Métodos Instrumentales de separación
Curso Académico 2014/2015
UCLM
PRÁCTICA 2. OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES –
MASAS (CG-MS) PARA LA DETERMINACIÓN DE
ANTIDEPRESIVOS (SERTRALINA Y CITALOPRAM)
EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
OBJETIVO
El objetivo principal de esta práctica es la separación y determinación de dos
antidepresivos empleando la técnica de separación de la cromatografía de gases, utilizando un
patrón interno para corregir las fluctuaciones que puedan afectar a la muestra.
Previamente llevaremos a cabo una optimización de los diferentes parámetros
instrumentales del método que afectan tanto a la etapa de inyección, separación y detección
de los antidepresivos.
INTRODUCCIÓN TEÓRICA
Equipo de de Cromatografía de Gases-Masas
El equipo de cromatografía de gases con el que trabajamos en esta práctica, va a estar
formado por las siguientes partes:
Gas portador: Será el encargado de hacer la función de fase móvl, que será la de
transportar los analitos a través de la columna. No debe interaccionar con ellos, por
ello utilizaremos el Helio, ya que es muy inerte químicamente.
Puerto de inyección: Es el sistema a través del cual vamos a inyectar la muestra (con
una jeringuilla) y circulará por el interior por un conducto llamado liner, por donde
también pasará la fase móvil arrastrando la muestra. Al fnal de este sistema tenemos
una válvula de salida que nosotros podemos controlar y que nos va a permitir
desechar parte del disolvente con el objetivo de no saturar la columna.
Columna cromatográfica: En ella se va a producir la separación de los compuestos en
función de la interacción con la fase estacionaria, tendrá un diámetro de 30 metros y
se colocará enrollada conectada tanto al inyector como al detector.
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Horno: La columna estará en su interior, y se podrán programar las mejores
temperaturas para poder llevar a cabo la separación. Se puede llevar a cabo el modo
isotérmico (T=cte) o el modo gradiente (Temperatura variable).
Detector: Medirá la señal correspondiente a cada compuesto, y como emplearemos el
detector de masas podremos identificar cada pico con su compuesto mediante el
espectro de masas obtenido.
PROCESO EXPERIMENTAL
OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
En esta primera parte de la práctica sobre una misma mezcla patrón que contiene los tres
analitos ( sertralina, citalopram e imipramina) en metanol se van a estudiar diferentes
parámetros cromatográficos con el fin de optimizarlos. Los diferentes cambios van a ir en
‘’cadena’’, es decir, se trata de una optimización secuencial.
- Influencia de la programación de la temperatura
Se estudia la influencia de tres programaciones distintas de la temperatura, manteniendo la
temperatura del inyector a 240ºC.
0,1º𝐶/𝑚𝑖𝑛
(1) 200º𝐶 (1𝑚𝑖𝑛) → 200º𝐶 (10𝑚𝑖𝑛) 𝑖𝑠𝑜𝑡𝑒𝑟𝑚𝑎
70º𝐶/𝑚𝑖𝑛
(2) 70º𝐶 (1 min ) → 280 º𝐶 (3𝑚𝑖𝑛) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎
70º𝐶/𝑚𝑖𝑛
(3) 100º𝐶 (1 min ) → 280 º𝐶 (3𝑚𝑖𝑛) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎
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En la siguiente tabla se muestran los parámetros obtenidos, así como los valores de la eficacia
y las resoluciones entre los picos cromatográficos para las tres programaciones:
Imipramina Sertralina Citalopram
tr(1) 5,100 8,000 9,600
tr(2) 5,109 5,485 5,561
tr(3) 4,520 4,887 4,960
A(1) 1,79E+07 2,83E+07 1,18E+07
A(2) 2,72E+07 1,45E+07 1,34E+07
A(3) 2,56E+07 1,98E+07 1,32E+07
W(1) 0,600 1,300 1,300
W(2) 0,046 0,052 0,003
W(3) 0,034 0,048 0,043
N(1) 1,16E+03 6,06E+02 8,73E+02
N(2) 1,97E+05 1,78E+05 5,50E+07
N(3) 2,83E+05 1,66E+05 2,13E+05
R(S-I) R(C-S)
1 3,05 1,23
2 7,67 2,76
3 8,95 1,60
Atendiendo a los valores de la tabla, seleccionamos el segundo gradiente de
temperatura(3), porque obtenemos una mejor resolución (R) entre los picos, sobre todo entre
el segundo y el tercero ya que son los que más próximos están entre sí. Además obtenemos un
mayor número de platos teóricos (N) en los compuestos. El segundo método tampoco estaría
mal, ya que los resultados de resoluciones y número de platos teóricos no difieren mucho de
los del tercer método.
