UNIVERSIDAD DE SONORA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

Evaluación de la Capacidad Antioxidante y Antimicrobiana de

los Extractos de Barchata (Ziziphus obtusifolia)

TESIS PROFESIONAL

Que para obtener el Título de:

QUÍMICO BIÓLOGO CLÍNICO

Presenta:

Mei-Li Ayda Portela Márquez

Cd. Obregón, Sonora Noviembre de 2015

 Universidad de Sonora

Repositorio Institucional UNISON

Excepto si se señala otra cosa, la licencia del ítem se describe como openAccess
 FORMA DE APROBACIÓN

Los miembros del jurado designado para revisar la Tesis Profesional de Mei-Li Ayda Portela
Márquez, la han encontrado satisfactoria y recomiendan que sea aceptada como requisito
parcial para obtener el título de Químico Biólogo Clínico.

______________________________________
Dra. Norma Patricia Silva Beltrán
Directora de Tesis

______________________________________
Dr. Juan Carlos Gálvez Ruiz
Secretario

______________________________________
Dra. Luz Angélica Avila Villa
Vocal

______________________________________
Dr. Marco Antonio López Mata
Suplente

2
 DEDICATORIA

A mi hija

Dedico esta tesis con mucho cariño a mi hija Nubia, que es la razón de ser de mi
preparación y de mi esfuerzo, quién estuvo conmigo a lo largo de mi carrera. Tuvo
que soportar largas horas sin mi compañía, sin poder entender a su corta edad, que
todo es para ofrecerle siempre lo mejor. Ella es el impulso y la principal motivación
para superarme día con día. Te amo hija mía.

3
 AGRADECIMIENTOS

Primeramente, le agradezco a Dios por protegerme durante todo el camino y por haberme dado
fuerzas y valor para culminar esta etapa de mi vida.

A mi hija Nubia quién fue la principal motivación y el motor para salir adelante en ésta carrera.

Agradezco también el apoyo y la confianza por parte de mi madre Ayda, que sin duda alguna en
el trayecto de mi vida me ha demostrado su amor, corrigiendo mis faltas y celebrando mis
triunfos.

A mi esposo Manuel por su amor, ayuda y comprensión, además por creer en mi durante este
proyecto de vida que servirá para el futuro de la familia que hemos formado.

A mis hermanos Jorge y Raziel quienes siempre han estado conmigo y con los que he
compartido muchos momentos tanto felices como difíciles.

A mi padre Horacio, que ha estado presente en mi vida, y que sé que está orgulloso en la
persona en la cual me he convertido.

A mi abuela Socorro quien es como una segunda madre y quién junto a mis tíos Quirino y
Andrés me han brindado su apoyo y cariño. Le doy un agradecimiento especial a mi tío Efraín
quién con su ayuda, cariño y comprensión hizo posible esta importante etapa.

Agradezco a mi directora de tesis la Dra. Norma Patricia Silva por brindarme su ayuda, atención
y paciencia a lo largo del trayecto en la realización del presente proyecto.

A mis sínodos, el Dr. Juan Carlos Gálvez, la Dra. Angélica Avila y el Dr Marco López por su
gran apoyo en la elaboración de ésta tesis.

A la Universidad de Sonora por brindarme la oportunidad de estudiar esta hermosa carrera que
es Químico Biólogo Clínico.

Al Centro de Investigación e Innovación en Biotecnología, Agropecuaria y Ambiental CIIBA por

otorgarme el acceso a las instalaciones de éste centro y al Dr Saúl Ruíz, quién me permitió
trabajar en el laboratorio de microbiología para la realización del presente proyecto.

Quiero agradecer a mis amigas Lupita, Elizabeth, Muñeca, Lizbeth y Gladys por brindarme su
valiosa amistad y su apoyo incondicional durante éste importante trayecto.

4
 CONTENIDO

FORMA DE APROBACIÓN 2
DEDICATORIA 3
AGRADECIMIENTOS 4

LISTA DE TABLAS 7
LISTA DE FIGURAS 8

RESUMEN 9
INTRODUCCIÓN 10
OBJETIVOS 13
General 13
Específicos 13

REVISIÓN DE LA LITERATURA 14
Generalidades de la Barchata 14
Distribución de la Barchata en México 14
Propiedades Terapéuticas de las Especies Pertenecientes al Género Ziziphus 15
Plantas Medicinales 16
Extractos Naturales 16
Compuestos Bioactivos Presentes en Extractos de Plantas 17
Métodos para Obtención de Extractos 17
Antioxidantes 18
Estrés oxidativo 19
Eritrocitos y su daño oxidativo 19
Métodos para Medir Capacidad Antioxidante 20
Método del DPPH 20
Método de ABTS 21
Prueba de hemólisis 22
Actividad Antimicrobiana 23
Escherichia coli 23
Staphylococcus aureus 25

5
 Método para Medir Capacidad Antibacteriana (Antibiograma Disco-Placa) 26
Actividad Antiviral 26
Virus 27
Bacteriófago Av08 28

MATERIALES Y MÉTODOS 29
Preparación de los Extractos 29
Capacidad Antioxidante 30
Inhibición del radical DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazilo) 30
Inhibición del radical ABTS (2,2′- azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico) 30
Evaluación del efecto protector sobre eritrocitos humanos 31
Capacidad Antiviral 32
Identificación de bacteriófagos 32
Propagación del bacteriófago 33
Cuantificación del bacteriófago 33
Ensayo Antiviral 33
Capacidad Antibacteriana 35
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento 35
Preparación de medios 35
Prueba de susceptibilidad microbiana (Disco-Placa) 35
Análisis Estadístico 36

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37
Capacidad Antioxidante Mediante el Método DPPH y ABTS 37
Capacidad Antioxidante Mediante la Prueba de Hemólisis 39
Capacidad Antibacteriana 41
Capacidad Antiviral 43

CONCLUSIONES 48
RECOMENDACIONES 49

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 50

6
 LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1 Capacidad antibacteriana de los extractos de Z. obtusifolia 42

7
 LISTA DE FIGURAS
Figura Página

1 Ziziphus obtusifolia 14
2 Zonas endémicas de Z. obtusifolia 15
3 Reacción del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 21
4 a) Formación del radical ABTS b) reacción del catión radical ABTS
con compuesto fenólicos 22
5 E. coli (tinción Gram) 24
6 Staphylococcus spp (tinción Gram) 25
7 Bacteriófago Av08 28
8 a) Extracto acuoso de barchata b) Extracto etanólico de barchata
concentrándose en rotavapor 29
9 Técnica de la evaluación antioxidante por el radical DPPH 30
10 Técnica de evaluación de la capacidad antioxidante por el radical ABTS 31
11 Evaluación de la capacidad protectora del eritrocito humano 32
12 Unidades formadoras de placa del bacteriófago Av08 34
13 Placas inoculadas con bacterias y extracto 35
14 Capacidad antioxidante por medio del ensayo DPPH de extractos
Ac y EtOH-ac de barchata (Z. obtusifolia) 37
15 Capacidad antioxidante por medio del ensayo ABTS de los extractos
acuosos y etanólicos de las ramas de barchata (Z. obtusifolia) 38
16 Capacidad antioxidante por medio del ensayo de % de inhibición de
hemolisis inducida mediante AAPH de extractos acuosos y etanólicos
acidificados de barchata (Z. obtusifolia) 40
17 Halos de inhibición causados por el extracto EtOH-ac sobre E. coli O157 42
18 Reducción del bacteriófago Av08 por el extracto EtOH-ac 43
19 Actividad antiviral de los extractos etanólicos de Ziziphus obtusifolia
medida por la reducción en Log 10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0,
30 y 60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL 44
20 Actividad antiviral de los extractos acuosos de Ziziphus obtusifolia
medida por la reducción en Log 10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0,
30 y 60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL 45

8
 RESUMEN

La barchata (Ziziphus obtusifolia) es un arbusto muy común en el noroeste de México. Sonora

es una región endémica de dicha especie. En la actualidad esta planta se utiliza para combatir
diversos padecimientos gastrointestinales y degenerativos como el cáncer. Existen pocos
estudios sobre esta especie. Sin embargo, la familia Ziziphus, ha sido ampliamente estudiada
por sus capacidades benéficas a la salud humana. En el presente trabajo se evaluó la
capacidad antioxidante y antimicrobiana de extractos obtenidos de barchata. Para este estudio
se realizaron extractos con diferentes solventes: etanol acidificado (EtOH-ac) y agua (Ac). A
cada extracto se le evaluó la capacidad antioxidante y fue medida por medio de la inhibición del
radical ABTS, DPPH y la prueba de inhibición de hemólisis. La capacidad antimicrobiana se
realizó por medio de la prueba de susceptibilidad bacteriana en las bacterias Escherichia coli y
Staphylococcus aureus y en paralelo se evaluó el efecto antiviral utilizando al bacteriófago Av08
como modelo enteroviral. Los extractos Ac y EtOH-ac, inhibieron los radicales ABTS y DPPH
mostrando valores desde 17.41 ± 0.02 a 25.03 ± 3.73 mmol/ETge, respectivamente, en la
prueba de hemólisis se encontraron porcentajes más elevados en el extracto Ac con 46.3%
sobre el etanólico que fue de 36.8% de inhibición. La capacidad para inhibir las bacterias E. coli
y S. aureus arrojaron valores de halos de inhibición de 8.00 a 12.90 mm de diámetro para
ambos extractos. En el ensayo antiviral se pudo observar que el extracto Ac en la concentración
10 mg/mL y tiempo de 60 minutos presentó una reducción de hasta 7.40 log10 UFP/mL del
bacteriófago Av08. Estos resultados sugieren la presencia de varios compuestos bioactivos con
potencial antioxidante y antimicrobiano sobre bacterias y virus de interés clínico; así como,
efecto protector de los extractos acuosos sobre el eritrocito humano.

