol) indicando en todos los caso a que
corresponde cada pico graficado, si se realiza una cromatografía de exclusión molecular (ULTRO-
Gel AcA212 20000 – 120000) de la cápside del virus en presencia del caótropo cloruro de
guanidinio.
c. Idem al paso anterior pero con agregado de DTT 0.5mM.
d. Igual que en el inciso “d” pero la solución de proteína CP fue tratada previamente con tripsina(
endopeptidase que digiere en extremos Ct lys/Arg).
e. Con la columna ULTRO-Gel AcA212, ¿podría determinar el peso molecular de la proteína nativa?
Explique cómo procedería.
Problema 4. En la purificación de una enzima se obtuvieron los resultados de la tabla:
a. Calcular la actividad específica en cada fracción
b. Calcular cuantas veces se ha purificado la proteína.
c. Calcular el rendimiento en todo el procedimiento.
d. Como supone Ud. que puede variar la actividad específica a lo largo del proceso de
purificación? (aumenta, disminuye, permanece constante). Por qué?
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Problema 5. Las proteínas provenientes de la harina de soja están constituidas por fracciones
identificadas por ultracentrifugación como 2S, 7S, 11S y 15S.
La fracción 11S está formada por una proteína globular cuyo peso molecular, obtenido a través de
cromatografía de exclusión molecular es de 350 kDa.
Por otro lado, para purificar la fracción 11S, extractos de harina de soja salvaje se sonicaron y
centrifugaron, luego la fracción soluble se precipitó con sulfato de amonio en un rango de saturación de
40%-60%. El precipitado se solubilizó en un buffer adecuado y se realizó una cromatografía de
intercambio iónico en DEAE-cellulose. Finalmente se llevó a cabo una crioprecipitación. En cada una de
las fracciones purificadas se determinó la cantidad de proteína por el método de Bradford utilizando
albúmina bovina como patrón. La actividad fue seguida utilizando una reacción específica para detectar
la proteína 11S y expresada como Unidades 11S por mililitros (U11S/ml). Se observan los resultados en
la Tabla 2.1.
Tabla 2.1. Purificación de la proteína 11S
Paso de purificación proteína (mg/ml) actividad (U11S/ml)
Sonicación 8000 4800
Precipitación 40-60% 750 2730
DEAE-cellulose 225 2200
Crioprecipitación 35 1820
a) Describa brevemente el fundamento de: i) precipitación con sulfato de amonio y ii)
cromatografía DEAE-cellulose.
b) ¿Por qué realiza en la cuantificación de proteínas por Bradford una curva de calibración con
BSA? Describa brevemente el procedimiento para obtenerla.
c) Discuta los resultados de la Tabla 2.1 e indique si realizaría alguna modificación, considerando
que el objetivo es utilizar esta proteína para análisis estructural.
d) Calcule el rendimiento y grado de pureza del proceso total de purificación. ¿Puede considerar
que la proteína está pura? ¿Cómo podría confirmar la pureza?
Problema 6 La galectina-1 (Gal-1) es una proteína capaz de reconocer ligandos -galactosidos, además
es capaz de inducir la agregación de glóbulos rojos (hemaglutinación), efecto que es inhibido por la
lactosa, que compite con los oligosacáridos por la unión al sitio de reconocimiento.
Se aisló Gal-1 a partir de macrófagos de rata. Las células se lavaron y se las resuspendió en un buffer.
Luego se las sonicó a 4°C y el lisado celular total se centrifugó a 600rpm por 10 minutos para eliminar
los restos celulares. El sobrenadante con una actividad específica de 5.9UH/mg se denominó extracto
crudo (EC), se pasó por una columna de CM-Celulosa y se eluyó con gradiente salino. El eluido se
sembró en una columna de exclusión molecular ULTRO-Gel AcA212 (Figura 1) obteniéndose una
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actividad específica total del proceso 21.25UH/mg. En la Tabla 1 se presenta la marcha de la purificación
mostrando algunos de los valores obtenidos.
Proteínas totales Actividad de Volumen (µl)
(mg/ml) hemaglutinación
(UH)
1) Extracto crudo EC 150 1000
2) CM-Celulosa 75 30 20
3) ULTRO-Gel AcA212 2 17
Tabla 1: Datos experimentales de la marcha de purificación de la Gal-1. La cuantificación de
proteínas totales fue realizada según el método de Bradford.
Figura 1. Resultado de la exclusión
molecular ULTRO-Gel AcA212. Se
midieron la A280 (línea contínua), y la
actividad de la hemaglutinación (línea
discontínua).
a) Describa brevemente el fundamento de la cromatografía iónica empleada. Sabiendo que el PE
de Gal-1 es 7.32 indique el pH del buffer para sembrar/estabilizar la columna. Mencione el
criterio de su elección.
b) Mencione para que se mide Abs280nm y hemaglutinación en la cromatografía ULTRO-Gel AcA212
graficados en la Figura 1. ¿Qué conclusión puede sacar de dicha figura?
c) Complete los datos experimentales faltantes en la Tabla 1.
d) Calcule el rendimiento y el grado de pureza alcanzado con dicha marcha de purificación.
e) Considerando los resultados obtenidos en la marcha de purificación ¿realizaría algún cambio?
En caso de modificar el proceso proponga una metodología de mayor resolución para mejorar la
purificación. Justifique su respuesta.