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- Influencia de la temperatura del inyector
Teniendo en cuenta la programación de temperatura anterior seleccionada, a continuación se
realizan tres inyecciones cromatográficas variando la temperatura del inyector ( 150ºC - 200ºC
– 240ºC). en la siguiente tabla se recogen los mismos parámetros que en el apartado anterior:
INYECTOR Imipramina Sertralina Citalopram
tr(240º) 4,52 4,887 4,96
tr(200º) 4,578 4,953 5,026
tr(150º) 4,579 4,954 5,027
A(240º) 2,56E+07 1,98E+07 1,32E+07
A(200) 2,67E+07 3,20E+07 1,37E+07
A(150) 2,35E+07 2,15E+07 4,10E+06
W(240) 0,034 0,048 0,043
W(200) 0,035 0,052 0,05
W(150) 0,036 0,034 0,029
N(240) 2,83E+05 1,66E+05 2,13E+05
N(200) 2,74E+05 1,45E+05 1,62E+05
N(150) 2,59E+05 3,40E+05 4,81E+05
R(S-I) R(C-S)
240ºC 8,95 1,60
200ºC 8,62 1,43
150ºC 10,71 2,32
En vista de los resultados decidimos quedarnos con los 240ºC de temperatura del
inyector, aunque observamos que las resoluciones son mayores en el caso de los 150 ºC, pero
como entre el segundo y tercer pico que están más próximos entre sí tenemos una resolución
superior a 1,50 en la temperatura del inyector de 240ºC, tomamos la decisión de quedarnos
con esta temperatura. El número de platos teóricos (N) en algún compuesto es mayor a 150ºC
y en otro es mayor a 240 ºC, por lo que no nos impulsa tampoco a tomar partido por una
temperatura en concreto.
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- Influencia del tiempo de Splitless ( sin división de flujo)
En este apartado, se varía el tiempo durante el cual se cierra la válvula de división de flujo en la
etapa inicial de inyección de muestra. El tiempo de splitless ha sido de 1minuto durante los
procesos anteriores. Ahora, las variaciones serán : 0,5 min , 1 min y 1,5min. Los resultados
obtenidos se recogen en la siguiente tabla:
SPLITLESS Imipramina Sertralina Citalopram
tr(1min) 4,52 4,887 4,96
tr(0,5min) 4,128 4,511 4,588
tr(1,5min) 5,04 5,411 5,486
A(1min) 2,56E+07 1,98E+07 1,32E+07
A(0,5min) 2,72E+07 2,23E+07 1,55E+07
A(1,5min) 2,73E+07 1,68E+07 1,41E+07
W(1min) 0,034 0,048 0,043
W(0,5min) 0,041 0,041 0,05
W(1,5min) 0,042 0,033 0,043
N(1min) 2,83E+05 1,66E+05 2,13E+05
N(0,5min) 1,62E+05 1,94E+05 1,35E+05
N(1,5min) 2,30E+05 4,30E+05 2,60E+05
R(S-I) R(C-S)
1min 8,95 1,60
0,5min 9,34 1,69
1,5min 9,89 1,97
Seleccionamos como tiempo de splitless mejor el de 0,5min, principalmente porque
ahorraremos en tiempo de análisis, y además tenemos una muy buena resolución entre el
segundo y tercer pico ( R mayor que 1,5). Además en cuanto a la eficiencia, tampoco difiere
mucho con respecto a los otros tiempos de splitless, aunque bien es cierto que los compuestos
no son los que mayor número de platos teóricos tienen en este modo.
- Influencia del modo de adquisición de espectros de masa sobre la sensibilidad o
relación S/N.
Primero se obtienen los espectros de masas en SCAN de la mezcla patrón anterior que
contiene todos los analitos. A partir del cromatograma de SCAN seleccionamos los picos
principales de cada compuesto ( monitorización selectiva de iones, SIM).
Se realiza la comparación a nivel de sensibilidad calculando el valor de la relación Señal – Ruido
(S/N) para las dos modalidades.
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Este proceso se ha realizado solo para un pico, en este caso, para la imipramina. Se mide el
ruido de justo después del pico, que será más o menos igual al ruido presente en el pico.
SCAN.
6
𝑆⁄ = 26,2 · 10 = 415,13 (𝑠
𝑁 63112 ⁄𝑛)
SIM.
6
𝑆⁄ = 5,23 · 10 = 1228,85 (𝑠
𝑁 4256 ⁄𝑛)
Es más sensible la relación S/N en la modalidad SIM. Mayor relación señal/ruido es mejor.
DETERMINACIÓN DE CITALOPRAM, SERTRALINA E IMIPRAMINA MEDIANTE CG-MS EN
FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
Segunda parte de la práctica. Se preparan 4 disoluciones patrón (en metanol) con
concentraciones variables de sertralina y citalopram. La imapramina mantendrá constante su
concentración en todas las disoluciones, debido a que es el patrón interno. La concentración
de patrón interno, será siempre 10mgL-1 .
En la siguiente tabla se recogen los volúmenes que hay que adicionar a cada disolución
(preparadas en matraces aforados de 25mL).
Concentración (mgL- Citalopram (mL) Sertralina (mL) Imipramina (mL)
1
)
5 0,5 0,5 1
10 1 1 1
15 1,5 1,5 1
20 2 2 1
Los patrones se inyectarán en las condiciones cromatográficas seleccionadas en el proceso de
optimización llevado a cabo anteriormente ( Gradiente de temperatura de 100ºC280ºC , con
temperatura del inyector a 240ºC , y splitless 0.5minutos).