9
 INTRODUCCIÓN

El valor medicinal de las plantas se ha hecho más evidente durante las últimas décadas,
debido, en gran parte, al descubrimiento de una gran variedad de metabolitos secundarios de
las plantas con un potencial antioxidante (Daniels, 2011). Entre los varios componentes de las
plantas, los compuestos fenólicos son un objeto de especial interés debido a su pronunciada
distribución y gran capacidad antioxidante en el reino vegetal. Las plantas contienen un grupo
diverso de compuestos bioactivos, incluyendo fenoles simples, flavonoides, ácidos fenólicos,
antocianinas y muchos otros. Muchas sustancias bioactivas pueden tener propiedades
relacionadas con la salud, como anti-inflamatorio (Borgia, 2008) antibacteriano (Pepeljnjak,
2005). Las enfermedades coronarias, cancerosas y neurodegenerativas (por ejemplo Parkinson
y de Alzheimer), además de envejecimiento en general, son sólo algunos ejemplos de
padecimientos o condiciones de salud que pueden ser efectivamente impedido a través de la
ingesta regular y equilibrada de antioxidantes (Bamforth, 2002).
Ziziphus obtusifolia es comúnmente conocida como barchata y es un arbusto
perteneciente a la familia de las Rhamnaceae muy común en el norte de México y
principalmente en el estado de Sonora. No hay estudios concretos de esta especie en
específico, únicamente se le clasificó con especies de alto contenido proteico como planta
forrajera (Bowers y Wignall, 1993). En el 2014 Sharma y col. realizaron una revisión de las
propiedades terapéuticas, de las distintas especies de Ziziphus y encontraron que las hojas,
frutos, semillas, cortezas y raíces de esta especie tienen una enorme posición en la innovación
de nuevos agentes terapéuticos para el desarrollo de fármacos. Adicionalmente existe una
demanda comercial creciente para Ziziphus debido a su potencial aplicación en la salud
humana.
Las especies pertenecientes al género Ziziphus contiene sustancias con poder
analgésico, antiinflamatorio, antibacteriano, antioxidante, y también contiene varios fitoquímicos
tales como saponinas, pectina, ácidos grasos, y alcaloides. Ziziphus tiene un papel significativo
en el tratamiento del cáncer, la diabetes, además se ha utilizado en la medicina popular para
tratar la ictericia, diarrea, úlceras, y las fiebres (Sharma y col., 2014). En este ámbito la barchata
(Ziziphus obtusifolia) resulta una opción medicinal.
Por otro lado, las infecciones, los procesos inflamatorios, determinadas anomalías
metabólicas, el consumo excesivo de ciertos fármacos, la exposición a una radiación intensa, o
el contacto frecuente con determinados contaminantes ambientales, son condiciones que en

10
conjunto causan estrés oxidativo, el cual además de contribuir con el proceso de envejecimiento
es responsable de enfermedades humanas (Mc Kee y Mc Kee, 2009).
Así mismo, los padecimientos gastrointestinales causados por bacterias y virus en
México aún son prevalentes, y las estadísticas actuales señalan que el 44% de los niños
menores de 5 años son los más propensos a estas infecciones entéricas ocasionadas por virus
(Hernández y col., 2011). Una alternativa para el control de estos padecimientos en la población
humana es la medicina etnobotánica, por lo que Ziziphus obtusifolia resulta una opción, ya que
es una planta que se ha venido utilizando por la población indígena y su uso se ha difundido ya
que se considera como una planta medicinal contra el cáncer y otros padecimientos, sin
embargo, no existe suficiente información que permita establecer los efectos biológicos que son
benéficos hacía la salud humana. En este sentido, se tiene la desventaja de poseer un
conocimiento limitado de esta especie, ya que la mayoría de ellas se encuentran en estado
silvestre y se requiere de mayor investigación y esfuerzos para profundizar en el conocimiento
farmacéutico de esta especie mexicana. Esto representa una oportunidad, que permite ampliar
y explorar las aplicaciones médicas de esta planta como alternativa natural para prevenir o
tratar enfermedades de infecciones intestinales o degenerativas provocadas por oxidación
celular.
Por lo anterior, determinar las propiedades antioxidantes y antimicrobianas de los
extractos obtenidos de las ramas de Ziziphus obtusifolia. Además, la barchata (Ziziphus
obtusifolia) es un arbusto muy común en el noroeste de México, y Sonora es una de las
regiones endémicas de estas especies siendo una planta autóctona por lo que es de fácil
acceso además su obtención no generaría costo alguno y de esta manera muchos serían
beneficiados de sus sustancias bioactivas.
Existen pocas investigaciones que documenten la utilización de esta planta herbácea.
Ramírez y colaboradores en el 2001, estudiaron un uso alternativo de esta planta medicinal y la
propuso como forraje en alimentos de animales silvestres. Sin embargo aún, no existen
estudios en donde confirmen el beneficio y las propiedades de esta planta en específico hacia
la salud humana.
Por otro lado, se ha documentado que las especies a las que pertenece esta planta
contienen numerosas capacidades terapéuticas como actividad antibacteriana, propiedades
antioxidantes, anticancerígenas entre otras (Sharma y col., 2014).
También se han encontrado muchos testimonios en donde las personas utilizan
infusiones acuosas y los toman como remedios alternativos para combatir algunas
enfermedades degenerativas incluyendo el cáncer (Ramírez y col., 2001). Por lo que esta planta

11
representa una alternativa natural de obtención de constituyentes o sustancias bioactivas con
beneficio a la salud humana.

12
 OBJETIVOS

General

Evaluar la capacidad antioxidante, antibacteriana y antiviral de extractos de barchata (Ziziphus

obtusifolia).

Específicos

1. Obtener los extractos etanólicos y acuosos de barchata (Ziziphus obtusifolia).

2. Determinar la capacidad antioxidante de los extractos mediante los ensayos DPPH,
ABTS y capacidad protectora sobre el eritrocito humano.
3. Determinar el efecto de los extractos sobre el modelo enteroviral Av08
4. Analizar la capacidad antibacterial de los extractos, mediante la prueba de
susceptibilidad antimicrobiana sobre las bacterias Staphylococcus aureus (ATCC 65384)
y Escherichia coli O157 (ATCC 43890).

13
 REVISIÓN DE LA LITERATURA

Generalidades de la Barchata

La bachata es un arbusto que alcanza una altura de 2 a 3 m. Los tallos son verdes grisáceos,
robustos, con ranuras y muy ramificados, tienen una flor similar a la cera blanquecina o grisácea
(figura 1). La hojas son alternas, simples ovales éstas se caen durante los períodos secos. Se
produce en zonas desérticas, matorrales y pastizales (Carter, 1997).
Se han encontrado ciertos beneficios en esta planta, tal como poseer un alto contenido
de proteínas. Los Pimas mojaron las raíces con agua y las aplicaron a los ojos doloridos
(Bowers y Wignall, 1993). Los Seris trituraron las raíces en polvo para aplicarlo a la piel y
úlceras en el cuero cabelludo (Epple, 1995). Las infusiones hechas de raíces también han
servido como un sustituto de jabón (Kearney y col., 1951).

Figura 1. Ziziphus obtusifolia. (Fuente: Nickrent,

2007)

Distribución de la Barchata en México

Existen dos variedades de esta planta que han sido descritas: variedad obtusifolia que es
glabrata y variedad canescens que es tomentose. La primera es principalmente una planta del
desierto chihuahuanse y los bosques adyacentes, la segunda del desierto de Sonora y
pastizales semidesérticos adyacentes (Turner y col., 2005). En la figura 2, se puede apreciar la
distribución de esta planta herbácea.

