UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL BIOLOGIA – MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA N°02
COLORANTES Y COLORACIONES

Asignatura:
Microbiología

Docente:
Dr. Blgo – Mblgo. Cesar Julio Cáceda Quiroz

Alumnas encargadas:
Jackeline Yulissa Arias Thula 2019-118025
Dannery Ruby Padilla Mamani 2015-118032

TACNA-PERÚ
2021
 PRACTICA N°02: COLORANTES Y COLORACIONES

I. INTRODUCCIÓN

En Microbiología, las tinciones son herramientas fundamentales utilizadas en los

laboratorios, tanto para diagnósticos de enfermedades infecciosas o como estudio de
bacterias. Encontramos gran variedad de tinciones para la detección de los diferentes
agentes infecciosos en los que se incluye bacterias, parásitos y hongos (López, L.E.;
2013).
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar
grandes cortes de tejido o poblaciones celulares (Briceño , 2013).
Dado que el citoplasma microbiano suele ser transparente, es necesario teñir los
microorganismos antes de que puedan observarse con el microscopio óptico. En algunos
casos, la tinción es innecesaria, por ejemplo, cuando los microorganismos son muy
grandes o cuando se va a estudiar la motilidad, y se puede colocar una gota de los
microorganismos directamente sobre el portaobjetos y observar. Una preparación como
esta se llama montaje húmedo. También se puede preparar un montaje húmedo colocando
una gota de cultivo en un cubreobjetos (una cubierta de vidrio para un portaobjetos) y
luego convirtiéndolo en un portaobjetos ahuecado. Este procedimiento se llama gota
colgante.
En preparación para la tinción, se coloca una pequeña muestra de microorganismos en un
portaobjetos y se deja secar al aire. La mancha se fija con calor pasándola rápidamente
sobre una llama. La fijación por calor mata los organismos, hace que se adhieran al
portaobjetos y les permite aceptar la mancha.
Por ejemplo, la Tinción Gram se trata de una técnica de tinción diferencial que nos va
permitir distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas en función del grado
de permeabilidad de las paredes celulares al disolvente aplicado durante la tinción. Los
filamentos Gram positivos se observan de color azul-violeta, y los de Gram negativos de
color rosado (Salas, M.; 2021).
II. OBJETIVO:

● Objetivo General:

Evaluar las diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares de

microorganismos.

● Objetivos Específicos:

- Analizar diversas técnicas para la identificación y observación de preparados

microbiológicos, empleando técnicas de tinción.
- Justificar los principios teóricos y los fundamentos en los cuales se basan las
técnicas de tinción en microbiología.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

- Láminas portaobjetos
- Láminas cubreobjetos
- Agua destilada
- Mechero Bunsen
- Mechero de alcohol
- Colorante Wright
- Varillas de tinción
- Asa bacteriológica
- Lugol
- Nigrosina o tinta India.
- Medio de cultivo con el microorganismo.
- Tinta china o nigrosina.
- Solución salina fisiológica.
- Solución Buffer de fosfato
- Leche tornasolada.
- Cristal violeta al 1%.
- Sulfato de cobre al 20%.
 - Aceite de inmersión.
- 100 ml etanol
- 100 ml Fenol
- 100 ml Fucsina
- 100 ml Safranina
- 100 ml Alumbre de potasio
- 100 ml Alumbre de potasio

Método

Cada una de las siguientes tinciones/coloraciones está descrita en la parte de resultados

con su respectivo fundamento y algunas imágenes (ejemplos) de muestras teñidas.

1. Coloración simple
2. Coloración doble
3. Coloración neutra
4. Coloración Gram
5. Coloración Ziehl Neelsen
6. Tincion de Schaeffer - Fulton
7. Coloración de cápsulas

IV. RESULTADOS

1. COLORACIÓN SIMPLE

La tinción simple es un procedimiento de tinción rápido y sencillo en el cual se emplea

un solo colorante, por eso se denomina simple. Se utiliza principalmente para determinar
la morfología y la organización de las células presentes en una muestra.

Naturalmente las células no tienen color, por lo que es necesario hacerlas visibles de
alguna manera cuando se observan en el microscopio (Briceño , 2013).
Fundamento:

Una tinción simple se fundamenta en la afinidad que va a tener la pared bacteriana por un
colorante que puede ser de naturaleza básica o ácida. Es una técnica de decantación en la
que se hace uso de los puentes de tinción, en los que se colocan los portaobjetos con las
preparaciones secas y fijadas.

Se usa un solo colorante para teñir la pared bacteriana y observar así su morfología y
agrupación. No sirve para visualizar estructuras puesto que rara vez se tiñen.

Los colorantes más utilizados son azúl de metileno, fucsina, verde malaquita, violeta de
genciana, cristal violeta, verde janus y rojo fenol (Rodríguez, 2017).