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Las áreas obtenidas se muestran en la siguiente tabla junto con las áreas relativas.
A(imipramina) A(sertralina) Ar(ser.) A(citalopram) Ar(cit.)
5ppm 4,32E+06 1,64E+06 3,80E-01 2,01E+06 4,65E-01
10ppm 3,62E+06 2,99E+06 8,26E-01 4,45E+06 1,23E+00
15ppm 3,44E+06 5,62E+06 1,63E+00 6,97E+06 2,03E+00
20ppm 3,33E+06 7,04E+06 2,11E+00 7,54E+06 2,26E+00
Se representa las áreas relativas frente a la concentración obteniendo las siguientes rectas de
calibrado para los analitos:
En la recta de calibrado del citalopram, decidimos quitar el último punto (c=20 ppm) porque se
desviaba mucho de la línea recta que estábamos obteniendo en la representación.
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- Aplicación en formulaciones farmacéuticas
Una pastilla de sertralina y dos pastillas de citalopram ( disoluciones por separado en
distintos matraces ) son disgregados en morteros hasta la obtención de un polvo fino , que
será arrastrado con metanol con cuidado a un matraz aforado de 100mL y se diluye hasta la
marca con metanol. El mismo proceso se realiza para los dos fármacos.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑒𝑟𝑡𝑟𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎 = 50𝑚𝑔/𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐶𝑖𝑡𝑎𝑙𝑜𝑝𝑟𝑎𝑚 = 20𝑚𝑔/𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎
Las dos disoluciones de nuestros fármacos se llevan a un ultrasonidos durante 5 minutos
dejándolos decantar durante aproximadamente 10minutos más.
De los sobrenadantes de las disoluciones , se toman alícuotas de manera que la concentración
final de ambos sea de 10mgL-1 y se llevan a un matraz aforado de 10mL, se adiciona además
una alícuota del patrón interno ( imipramina) correspondiente a una concentración de 5mgL -1 .
Teniendo en cuenta que añadimos dos pastillas de citalopram, las cantidades que necesitamos
coger de la disolución de 100 mL para llevarla a la de 10 mL, en cada caso son:
Citalopram 0,25mL al matraz de 10mL
Sertralina 0,2mL al matraz de 10mL
Imipramina 1mL
Los resultados obtenidos de las áreas se llevan a la recta de calibrado obteniendo la
concentración :
Muestra Sertralina
Aimipramina Asetralina Arel
5,60E+06 4,86E+06 8,68E-01
C
9,42E+00
Muestra citalopram
Aimipramina Acitalopram Arel
3,70E+06 3,67E+06 9,92E-01
C
8,41E+00
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- Resultados
SERTRALINA. Concentración muestra problema en ppm y molaridad. Cantidad de fármaco por
pastilla.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 9,42 𝑝𝑝𝑚 (𝑚𝑔𝐿−1 )
9,42 · 10−3 𝑔 1𝑚𝑜𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = −1 𝑥 = 3,1 · 10−5 𝑀 (𝑚𝑜𝑙𝐿−1 )
𝐿 306,229 𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑟𝑡𝑟𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎 → 9,42𝑝𝑝𝑚 𝑥 10𝑚𝐿 = 𝐶(𝑝𝑝𝑚)𝑥 0,2𝑚𝐿 ;
𝐶 = 471 𝑝𝑝𝑚
𝑇𝑒𝑛𝑖𝑒𝑛𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑎 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 → 471 𝑚𝑔𝐿−1 𝑥 0,1 𝐿 = 47,1 𝑚𝑔
𝟒𝟕, 𝟏 𝒎𝒈/𝒑𝒂𝒔𝒕𝒊𝒍𝒍𝒂
CITALOPRAM. Concentración muestra problema en ppm y molaridad. Cantidad de fármaco por
pastilla.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 8,48 𝑝𝑝𝑚 (𝑚𝑔𝐿−1 )
8,48 · 10−3 𝑔 1𝑚𝑜𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = −1 𝑥 = 2,61 · 10−5 𝑀 (𝑚𝑜𝑙𝐿−1 )
𝐿 324,392 𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑟𝑡𝑟𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎 → 8,48𝑝𝑝𝑚 𝑥 10𝑚𝐿 = 𝐶(𝑝𝑝𝑚)𝑥 0,25𝑚𝐿 ;
𝐶 = 339,2 𝑝𝑝𝑚
𝑇𝑒𝑛𝑖𝑒𝑛𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑎 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 → 471 𝑚𝑔𝐿−1 𝑥 0,1 𝐿 = 33,92 𝑚𝑔
33,92
𝐶ó𝑚𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑡𝑒𝑛í𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑎𝑠𝑡𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 → = 17𝑚𝑔
2
𝟏𝟕 𝒎𝒈/𝒑𝒂𝒔𝒕𝒊𝒍𝒍𝒂