14
 Propiedades Terapéuticas de las Especies Pertenecientes al Género Ziziphus

Ziziphus es un género de la familia Rhamnaceae y comprende alrededor de 40 especies de

pequeños arbustos espinosos o pequeños árboles con propiedades medicinales. Estas plantas
contienen numerosas propiedades terapéuticas como analgésico, antiinflamatorio,
antibacteriano, anti-envejecimiento, anti-tumor y propiedades antioxidante. También presenta
varios fitoquímicos tales como saponinas, pectina, ácidos grasos, ácidos y alcaloides. Ziziphus
tiene un papel significativo en el tratamiento del cáncer, la diabetes y también se han utilizado
en la medicina popular para tratar la ictericia, diarrea, úlceras, y fiebres (Sharma y col., 2014).
En otro estudio se encontró que el extracto acuoso de la hoja de Ziziphus mauritiana
puede prevenir el daño hepático inducido por el alcoholismo crónico mediante la mejora de los
niveles de estado antioxidante total y la inhibición de la peroxidación lipídica hepática, utilizando
ratas como prueba (Dahiru y col., 2005).
Otras aplicaciones de esta planta son en los productos cosméticos, la producción de
vino y conservación de alimentos debido a la presencia de compuestos antimicrobianos,
también se elaboran tónicos para la mejora el sistema inmunológico. Su aceite es utilizado para
promover el crecimiento del cabello (Sharma y col., 2014).

Figura 1. Zonas endémicas de Z. obtusifolia

Fuente: Turner y col., 2005
Figura 2. Zonas endémicas de Z. obtusifolia. (Fuente: Turner y col., 2005)

15
 Plantas Medicinales

El consumo de plantas medicinales (hierbas medicinales) o fitoterapia constituye uno de los

capítulos más importantes dentro del variado mundo de la medicina alternativa y
complementaria. En la práctica supone un segmento no controlado de la terapia farmacológica,
dada la posibilidad de efectos terapéuticos, tóxicos o interacciones que pueden causar los
principios activos de las plantas y porque su utilización ha crecido espectacularmente en los
países desarrollados (Ernst, 2000).
Las plantas medicinales se comportan como verdaderos fármacos ya que las sustancias
químicas que las componen pueden tener una actividad biológica en humanos (Tres, 2006).

Extractos Naturales

Desde tiempos remotos, una gran variedad de plantas y productos vegetales han sido utilizados
para prevenir enfermedades degenerativas, tanto en humanos como en animales (Tavares y
col., 2008). Se ha reportado que dichas propiedades se deben a la presencia de sustancias
bioactivas las cuáles pueden se pueden obtener mediante diferentes tipos de extracciones
(Boulanouar y col., 2013). El uso de extractos naturales proviene de hace mucho tiempo donde
se utilizaban las plantas medicinales y hoy en día son utilizados en varios ámbitos como
cosmetología, química, farmacología entre otras, en las industrias alimentarias su uso es para
ayudar a preservar los alimentos, en el caso de algunos que tienen características
antimicrobianas y antioxidantes (García Fajardo y col., 1999).
Se conocen aproximadamente 1340 plantas como potenciales fuentes de compuestos
antimicrobianos (Gião y col.,2008), además, se conocen más de 250,000 especies de plantas
que contienen una gran diversidad de compuestos bioactivos (Raal y col. 2012). Los
compuestos antioxidantes de los vegetales se extraen con disolventes de diferentes polaridades
de acuerdo con el carácter hidrofílico o lipofílico de los compuestos que se desean evaluar. El
disolvente más comúnmente utilizado en la obtención de extractos lipofílicos es el hexano.
También se han utilizado el éter dietílico y cloruro de metileno, entre otros. Para la extracción de
compuestos con carácter hidrofílico se ha utilizado el metanol, etanol, mezcla de etanol/agua,
acetona/agua, así como metanol/agua (Pérez y Saura, 2006).

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 Compuestos Bioactivos Presentes en Extractos de Plantas

Los compuestos bioactivos son metabolitos secundarios producidos por las plantas para su
defensa y supervivencia al medio que les rodea. Estas sustancias pueden ser colorantes
(pigmentos), aromáticas, reguladores del crecimiento, protectores naturales frente a parásitos y
otros, que no tienen una función nutricional claramente definida o no son considerados
esenciales para la salud humana, pero que pueden tener un impacto significativo en el curso de
alguna enfermedad (Biesalskiy col, 2009). A estos metabolitos se les está dando una aplicación
en la industria farmacéutica y alimentaria principalmente. Afortunadamente en México se tiene
una gran diversidad de plantas, ya que es el cuarto país más rico del mundo en este aspecto
(Jasso de Rodríguez y col., 2011).
La abundancia de las plantas ha sido una de las ventajas para su uso como materia
prima en la continuación de los esfuerzos para obtener productos de origen natural. Los
extractos de plantas se han utilizado desde la antigüedad como remedios contra enfermedades
producidas por hongos, bacterias y virus, esto debido a su contenido de compuestos bioactivos
que se logran extraer (Drago y col., 2006). Algunos de estos metabolitos son los compuestos
fenólicos, los cuales tienen varias propiedades asociadas a los antioxidantes. Los beneficios
para la salud incluyen la reducción de la presión arterial, los niveles de proteínas tóxicas en la
enfermedad de Alzheimer, infecciones del tracto urinario, y el riesgo de desarrollo del cáncer,
además que actúan como antimicrobianos aplicados en alimentos, como biofertilizantes e
incluso como biofungicidas (Alves y col., 2012).

Métodos para Obtención de Extractos

Los extractos se pueden definir como la sustancia que se obtiene de hojas, tallos, flores o
semillas, según sea la parte que contiene el ingrediente activo, que posee ciertas propiedades o
actividad biológica. Para obtenerlos, existen diferentes métodos, algunos utilizados
ancestralmente como la maceración o la cocción (Chávez-Benavides, 2008). Existen diferentes
tipos de métodos de extracción, los convencionales y los no convencionales. Los más utilizados
son los convencionales en los cuales existen dos tipos de procesos: la infusión-cocción y la
maceración con solventes. En el primero se utiliza agua hirviendo sobre la matriz fresca o seca,
se deja reposar por un tiempo y se filtra. La maceración con solventes orgánicos, consiste en
someter a la estructura que corresponde de una determinada planta a la acción de un medio

17
líquido que puede ser agua o combinando al agua con un alcohol u otros disolventes
apropiados para un mejor aprovechamiento del sistema (Camel, 2000).
El uso de disolventes como método de extracción en plantas influye significativamente
en el arrastre de los compuestos activos y la actividad antioxidante y antimicrobiana de los
extractos. El disolvente debe ser capaz de disolver rápidamente todos los principios activos y la
menor cantidad de materia inerte, que tenga un punto de ebullición bajo y uniforme que permita
eliminarlo rápidamente (Costa y col., 2012).

Antioxidantes

Los radicales libres de oxígeno causan daño oxidativo y este se ha visto implicado en la
etiología o patología de más de cien enfermedades diferentes, entre las que se encuentran
distintos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y vasculares, diabetes y desórdenes
neurovegetativos. Un radical libre es cualquier molécula que contiene uno o más electrones no
apareados. En las células aeróbicas existen diversas vías que conducen a la producción de
radicales libres derivados del oxígeno (Martínez, 1995).
Las enzimas que en muchas ocasiones generan estrés oxidativo están asociadas al
metabolismo del ácido araquidónico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo P-
450. La presencia y ubicuidad de enzimas (superóxidodismutasa, catalasa y peroxidasas) que
eliminan productos secundarios de la vía univalente en las células aeróbicas sugieren que los
aniones superóxidos y el peróxido de hidrógeno son productos secundarios importantes del
metabolismo oxidativo (Rybczynska, 1994).
Las especies de oxígeno reactivo pueden lesionar macromoléculas como el ADN, los
hidratos de carbono y las proteínas. Estas especies de oxígeno citotóxico pueden clasificarse
en 2 tipos: a) los radicales libres, como el radical superóxido (O 2-) y el radical hidroxilo (OH-) y b)
las especies de oxígeno no radicales, como el peróxido de hidrógeno (H 2O2), el oxígeno singlete
(O), que resulta una especie muy tóxica, el peroxinitrito (ONOO) y el ácido hipocloroso
(Aldershvile, 1998).
Las plantas son fuentes potenciales de valor incalculable de antioxidantes, dentro de los
mas importante tenemos a las vitaminas C, E, compuestos fenólicos, carotenoides y
terpenoides, los cuales actúan antagónicamente contra los radicales libres en el organismo
(Herodez y col., 2003). Asimismo, existen antioxidantes sintéticos como el butilhidroxianisol
(BHA), y el butilhidroxitolueno (BHT) que son utilizados comúnmente en la industria de
alimentos y farmacéutica, sin embargo, se han encontrado efectos secundarios, como el

18
aumento del colesterol, hepatomegalia e inducción de cáncer hepático, entre otras (Lorenzo,
2013). Por lo anterior, en los últimos años se ha incrementado la importancia de los
antioxidantes de origen natural como alternativas de aplicación a los sintéticos, ya que se ha
reportado que a bajas concentraciones pueden ejercer su acción y ser inocuos (Pisoschi, 2009).