Procedimiento:

1. Realizar la extensión sobre un portaobjetos a partir de la muestra.

2. Dejar secar al aire.
3. Fijar la extensión con calor.
4. Teñir el portaobjetos por decantación, y esperar el tiempo necesario según
el colorante utilizado:
a. Azul de metileno: 1 minuto.
b. Violeta de genciana: 30-45 segundos.
c. Cristal Violeta: 15 segundos.
d. Fuchsinas y safraninas: 1 minuto.
5. Lavar la preparación con agua destilada para eliminar el exceso de
colorante.
6. Dejar secar la preparación al aire.
7. Observar la preparación al microscopio óptico.
 Figura 1: Tinción simple de azul de metileno
Fuente: Google imágenes

Ejemplos de muestras con tinción simple

Figura 2: Observación microscópica de bacilos, diplococos, espirilos y cocos

Fuente: Google imágenes

● Bacilos y diplobacilos: Bacterias en forma de bastón, violeta

● Spirilla: bacteria en forma de espiral, violeta
● Cocos: bacterias de forma esférica, violeta
2. COLORACIÓN DOBLE

Fundamento:
Esta coloración en particular se caracteriza por emplear en su procedimiento dos
colorantes uno de carácter ácido como es la Eosina y el otro colorante presenta un
carácter básico como la Hemateina. Es la más empleada en histología.(Kumar, G. L.
2010). Se utiliza rutinariamente en los laboratorios de histopatología, ya que proporciona
al patólogo/investigador una visión muy detallada del tejido. Esta información es a
menudo suficiente para permitir un diagnóstico de enfermedad basado en la organización
de las células y también muestra cualquier anormalidad o indicadores particulares en las
células reales (Anderson, J.; An introduction to routine and special staining).

Procedimiento:
1. Lo primero que realizaremos es una extensión o un frotis de la muestra a estudiar
sobre un portaobjetos.
2. Para un mejor procedimiento fijamos la muestra a estudiar al portaobjeto con
alcohol y dejaremos secar a temperatura ambiente o con calor moderado del
mechero.
3. Se agrega el colorante “Hemateina” y dejaremos durante unos 3 a 5 minutos que
actúe sobre la muestra estudio.
4. Posteriormente, agregaremos agua destilada en un periodo de 1 a 2 minutos, para
homogeneizar.
5. Luego agregaremos un colorante, este colorante será la Eosina y este deberá
cubrir la muestra estudio, para ello dejaremos que actúe por un periodo de 5 a 10
minutos.
6. Quitaremos el exceso con agua corriente con mucho cuidado sin mucha presión
del caño.
7. Secaremos nuestro preparado a temperatura ambiente o con ayuda del mechero y
observaremos mediante el microscopio con el objetivo de inmersión.
3. COLORACIÓN NEUTRA

Fundamento:
La tinción de Wright nació de la tinción de Romanowsky, que consiste en una solución
de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina Y) y otro básico (azul de metileno) y
sus productos de oxidación.
La mezcla de colorantes usados en la tinción de Wright provoca el efecto conocido como
Romanowsky, es decir, proporciona una hermosa coloración púrpura a los núcleos de los
leucocitos y a los gránulos neutrofílicos, mientras que los glóbulos rojos se tiñen de color
rosado.
Los componentes responsables de dar la gama de colores típica de la tinción de Wright
son el azul B y la eosina Y. El efecto observado dependerá del enlace de los colorantes a
las estructuras químicas y a las interacciones del azul B y la eosina Y.

Procedimiento:

- Coloración neutra: sangre capilar

1. Desinfectar con alcohol la yema del dedo mayor

Figura 03:
Fuente: Google imágenes

2. Con la ayuda de una lanceta pasar a realizar un pinchazo

 Figura 04:
Fuente:[Link]
alergias-lavado-nid2357337/

3. Colocar una gota de sangre en un extremo de la lámina

Figura 05:
Fuente: [Link]

4. Con la ayuda de otra lámina y formando un anglo de 45° pasar a realizar una
extensión de la muestra.
Figura 06:. Procedimiento para realizar el extendido de sangre periférica
Fuente: [Link]
 5. Dejar secar la muestra extendida
Figura 07:
Fuente: [Link]
6. Cubrir la lámina con dos o tres gotas de colorante Wright o Leishmans por 3
minutos.
Figura 08: Frotis con Wright
Fuente: [Link]

7. Agregar a la muestra agua destilada por 4 minutos

Figura 09:
Fuente: [Link]

8. Lavar la lámina con agua de grifo

9. Dejar secar
 10. Observar al microscopio con 40x y 100x
Figura 10: Puntos violetas: Plaquetas
Fuente: [Link]
4. COLORACIÓN GRAM

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se

manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que
utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas. En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya
que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de
manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales
microorganismos causantes de una infección (Lopez, L.E.; 2013).