Estrés oxidativo

El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas,

como: arterioesclerosis, artritis, demencia, cáncer, etc; es por ello que el uso de antioxidantes,
es estudiado de forma intensiva, en farmacología; particularmente, en el tratamiento de
accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas. Actualmente, se sabe que
tanto por causas ambientales (radiación), así como por la ingesta de algún contaminante o
incluso como consecuencia de nuestro propio metabolismo, surgen algunas moléculas que nos
pueden provocar daño. A estas se les conoce como especies oxígeno reactivas (ROS), que se
asocian a enfermedades como cáncer, problemas cardiacos o al natural envejecimiento
humano (Moein y Moein, 2010).
Entre los problemas que originan figuran: destrucción de paredes celulares, inactivación
de enzimas, debilitamiento de la capacidad defensiva, alteración del sistema inmunológico e
incluso daño del material genético (Neira y Yuri, 2004).

Eritrocitos y su daño oxidativo

Los eritrocitos o glóbulos rojos se producen en la médula ósea y se liberan hacia la circulación
periférica, donde tienen una vida media de alrededor de 120 días. Durante ese tiempo se
producen varios cambios metabólicos y químicos a medida que el eritrocito envejece y pierde su
capacidad para deformarse (Rodak, 2005). Adicionalmente los eritrocitos son propensos a
fenómenos de lisis que se le conoce como hemólisis, este efecto también puede ser causado
por factores externos ya sea por infecciones, inflamaciones, enfermedades malignas o por la
oxidación celular.
Los eritrocitos son un modelo celular utilizado en la investigación del daño oxidativo en
las biomembranas (Ugartondo y col., 2010). Fosfolipidos, proteínas transmembrana y colesterol
en combinación con una red de proteínas del citoesqueleto son responsables de la integridad
de la membrana del eritrocito (Smith, 1987), por lo que son muy propensos al ataque de
especies reactivas de oxígeno (ROS), esto también se debe a la alta cantidad de contenido de

19
ácido graso poliinsaturado en sus membranas y a las reacciones de oxidación, debido al Fe de
la hemoglobina. El ataque oxidativo de los eritrocitos es uno de los sucesos más importantes en
algunas hemoglobinopatías (Hirschler y col., 2012). La autoxidación de la oxihemoglobina
contribuye a la degradación de núcleo hemo, por lo que el daño inducido experimentalmente al
eritrocito es un buen modelo de investigación (Vitturi y col., 2012). Los fitoquímicos pueden
proteger los eritrocitos o incrementar su resistencia a las reacciones oxidativas (Mahejabeen y
col., 2013).

Métodos para Medir Capacidad Antioxidante

Los métodos de medición de la actividad antioxidante muestran extrema diversidad; muchos

procedimientos usan una acelerada oxidación involucrando un iniciador para manipular una o
más variables en el sistema de prueba; tales iniciadores incluyen adición de un metal de
transición como catalizador, exposición a la luz para promover oxidación fotosensitizada por
oxigeno singlete (Antolovich y col., 2002) y fuentes de radicales libres (Li y col., 2003).
La evaluación de la actividad antioxidante a través de fuentes generadoras de radicales
libres en el sistema de prueba, asume que la oxidación es inhibida en un alto porcentaje por la
captura de estos; por tanto se enfoca en monitorear la capacidad de aditivos y extractos para la
captura de radicales o la inhibición de su formación. Este es el principio de los métodos más
modernos de ensayo tales como los ensayos de ABTS (ácido 2,2’azinobis-(3- etilbenztiazolina)-
6-sulfónico) y DPPH (1,1-difenil-2- picrilhidrazilo) (Antolovich y col., 2002).
Ambos métodos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones, aunque
también muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente
sin una preparación previa, mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reacción que
puede ser química (dióxido de manganeso ó persulfato potasio). Con el ABTS se puede medir
la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que el DPPH solo
puede disolverse en medio orgánico (Halliwell y Gutteridge, 1999)

Método del DPPH

Éste método evalúa la actividad de compuestos específicos o extractos usando el radical libre
estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) en una solución metanólica. La reducción del DPPH
se monitorea por la disminución en la absorbancia a una longitud de onda característica. En su
forma de radical libre, el DPPH absorbe a 515 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante,

20
esta absorción desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH proporciona un índice
para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales (Brand-Williams y
col., 1995).
En la figura 3, se muestra un esquema de la reacción (Molineux, 2004) donde AH es un
antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de hidrógeno, dando como resultado
radicales con estructuras moleculares estables que detendrán la reacción en cadena, tal es el
caso de los fenoles. El nuevo radical formado puede interactuar con otro radical para formar
moléculas estables (Brand-Williams y col., 1995).

Figura 3. Reacción del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

(Fuente: Molineux, 2004)

Método de ABTS

En este método, el producto de oxidación del ABTS, el catión radical de larga vida ABTS, se
presenta como una excelente herramienta para determinar la actividad antioxidante de
sustancias donadoras de hidrógeno (capturadores de radicales en fase acuosa) y antioxidantes
rompedores de cadena (capturadores de radicales peroxilo lipídicos) (Re y col., 1999).
La técnica para la generación del radical catión ABTS, implica la producción directa del
cromóforo ABTS verde-azul a través de la reacción entre ABTS y el persulfato de potasio
(K2S2O8). Este presenta tres máximos de absorción a las longitudes de onda de 645 nm, 734
nm y 815 nm. La adición de los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta
manera el grado de decoloración como porcentaje de inhibición del radical catión ABTS está

21
determinado en función de la concentración y el tiempo; así como del valor correspondiente
usando el Trolox como estándar, bajo las mismas condiciones. En este método, se mide el
tiempo que tarda el radical ABTS en ser oxidado hasta el radical libre estable ABTS en
presencia de compuestos antioxidantes (figura 4) como los polifenoles, que retarden dicha
oxidación o bien disminuyan la absorbancia de la disolución por captura del radical (Friaa y
Brault, 2006).

Figura 4. a) Formación del radical ABTS b) reacción del

catión radical ABTS con compuestos fenólicos. (Fuente: Fria y
Brault 2006)

Prueba de hemólisis

Los modelos celulares son considerados una herramienta útil en investigación de salud
humana, así como, en la investigación encaminada a la validación de alimentos funcionales
ricos en antioxidantes naturales ya que proporcionan información valiosa sobre los mecanismos
de acción y la eficacia protectora de sustancias bioactivas puras y extractos de alimentos ricos
en antioxidantes (Zhao y col., 2008).
Este ensayo proporciona información acerca del comportamiento citotóxico que pudiese
tener la muestra, para posteriormente emplear aquellas concentraciones de muestra que no
causen daño al cultivo celular. Posteriormente, se procede a evaluar el efecto protector frente al

22
estrés oxidativo en presencia de sustancias como peróxidos orgánicos e inorgánicos, sistemas
oxidantes, peroxinitrito, entre otros y la sustancia bioactiva (Cruz-Silva y col., 2000).

Actividad Antimicrobiana

El modo de acción de los compuestos fenólicos no ha sido aún bien determinado, suponiendo
que éstos pueden inactivar enzimas esenciales, reaccionar con la membrana celular o alterar la
función del material genético, proporcionando así propiedades antimicrobianas (Rodríguez,
2011).
Asimismo, se ha observado que las grasas, proteínas, concentraciones de sal, pH y
temperatura son factores que pueden favorecer la actividad antimicrobiana. Los componentes
activos de los extractos pueden variar en su composición, ya que ésta puede verse afectada por
ciertas variables como el genotipo de la planta, las diferentes metodologías de extracción,
localización geográfica, así como las condiciones ambientales y agronómicas (Rodríguez,
2011).
El mecanismo de acción de los compuestos antimicrobianos dentro de una célula puede
llevarse a cabo en la pared celular, membrana celular, en la síntesis de proteína, en su genética
y en la síntesis de su genética. Esto puede causar daños irreparables a una célula. Sin
embargo, no se conoce aún su modo de acción, pero al actuar de forma diferente, las
combinaciones de estos pueden llevar a mejores resultados (Gonzalez y col., 2010).
Existen pocos estudios enfocados a comprender el mecanismo involucrado en la
inhibición microbiana por extractos y aceites esenciales. Sin embargo, se supone que dada la
estructura fenólica de muchos de los compuestos con actividad antimicrobiana presentes en
ellas, el modo de acción debe ser similar al de otros compuestos fenólicos. En muchos casos
los antimicrobianos pueden no tener ningún efecto hasta que se rebasa una concentración
crítica (Davidson, 2001).

Escherichia coli

E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente estudiadas, y no solamente por
sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones
metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole (Neidhardt, 1999). Forma parte de la
familia Enterobacteriaceae, está integrada por bacilos Gram negativos (figura 5) no

23
esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles, aerobios-anaerobios facultativos
(Ewing, 1985).
Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua,
vegetales y gran variedad de animales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en
patología humana puede cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente
de todos los aislamientos clínicamente significativos en los laboratorios microbiológicos, y hasta
el 80% de todos los bacilos Gram negativos identificados (Ewing, 1985).
Los aislados de E. coli tienen pocas características que puedan ser usadas para
distinguir una cepa de otra; por lo que ha sido necesario implementar investigaciones
epidémicas y con este fin una serie de estudios fenotípicos y genotípicos, incluyendo tipificación
con bacteriófagos, factores de virulencia, genotipificación de verotoxinas, análisis de plásmidos,
electroforesis de enzimas multilocus, ribotipificación. RFLP y electroforesis de campo pulsado.
(Martín y col., 1996)
Las E. coli patógenas son caracterizadas por la expresión de factores de patogenicidad,
como factores de adherencia, invasinas y cápsulas entre otras. En los últimos años se han
identificado 6 categorías de E. coli causantes de EDA (Enfermedades Diarreicas Agudas):
(Blanco y col., 1991).
 E. coli enterotoxigénica(ECET) genera una enterotoxina
 E. coli enteropatógena (ECEP) generada por adherencia íntima a la célula huésped.
 E. coli enteroinvasiva (ECEI) por invasión a la célula.
 E. coli enterohemorrágica (ECEH) adherencia a la íntima de la célula huésped
 E. coli enteroagregativa (ECEAgg).
 E. coli enteroadherente (ECDA) generada por una producción de enterotoxina.

Figura 5. E. coli (tinción Gram). (Fuente:

Santisteban, 2001)
24
E. coli enterohemorrágica O157: H7 es el serotipo más prevalente identificado en 1982 como
causa de enfermedad en humanos causa diarrea sanguinolenta, produce potentes toxinas y
genera lesiones típicas de adhesión y daño tisular a nivel de las microvellosidades (Besser y
col., 1993).

Staphylococcus aureus

El género Staphylococcus, pertenece a phylum Firmicutes, clase III Bacilli, orden I Bacillales,
familia VIII Microcococeae, y tiene cerca de 38 especies (Doyle y col., 2001; Garrity y col.,
2004). Solamente 18 especies de Staphylococcus, han sido reportadas de importancia en
alimentos y con interés en la salud pública, siendo S. aureus la más relevante y siendo ésta
indicadora de contaminación por manipulación inadecuada (Doyle y col., 2004).
S. aureus es una bacteria con morfología microscópica típica de cocos Gram positivos
agrupados en racimos de tamaño entre 0,5 a 1,5 µm, no esporulada e inmóvil (figura 6). Es una
bacteria ubicua y patógena que puede causar intoxicación alimentaria (Doyle y col., 2004).

Figura 6. Staphylococcus spp (tinción Gram).

(Fuente: American Society for Microbiology,
2005)

Es uno de los patógenos humanos asporógenos más resistente a condiciones

ambientales adversas, logrando persistir a temperaturas de congelación y descongelación

25
(FSAI, 2010).El principal factor de virulencia de Staphylococcus spp. involucrado en la IAE
(Intoxicación Alimentaria Estafilocócica) es la producción de enterotoxinas termorresistentes
(Mossel y col., 2003).
Los síntomas de la IAE pueden ser algunos de los siguientes: náuseas, dolor abdominal,
emesis, diarrea y postración (Kérouanton, 2007). En los casos más graves se puede presentar
cefalalgia y shock (ICMSF, 1998).

Método para Medir Capacidad Antibacteriana (Antibiograma Disco-Placa)

El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los

métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda
para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-
placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de Petri previamente
inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes
antibióticos (García y col., 2000).
Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie
húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde
radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de
concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una
zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento
y bacterias inhibidas. Para cuantificarla se mide el diámetro de la zona de inhibición obtenida
por cada una de tales cepas, existen, por tanto, unos diámetros de inhibición, expresados en
mm, estandarizados para cada antimicrobiano (García y col., 2000).

Actividad Antiviral

Las plantas medicinales con una fuerte actividad antiviral para el tratamiento de infecciones
virales en humanos y animales, han sido identificadas. También se han estudiado los
mecanismos de acción de nuevos agentes antivirales derivados de plantas. (Serkedjieva, 2003;
Tolo y col., 2006).
Los productos naturales, ya sea extractos de plantas o compuestos puros, contienen
sustancias con diversas estructuras químicas, proporcionando una fuente ilimitada de nuevas
alternativas medicinales. Además, los estudios que evidencian el potencial antiviral de extractos
de plantas contra las cepas virales resistentes a los agentes antivirales convencionales ponen

26
de manifiesto la necesidad de explorar las plantas medicinales para los componentes antivirales
naturales (Serkedjieva, 2003; Tolo y col., 2006).

Virus

Una partícula viral consiste en una molécula de ácido nucleico, ya sea ácido desoxirribonucleico
(DNA) o ácido ribonucleico (RNA), dentro de una cubierta proteínica o cápside (a veces por una
envoltura de lípidos, proteínas y carbohidratos). Las proteínas en la cápside determinan la
especidicidad de interacción entre un virus y su célula hospedera. La cápside protege al ácido
nucleico y facilita la adhesión y la penetración en la célula hospedera por el virus. Dentro de la
célula , el ácido nucleico viral toma el control de la maquinaria enzamática del hospedero para
que funcione al servicio de la replicación del virus (Brooks y col., 2008).

Bacteriófagos

Los fagos son virus que invaden células bacterianas específicas, que alteran su metabolismo, y
lisan la bacteria sin comprometer la viabilidad de otras especies de flora en el hábitat. Son los
microorganismos más abundantes en nuestro entorno (Brϋssow, 2005). Los fagos pueden
proporcionar un enfoque natural, no tóxico, factible para controlar varios patógenos humanos.
Un estudio en humanos con fagos específicos de Escherichia coli indicaron que son seguros
para la administración oral (Brüssow, 2005).
Se conocen dos tipos de replicación del fago: los ciclos lisogénico y lítico. El ciclo
lisogénico, también conocido como la forma profago, infecta bacterias susceptibles, y el genoma
del fago se fusiona con el ADN bacteriano sin causar la lisis bacteriana. Esta forma puede
persistir durante mucho tiempo hasta que el ciclo lítico se activa por factores externos como la
luz ultravioleta (Campbell, 2003). El ciclo lítico provoca la lisis celular, liberando numerosa
progenie de fagos (Abedon y col., 2001). Por lo tanto, se prefieren los fagos que expresan un
ciclo lítico para el biocontrol de bacterias patógenas. Los fagos líticos han recibido atención
como agentes terapéuticos contra bacterias patógenas humanas y animales (Alisky y col., 1998;
Barrow y col., 1998; Capparelli y col., 2007), y más recientemente para reducir las bacterias
transmitidas por los alimentos patógenos (Atterbury y col., 2003; Pao y col., 2004; FDA, 2006).
La mayoría de los fagos son específicos para ciertas especies bacterianas; sin embargo,
algunos estudios han demostrado que los fagos han sido capaces de infectar a más de un
género bacteriano (Bielke y col., 2007). Los fagos están aislados de ambientes diversos, tales

27
como aguas residuales y lodos de depuradora (Fiorentin y col., 2004; Pao y col., 2004; Carey-
Smith y col., 2006), la carne de vacuno (Atterbury y col., 2003), productos lácteos (Capra y col.,
2006), el suelo (Ashelford y col., 2003), el esputo y saliva (Bachrach y col., 2003).

Bacteriófago Av08

El fago Av08 que se observa en la figura 7, posee un genoma ADN de doble cadena que
pertenece al orden Caudovirales de la familia Myoviridae. Tiene una longitud de 231 ± 7 nm,
una cabeza alargada isométrica de 93 ± 3 nm por 118 ± 1 nm, y una cola rígida y contráctil de
106 ± 3 nm de longitud y de alrededor de 18 nm de diámetro (López y col., 2011).
Los fagos de la familia Myoviridae han sido con frecuencia iso-relacionados con los de
las heces de mamíferos frescas y están asociados con el efecto lítico en E. coli y Salmonella
(Abedon y col., 2003; Carey-Smith y col., 2006).

Figura 7. Bacteriófago Av08. (Fuente: López y

col., 2011)

28
 MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de los Extractos

Para la preparación del extracto EtOH-ac se utilizó el método según Sultana y col., 2009. Las
ramas de barchata fueron secadas al sol y se pulverizaron con un molino industrial. Se
añadieron 10 g del polvo obtenido de barchata a 150 mL de una solución extractora de etanol y
ácido acético relación (95:5) y se mantuvo en la oscuridad durante 48 horas en maceración con
agitación intermitente. Doce horas más tarde la solución se filtró a través de papel filtro
Whatman No1. El extracto se concentró en rotavapor (Yamato RE301-Japón) para su posterior
análisis (figura 8. a).
En las infusiones acuosas se colocó 1 gramo de las ramas de barchata pulverizada en
100 ml de agua y se hirvió por 3 minutos (figura 8. b). El extracto EtOH-Ac se diluyó con dimetil
sulfóxido (DMSO) al 5% para su fácil manejo.

a) b)

Figura 8. a) Extracto acuoso de barchata; b) Extracto EtOH-ac de barchata

concentrándose en rotavapor

29
 Capacidad Antioxidante

Inhibición del radical DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazilo)

Se midió la capacidad antioxidante de los extractos para inhibir el radical DPPH según Moein y
Moein. (2010), con algunas modificaciones. Una alícuota de 280 µL de la solución del radical
DPPH (0.025 mg/mL en metanol) se mezcló con 20 µL del extracto, la reacción se dejó reposar
por 30 min en completa oscuridad y se leyó la absorbancia a 490 nm en un lector de
microplacas usando un espectrofotómetro Fluostar Omega spectrophotometer (BMG Labtech,
Chicago, IL, USA). La actividad antioxidante se calculó usando una curva de calibración de
Trolox y los resultados se expresaron como µmol Equivalente Trolox/g de extracto (µmol
ET/ge). En la figura 9, se puede observar el color característico de este radical, así como, la
inhibición de su color.