Fundamento:
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual
tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca
lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación
de un complejo cristal violeta yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la
pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa
de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes
orgánicos, como la mezcla de alcohol acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener
una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras
que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de
 contra tinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal
violeta-yodo.
La tinción Gram tiene como objetivo diferenciar a las bacterias dividiéndolas en dos
grandes grupos. Bacterias Gram positivas son aquellas que van a retener la tinción de
Azul-violeta; y Gram negativas a las que se van a decolorar para teñirlas con safranina
(P. Rodriguez, 2018).

- Gram positivas: Se tiñen de color violeta. Debido a la pared formada por una capa
gruesa de peptidoglicano (también llamado mureína) que va retener el primer
colorante Azul-violeta. (Campbell, Reece, J.B; 2002)

- Gram negativas: Se tiñen de color rosado. Debido a que su pared está conformada
por una capa delgada de peptidoglicano y una capa externa con lipoproteínas y
lipopolisacáridos. A raíz de esta estructura, el primer colorante es extraído luego del
lavado con etanol, fijándose el segundo colorante Safranina (Campbell, Reece, J.B;
2002).

Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra como
Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tinción Gram
variable secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o concentración de
electrolitos. No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica, ya que carecen de
pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos). Las muestras
útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados,
crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se
observan de color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se
observan de color rosa a rojo (Campbell, Reece, J.B; 2002).

Procedimiento:

Preparación de la muestra
1. Con una Asa de Kolle, previamente esterilizada al calor, tomar una pequeña
muestra.

2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas, dejándolos secar.

 Figura 11: Extensión y homogeneización de la muestra.
Fuente: [Link]
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/[Link]

3. Fijar el frotis pasando el portaobjetos sobre la llama del mechero (zona

azul), con la muestra hacia arriba.

Figura 12: Fijación

Fuente: [Link]
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/[Link]

Pasos de la coloración:
1. Cubre el frotis con cristal violeta durante 1 min. Se retirará el colorante
mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta,
para no desprender la muestra.
 Figura 13:
Fuente: Google imágenes

2. Cubrir con Lugol durante 1 min, y después se realizará otro lavado suave.
Todas las células se teñirán de violeta.

Figura 14:
Fuente: Google imágenes
3. Se retirará el colorante con etanol, goteando por el portaobjetos, hasta que
las gotas que salen no tengan casi color. Las células Gram negativas
pierden el colorante violeta y quedarán incoloras.

Figura 15:
Fuente: Google Imágenes

4. Las Gram positivas seguirán violeta.

5. Añade una gota de agua a la preparación y cubre 1 min. con safranina
(colorante de contraste).
 Figura 16:
Fuente: Google imágenes

6. Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las
bacterias Gram negativas, que quedarán rojas. Las Gram positivas
seguirán violetas.

Figura 17:
Fuente: Google imágenes

7. Seca las preparaciones sobre papel de filtro y observamos con

microscopio utilizando el objetivo de inmersión.
 Figura 18:
Fuente: Google imágenes

8. En esta tinción diferencial las bacterias Gram negativas aparecen rojas y

las Gram positivas violeta.

Figura 19: Pasos para realizar la tinción.
Fuente: [Link]
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/[Link]
 Figura 20: Staphylococcus aureus, tinción Gram, 100x
Fuente: [Link]
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/[Link]

5. TINCIÓN DE ZIEHL - NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico rutinario

de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda
realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite diferenciar a las
bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-
ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tinción para identificar bacilos
ácido-alcohol resistentes (BAAR) es del 74%. (Chen. P. 2012)

Figura 21: Representación esquemática de la pared celular de las micobacterias

 Tinción diferencial ácido alcohol resistentes.
La ácido-alcohol (AAR) es la capacidad que tiene un material biológico de formar
complejos ácido-estables con colorantes arilmetánicos. Las estructuras o bacterias así
teñidas no son decoloradas al exponerlas a mezclas de alcohol-ácido o a determinadas
concentraciones de ácidos minerales. Muchas estructuras y bacterias son AAR. Aquí
interesan especialmente las micobacterias, la queratina, los gránulos secretorios de las
glándulas sudoríparas, los gránulos de los mastocitos y los espermatozoides. Las cuatro
últimas estructuras mencionadas pueden originar interpretaciones erróneas de la
coloración de Z.N (De Naranjo, P.J; 1988).