Figura 9. Técnica de evaluación antioxidante por el

radical DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazilo).

Inhibición del radical ABTS (2,2′- azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)

Se determinó de acuerdo a la técnica descrita por Re y col. (1999).El radical ABTS se preparó
al mezclar 19 mg en 5 mL de agua destilada. Por otro lado, se preparó una solución de
persulfato de potasio (37.8 mg/mL en agua destilada). Se tomaron 88 µL del radical ABTS

30
preparado y se le añadieron a la solución de persulfato de potasio, dicha mezcla se dejó
reposar por 12-16 h a temperatura ambiente. De esta solución incubada se tomaron 500 µL y se
diluyeron en 30 mL de etanol para posteriormente ajustar la absorbancia a 0.7±.02 en lector de
microplacas a 750 nm. Finalmente se colocaron 295 µL de radical y 5 µL del extracto. La
actividad antioxidante se calculó usando una curva de calibración de Trolox y los resultados se
expresaron como µmol equivalente Trolox/g de extracto (µmol ET/ge). En la figura 10, se puede
observar el color azul característico de este radical, así como, la inhibición de su color.

Figura 10. Técnica de la evaluación de la capacidad

antioxidante por el radical. ABTS (2,2′- azino-bis(3-
etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)

Evaluación del efecto protector sobre eritrocitos humanos

La hemolisis fue inducida por el radical AAPH (2-2´- Azobis (2 – methylpropionamidine)

dihydrochloride) de acuerdo a la metodología de Luy col. (2010). Los eritrocitos fueron lavados
en 3 tiempos con buffer salino (PBS) a pH de 7.4. Una vez lavados se preparó una suspensión
de eritrocitos humanos al 5% en PBS. Para el ensayo se colocaron en un tubo eppendorf 50 µL
de la suspensión de eritrocitos, 50 µL del extracto a evaluar y 200 µL del radical AAPH, se

31
mezcló e incubó a 37°C en baño maría con agitación (30 rpm) durante 3 h. Una mezcla de
reacción similar se preparó sin extracto como control (hemólisis completa). Terminada la
incubación se agregó 1 mL de PBS y se centrifugó a 3500 rpm por 10 min y se midió la
absorbancia en lector de micro placas a 540 nm. El resultado se expresó en porcentaje de
inhibición, la cual se calculó mediante la fórmula: ((Abs Control- Abs Final)/Abs Control * 100).
En la figura 11, se puede observar los eritrocitos mezclados con los extractos al ser sometidos
con el radical AAPH.

Figura 11. Evaluación de la capacidad protectora del eritrocito

humano

Capacidad Antiviral

Identificación de bacteriófagos

Preparación de cepas hospederas. Se utilizó la cepa E. coli O157 la cual se inoculó en tubos
con 10 mL de TSB Caldo de Soya Tripticasa. Se dejó incubar durante 24 horas a 36 °C.

32
Propagación del bacteriófago

Para la propagación del bacteriófago se utilizó el método descrito por Jamalludeen y col., 2009.
Se mezcló 100 μL del bacteriófago Av08 con 1 mL de la bacteria (E. coli O157) hospedera en
un tubo con 3 mL de TSB-agarosa 0.4%. La mezcla se vertió sobre cajas Petri con 10 mL de
TSA (Agar de Soya Tripticasa); una vez solidificado el medio de cultivo, la caja se incubó
durante 18-24 horas a 37 °C.
Después de la incubación se le añadieron 6 mL de una solución amortiguadora llamada
buffer SM (el cual se compuso de MgSO4.7H2O 8 mM, NaCl 100mM, gelatina porcino 0.002% C
P/V) y se agitó por oscilación durante 3 horas. La capa suave de la superficie se recuperó por
remoción con un asa bacteriológica y el diluido resultante se vació en un tubo falcon, enseguida
se centrifugó a 10,000 RPM durante 15 minutos a 4 °C para eliminar los detritus de la bacteria.
El sobrenadante se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa (Whatman, USA)
con tamaño de poro 0.45 μm, el filtrado se centrifugó a 10,000 RPM durante 15 minutos a 4 °C.
Se obtuvo una pastilla la cual se conservó en buffer SM.

Cuantificación del bacteriófago

Para la cuantificación del bacteriófago se hicieron diluciones decimales por duplicado, en buffer
SM. A cada dilución se le adicionó 1 mL del fago Av08. Se tomaron 50 µL del fago diluido, 500
µL de bacteria E. coli O157 y se colocaron en 1.5 mL de TSB-agarosa. La mezcla se vertió en la
caja Petri con TSA correspondiente a la dilución. Se incubó a 37 °C durante 24 horas,
transcurrido el tiempo se procedió a leer las placas contando las UFP (Unidades Formadoras de
Placa) de cada caja las cuales se pueden observar en la figura 12. Las UFP, se calcularon con
la siguiente fórmula:

̅ (# 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂𝒔)(𝟏𝟎−𝟏𝟎 )
𝑿
𝑼𝑭𝑷 =
𝟎. 𝟏 𝒎𝒍

Ensayo Antiviral

Se midieron los efectos antivirales de los extractos EtOH-ac y Ac contra bacteriófagos Av08
(ADN). Los extractos se disolvieron en 5% de DMSO y se esterilizaron a través de un filtro de

33
membrana de 0.45 micras. Las concentraciones ensayadas fueron 5 y 10 mg/mL. Una alícuota
de 100 µL del fago se confrontó con 3 mL del extracto. Se evaluaron 3 tiempos de contacto: 0,
30 y 60 min. Al finalizar cada tiempo la reacción se detuvo añadiendo una solución neutralizante
de acuerdo con la Secretaria de Comercio y Fomento Industrial (1999). A continuación, se
prepararon las siguientes diluciones decimales disueltas en buffer: 102, 104, 106, 108, 1010 y
1012. En tubos que contenían 3 mL de TSB suplementado con 0.4% w / v de agar (en un estado
líquido y a una temperatura por debajo de 45 °C), se añadieron 50 µL de cada dilución, además
se añadió 500 µL del hospedero. Las mezclas se agitaron suavemente y se depositarán en
placas de Petri que contenían 1,5% de la TSA con neutralizante. Las placas de Petri se
incubaron a 37° C durante 24 h y se midió la UFP/mL para cada muestra. Los efectos sobre
Av08 se determinaron por separado. Se incluyó un control (control absoluto) que consistía en
100 µL de bacteriófago y 3 mL de tampón de fosfato 0.1 M. También incluimos un 5% de control
negativo DMSO.

Figura 12. Unidades Formadoras de placa del bacteriófago Av08

34
 Capacidad Antibacteriana

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Los microorganismos se obtuvieron del laboratorio de Inocuidad Alimentaria del Centro de

Investigación e Innovación en Biotecnología, Agropecuaria y Ambiental (CIIBA) de ITSON.
Las bacterias Gram positiva Staphylococcus aureus (ATCC 65384) y Gram negativa
Escherichia coli O157 (ATCC 43890) se mantuvieron en caldo de soya tripticaseína (TSB) con
glicerol (20%) a -40 º C hasta su uso. Un asa de siembra de bacterias se transfirió a 10
mL de TSB y se incubó a 37 º C por 24 horas para su uso en los ensayos de inhibición.

Preparación de medios

El ensayo se realizó en agar Müeller Hinton, se colocó 10 mL de dicho agar a cada placa.

Prueba de susceptibilidad microbiana (Disco-Placa)

La actividad antimicrobiana se evaluó mediante la observación de zonas de inhibición de

crecimiento bacteriano descrito por Andrews (2001).Las placas de agar Müeller Hinton se
inocularon con 100 µL de suspensión bacteriana la cual se homogenizó mediante perlas de
vidrio estériles, se colocó 40 µL de extracto correspondiente (EtOH y Ac) en discos estériles de
papel filtro (5 mm de diámetro, Whatman N º1) los cuales estaban sobre las placas inoculadas
como se muestra en la figura 13. Las placas fueron incubadas a 37 °C por 24 horas para su
observación. Los tratamientos de control consistieron en discos impregnados con DMSO (5%).

35
 Figura 13. Placas inoculadas con bacterias y extracto

Análisis Estadístico

La evaluación de la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos se realizó a través

de experimentos independientes para cada tipo de extracto y de las especies microbianas
estudiadas. El diseño estadístico fue asignado completamente al azar con tres repeticiones. En
el análisis de los distintos tratamientos se asumió (P<0.05). Se utilizó el paquete estadístico Stat
Graphics versión 15.
El análisis estadístico utilizado para evaluar la supervivencia de los fagos fue al azar y
considerado tres factores. Los factores fueron el extracto, ya sea EtOH-ac o Ac; la
concentración, ya sea 5 o 10 mg /mL, y el tiempo de contacto, es decir, 0, 30 y 60 min. La
reducción viral se expresó como título de fago log10. Los tratamientos se llevaron a cabo por
duplicado con dos repeticiones cada una. Se utilizó Statgraphic para V.4.0 Windows® para
realizar el ANOVA y α = 0.05.

36
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Capacidad Antioxidante Mediante el Método DPPH y ABTS

El método de DPPH está basado en la capacidad que tiene dicho radical para reaccionar con
donantes de hidrógeno. El DPPH es un radical libre y estable, de coloración violeta en solución
metanólica y contiene un electrón desapareado, el cual es estabilizado en presencia de
antioxidantes, resultando una decoloración en la solución la cual aumenta con respecto al
número de electrones donado. Además, se ha demostrado que este ensayo puede ser utilizado
para la evaluación de la actividad captadora de radicales libres en matrices complejas como los
extractos vegetales (Jiménez y col., 2005).
En este estudio se evaluó la capacidad de los extractos EtOH-ac y Ac de barchata para
inhibir el radical DPPH. En la figura 14 se muestra la inhibición del radical. Se pueden observar
valores de inhibición de 25.03 ± 3.73 mmol ET/ge y 23.06 ± 0.24 mmol ET/ge para los extractos
Ac y EtOH-ac respectivamente. Se observaron diferencias significativas (p≤0.05), entre los
tratamientos, lo cual nos indica que la capacidad antioxidante de estos extractos está
influenciada por la naturaleza química de los solventes en la extracción de sustancias con
actividad biológica.

30
Capacidad Antioxidante (mmol ET/ ge)

25

20

15

10

0
Ac EtOH-ac

Figura 14. Capacidad antioxidante por medio del ensayo DPPH de extractos Ac y
EtOH-ac de barchata (Z. obtusifolia). Los valores son la media ± desviación
estándar (n=3). ET, Equivalente Trolox (homólogo de la vitamina C) ge, gramo de
extracto.
37
 Los resultados obtenidos en este estudio concuerdan con lo descrito por Kang y col.
(2003), donde realizaron ensayos de capacidad antioxidante de extractos naturales con
diferentes solventes tanto polares como no polares y concluyeron que en efecto la capacidad
antioxidante se ve influenciada por la polaridad del solvente utilizado ya que ciertas sustancias
bioactivas son más afines a ciertos solventes.
Actualmente, no existen investigaciones que documenten las propiedades antioxidantes
de Z. obtusifolia medidas por inhibición de radicales sintéticos como DPPH. Sin embargo, Dias y
col. en el 2013, observaron que extractos etanólicos de especies de Ziziphus poseen agliconas
que presentan capacidades de reducción de radicales libres hasta un 25%, lo que nos permite
suponer que los extractos presentan alta concentración de saponinas glucosiladas que reducen
la actividad del extracto. Así mismo, Navas y Carrasquero (2012), estudiaron la actividad
antioxidante que proporcionaban los extractos de Ziziphus mauritiana en el aceite refinado de
soya a altas temperaturas, observando una alta protección al aceite por dicho extracto, y
atribuyeron la actividad a la presencia de biofenoles, flavonoides y taninos. En esta
investigación se realizaron estudios preliminares de fenoles y flavonoides totales en los
extractos de Z. obtusifolia en donde se detectó la presencia de dichos componentes, sin
embargo, estos hallazgos aún siguen en estudio como una segunda etapa de la investigación.
Por otro lado, en este estudio también se midió la capacidad de los extractos para inhibir
el radical ABTS. Se fundamenta en la cuantificación de la decoloración del radical ABTS, debido
a la interacción con especies donantes de hidrógeno o de electrones. El radical catiónico ABTS
es un cromóforo que absorbe a cierta longitud de onda y se genera por una reacción de
oxidación del ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio) con persulfato
de potasio (Re y col., 1999).

38
 30

Capacidad Antioxidante (mmol ET/ge) 25

20

15

10

0
Ac EtOH-ac

Figura 15. Capacidad antioxidante por medio del ensayo ABTS de extractos Ac
y EtOH-ac de barchata (Z. obtusifolia). Los valores son la media ± desviación
estándar (n=3). ET en Equivalente Trolox (homólogo de la vitamina C) ge,
gramo de extracto.

La figura 15, muestra la capacidad antioxidante para los extractos en la reducción del
radical ABTS y se observan valores de 17.41 ± 0.01 mmol ET/ge y 23.35 ± 0.02 mmol ET/ge
para los extractos Ac y EtOH-ac respectivamente. Así mismo, se observa que los extractos
etanólicos acidificados mostraron mayor capacidad para inhibir este radical. Dorta y col. (2013)
han observado que los sistemas ácidos son más efectivos en la recuperación de compuestos
bioactivos, y que se favorece la hidrólisis de muchos enlaces como los glucosídicos, lo que
permitiría aumentar la actividad biológica de algunos compuestos en los extractos de barchata,
tales como el ácido glutámico y ácido aspártico los cuales se encuentran en la planta de
barchata (Moran y col., 2014) y de acuerdo con Wu. (2009) estas sustancias activas presentan
actividad antioxidante.

Capacidad Antioxidante Mediante la Prueba de Hemólisis

La peroxidación lipídica mediada por radicales libres es una de las causas más importantes en
la destrucción y daño en las membranas, debido a que los ácidos poli-insaturados de la

39
membrana celular son degradados a través de este proceso oxidativo con el consecuente
rompimiento de la integridad de la membrana (Ahn y col., 2007). Recientemente se han estado
utilizando medios biológicos como eritrocitos humanos, con la finalidad de determinar la
capacidad antioxidante de diversas sustancias bioactivas sobre la peroxidación lipídica de las
células. Este método está basado en la formación de hemólisis generada por el radical AAPH
[Dihidrocloruro de 2, 2-azobis (2-metil-amidinopropano)]. Este radical provoca la liberación del
hierro desde la hemoglobina, actuando como pro-oxidante. La liberación del hierro desde los
hematíes puede aumentar el efecto pro-oxidante de hidroperóxidos provenientes de la reacción
del oxígeno y el AAPH (Velioglu y col., 1998).
La figura 16 muestra la capacidad protectora de los extractos Ac y EtOH-ac sobre el
ertirocito humano. Se observó, que el porciento de inhibición de hemólisis fue de 46.3% y 32.6%
para los extractos Ac y EtOH-ac, respectivamente. Actualmente no existen estudios donde
evalúen la capacidad de los extractos de barchata para proteger al eritrocito humano, así
mismo, no existen antecedentes de la especie Ziziphus donde se haya evaluado esta misma
propiedad. Para fines de esta investigación se comparan los resultados con trabajos
semejantes.
Magalhaes y col. en el 2009, analizaron el porcentaje de inhibición de hemólisis de
extractos metanólicos del la cáscara y pulpa de membrillo y reportaron valores de 70 y 75%,
respectivamente. Por otro lado, se ha demostrado que compuestos como el ácido gálico,
elágico, clorogénico, quercetina, catequina, rutina, carotenoides entre algunos otros poseen un
efecto protector contra la hemólisis inducida de hasta 99% en eritrocitos humanos (Chirinos y
col., 2008; Hapner y col., 2010). Asimismo, se ha reportado que extractos de hojas de plantas
(Toona Sinensis) presentan valores de inhibición (75 a 85%) (Hseu y col., 2008).
En general, se observa que los diversos reportes muestran valores en el orden del 30%
al 40% superior a los encontrados en nuestro estudio. Esta divergencia se puede explicar a la
diversidad de técnicas utilizadas para obtener los extractos, o bien, a la composición de los
mismos.
Diaz y colaboradores en el 2013 reportaron que especies de Ziziphus contienen
saponinas, las cuales son capaces de causar hemólisis en los eritrocitos (Martínez, 2001), dicha
actividad se atribuye a la interacción de las saponinas con los esteroles de la membrana
eritrocitaria, que induce un aumento de la permeabilidad de la membrana y un movimiento de
iones provocando la entrada en exceso de agua y la salida del potasio, por lo que la membrana
explota, permitiendo de este modo la salida de la hemoglobina (Bruneton, 2001).

40
 Figura 16. Capacidad antioxidante por medio del ensayo de % de inhibición de
hemolisis inducida mediante AAPH de extractos acuosos y etanólicos
acidificados de barchata (Z. obtusifolia).

Capacidad Antibacteriana

La tabla 1 muestra la actividad antibacteriana presente en los extractos EtOH-ac y Ac, medida
en mm por halos de inhibición los cuales se observan en la figura 17. Se utilizaron dos
concentraciones 5 y 10 mg/mL. La capacidad para inhibir la bacteria E. coli O157 en el extracto
etanólico arrojó valores de 7.83 a 10.16 mm de diámetro, mientras que en el extracto acuoso los
valores de inhibición fueron de 7.83 a 8.00 mm. Para la bacteria Staphylococcus aureus el
extracto EtOH-ac mostró resultados de 8.00 a 9.00 mm de diámetro y en el extracto Ac se
obtuvo una inhibición de 8.00 a 9.06 mm. En un estudio similar de extractos de Zanthoxylum se
mencionan los halos de inhibición obtenidos de algunos antibióticos como tetraciclina con 9.00
mm para S. aureus y 10.00 mm para E. coli; antraciclina con 12.00 mm para S. aurues y 10.00
mm para E. coli; y kanamicina con 9.00 mm para S. aureus y E. coli (Patiño y col., 2011). En
general los resultados obtenidos de los dos tipos de extracto fueron muy similares por lo que los
dos tipos de extractos son considerados como buenos agentes antibacterianos para las
bacterias estudiadas.
Por otro lado, también se observa que al aumentar la concentración del extracto la
actividad contra las cepas evaluadas también incrementa. Lo cual nos indica que la actividad
antibacteriana de los extractos es dependiente de la concentración.

41
 Tabla 1. Capacidad antibacteriana de los extractos de Z. obtusifolia. Cada valor
representa la media de tres datos.

Concentración E. coli O157 S. aureus

Extracción
mg/mL Mm mm

EtOH-ac 5 7.83 8.00

10 10.16 9.00

Ac 5 7.83 8.00

10 8.00 9.06

Control: DMSO 5% 5 SA SA

10 SA SA

SA= Sin actividad; DMSO Dimetil sulfóxido

La barchata contiene sustancias bioactivas tales como los aminoacidos vanila o

leucina (Moran y col., 2014). A estos compuestos se les clasifica como bacteriocinas los cuales
son efectivos contra microorganismos patógenos importantes como Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella spp (Beristain y col., 2012), por lo que es
posible que estas sustancias pudieran estar contribuyendo en la inhibición de las bacterias
patógenas que se utilizaron en este estudio.
Por otro lado, en uno de los estudios realizados sobre especies a la que pertenece esta
planta se detectaron ciertas sustancias como taninos, saponinas, resinas, polifenoles y
glucósidos cardíacos (Abalaka, 2010). Así mismo, se ha informado que estos compuestos
tienen actividad antimicrobiana (Moran y col., 2014), lo que nos permite suponer también que
estas sustancias contribuyen en la inhibición de los microorganismos utilizados en este estudio,
los cuales son organismos patógenos de interés en la salud pública. Además, es conocido que
en los países en desarrollo, donde la medicina tiene alto valor en la economía, la investigación

42
de las actividades antibacterinas de plantas etnomedicinales siguen siendo una necesidad para
atacar estos tipos de patógenos, lo cual representa un área de oportunidad para tratar
padecimientos originados por estos organismos.

Figura 17. Halos de inhibición ocasionada por el

extracto EtOH-ac sobre E. coli O157

Capacidad Antiviral

Los extractos Ac y EtOH-ac fueron aplicados al bacteriófago Av08 para determinar la tasa de
supervivencia del virus y la dosis efectiva en el tiempo requerido y así observar la reducción del
virus causado por el efecto de los extractos. Las reducciones de las unidades formadoras de
placas en los distintos tratamientos se pueden observar en la figura 18.

43
 Figura 18. Reducción del bacteriófago Av08 causada por el
extracto EtOH-ac.

Las reducciones logarítmicas se pueden observar en la figura 19 para los extractos

EtOH-ac y figura 20 para los extractos Ac, los cuales muestran la reducciones del virus
expresadas en Log10 UFP/mL para tres tiempos de contacto: 0, 30 y 60 minutos, utilizando dos
concentraciones de 5 y 10 mg/mL. Así mismo, se puede observar que en ambos extractos en el
tiempo 0 minutos, no hubo una reducción significativa en comparación con el valor del control (p
<0,05), sin embargo, a los 30 minutos de tiempo de contacto se observa una reducción
significativa.
Por otro lado, en el extracto EtOH-ac en los primeros 30 minutos de contacto del fago
Av08 con el extracto, mostró reducciones de 1.5- 1.8 Log10 UFP/mL, para las concentraciones 5
y 10mg/mL respectivamente. En los tiempos máximos de contacto del extracto con el fago se,
observó una reducción de 4.30 Log10 UFP/mL al tiempo de contacto de 60 minutos para la
concentración de 5 mg/mL, y en la concentración 10 mg/mL al mismo tiempo, mostró una
reducción de 4.82 Log10 UFP/mL (figura 18).

44
 14

12
log10 UFP/ mL

10

5 mg/mL
6 10 mg/mL
Control PBS

4
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura 19. Actividad antiviral de los extractos EtOH-ac de Ziziphus obtusifolia

medida por la reducción en Log10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0, 30 y
60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL.

Figura 19. Actividad antiviral de los extractos acuosos de Ziziphus obtusifolia

medida por la reducción en Log10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0, 30 y
Para el extracto Ac en ambas
60 minutos concentraciones55mg/mL
a dos concentraciones y 10 mg/mL durante los primeros 30
y 10 mg/mL.
minutos no mostraron reducciones significativas, arrojando valores de reducción por el orden de
0.70 Log10 UFP/mL y fue hasta los 60 minutos que disminuyó 1.50 logaritmos en 5 mg/mL. Sin
embargo, la reducción no es alta al compararlo con la reducción mostrada a los 10 mg/mL,
posiblemente se debió al agotamiento y reducción de la biodisponibilidad de los metabolitos
activos o compuestos después de 30 min del tiempo de contacto con los extractos.
Investigaciones similares donde han estudiado la reducción de colifagos con extractos naturales
a bajas concentraciones, evaluando la tasa de supervivencia del colifago Av05, también han
encontrado que la mayor reducción en el título viral se produce en los primeros 20 minutos de
tratamiento, después de lo cual la reducción disminuye (Silva y col., 2014).

45
 También se observa que al aumentar la concentración a 10 mg/mL en el tiempo máximo
de contacto 60 minutos se observó una reducción de 7.40 Log10 UFP/mL. Dicha reducción fué la
más alta observada en este estudio antiviral con barchata (figura 20).

14

12
log10 UFP/mL

10

5 mg/mL
6
10 mg/mL
Control PBS

4
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura 20. Actividad antiviral de los extractos acuosos de Ziziphus obtusifolia

medida por la reducción en Log10 UFP/mL para los tiempos de contacto 0, 30
y 60 minutos a dos concentraciones 5 mg/mL y 10 mg/mL.

El bacteriófago ADN Av08, utilizado en este estudio fue previamente aislado de las
heces de aves de corral. Algunos estudios han demostrado que los bacteriófagos aislados de
aves de corral son parte de la microbiota del medio ambiente, lo que demuestra la ocurrencia
natural de fagos en el tracto intestinal. Así mismo, con ello se justifica su uso como modelo
enteroviral (López y col., 2011).

46
 En un estudio de determinación de aminoácidos, se encontró que barchata contiene
alanina, valina y leucina (Moran y col., 2014) los cuáles son sustancias que se le atribuye
capacidad antimicrobiana propias de algunas plantas (Beristain y col., 2012), por lo que éstas
sustancias pudieran ser la causa de la reducción viral encontrada en el presente estudio. Eun-
Hye y col. en el 2015, encontraron que los ácidos betulinicos derivados de Ziziphus jujuba
mostraron actividad antiviral contra el virus de la influenza A/PR/8 inducido en ratones. Además,
en un estudio donde se evaluó la actividad antiviral de plantas medicinales frente al virus del
Hepatitis B (VHB) en líneas celulares se encontró que extractos de Eucalyptus spp. mostraron
la mayor actividad antiviral de las plantas estudiadas, donde se dice que los compuestos
fenólicos son los responsables de dicha actividad inhibitoria y en el presente estudio se
encontró la presencia de éstos compuestos. Por lo que no se descarta la actividad de estos
compuestos como antiviral.

47
 CONCLUSIONES

 Los extractos EtOH-ac y Ac de Z. obtusiflolia, mostraron valores altos de capacidad

antioxidante al inhibir los radicales DPPH y ABTS.

 Los extractos EtOH-ac y Ac, presentaron una actividad media anti hemolítica, contra
la hemólisis inducida por el radical AAPH.

 Los extractos acuosos presentaron la mayor actividad biológica inhibiendo bacterias

patógenas como E. coli y S. aureus.

 Los extractos EtOH-ac y Ac, mostraron efectividad en la reducción del modelo

enteroviral Av08.

48
 RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar el análisis de los componentes individuales de los extractos EtOH-ac y

Ac, con el fin de comprobar de manera individual cuales son las sustancias que provocan la
actividad biológica encontrada en esta investigación.

49
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