Figura 23: Gránulos ácido-alcohol

resistentes. Glándulas sudoríparas ecrinas
Fuente: De Naranjo P.J; 1988

Figura 22: Fórmula estructural de tres colorantes

arilmetanicos: Fucsina, cristal violeta y auramina
Fuente: De Naranjo P.J; 1988

Figura 24: Citoplasma granular A.A.R

mastocitos
Fuente: De Naranjo P.J; 1988

Procedimiento:
Según De Naranjo, P.J; 1988. Los colorantes usados para la demostración de la AAR
son compuestos aniónicos. Los tres se usan en soluciones fenoladas (ácido
carbólico). Los gérmenes se ven como bacilos rojos cuando se usa la fucsina, violeta
púrpura con el cristal violeta, y con fluorescencia amarillo-verdosa cuando se usa
Auramina O. La mejor AAR se obtiene con el cristal violeta pero la falta de un
contraste de fondo adecuado para este colorante hace que se use más la fucsina; no se
ha demostrado que la Auramina O sea más sensible y específica que la fucsina;
además requiere del uso de microscopio de fluorescencia.

1. Preparar un frotis bacteriano.- Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio

y seco, siguiendo las precauciones de
esterilidad.

Figura 25:
Fuente: Google imágenes

2. Secado del frotis.- Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.

Figura 26:
Fuente: Google imágenes
3. Calentar la muestra.- La muestra se debe calentar aplicando fuego al
portaobjeto por debajo. Se puede hacer una fijación con alcohol cuando el
frotis no se ha preparado con esputo (tratado con hipoclorito de sodio para
blanquearlo) y si no se va a teñir inmediatamente. M. tuberculosis se elimina
con lejía y durante el proceso de tinción. La termofijación del esputo no tratado

no matará a M. tuberculosis, mientras que la fijación con alcohol es

bactericida.

Figura 27:
Fuente: Google imágenes

4. Cubrir la mancha.- La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina

(colorante básico primario).

Figura 28:
Fuente: Google imágenes
5. Calentar la mancha.- Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un
desprendimiento de vapor (aproximadamente a 60 °C). Es importante no
sobrecalentar y evitar quemar la muestra. Con relación al calentamiento de la
mancha, se debe tener mucho cuidado al calentar el carbol fucsina,
especialmente si la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente
en el que se hayan recogido productos químicos altamente inflamables de la
tinción previa. Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los
portaobjetos usando un hisopo encendido previamente humedecido con unas
gotas de alcohol ácido, metanol o etanol al 70 %. Evitar usar un hisopo grande
empapado en etanol porque esto es un riesgo de incendio.

Figura 29:
Fuente: Google imágenes

6. Lavar la mancha.- Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del
grifo no está limpia, lavar el frotis con agua filtrada o destilada,
preferiblemente.

Figura 30:
Fuente: Google imágenes
 7. Cubrir el frotis con alcohol ácido.- Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La
cobertura se lleva a cabo durante 5 minutos o hasta que el frotis esté lo
suficientemente decolorado, es decir, de color rosa pálido. Hay que tomar en
cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo tanto, debe usarse con mucho
cuidado. Se debe evitar estar cerca de fuentes de ignición.

Figura 31:
Fuente: Google imágenes

8. Lavar la mancha.- El lavado debe ser con agua limpia, destilada.

Figura 32:
Fuente: Google imágenes

9. Cubrir el frotis con colorante.- Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o
azul de metileno (0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el tiempo más
prolongado si el frotis es delgado.

Figura 33:
Fuente: Google imágenes

10. Lavar la mancha.- Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).

 Figura 34:
Fuente: Google imágenes

11. Drenar.- Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la mancha
en un estante de drenaje, para que esta se seque al aire (no usar papel
absorbente para el secado).

Figura 35:
Fuente: Google imágenes

12. Examinar el frotis en el microscopio.- Debe usarse el objetivo de 100X y el

aceite de inmersión. Escanear el frotis sistemáticamente y anotar las
observaciones pertinentes.

Figura 36: Observación microscópica

Fuente: Google imágenes
 Resultados:

● Los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido-alcohol

resistente positivos (AAR+).
● Si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante
utilizado como contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos
(AAR-).

Figura 37: Mycobacterium tuberculosis visualizada con tinción de Ziehl-Neelsen

fuente:Google imágenes

6. TINCION DE SCHEFFER - FULTON

La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, es utilizada

ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas, generalmente pertenecientes
a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las cuales son patógenas por naturaleza.
Sin embargo, debido a su resistencia característica, en muchos casos las endosporas
bacterianas resisten la coloración, dificultando la percepción de las mismas.(Beck, RW.
2000)
La tinción de Scheffer Fulton permite observar esporas, Cuerpos fructíferos, Conidias,
Células gematales.

Fundamento:

Las endosporas son formas de resistencia altamente deshidratadas y con una serie de
cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir, excepto si se
calienta la preparación para permeabilizarlas (Rodríguez E, Gamboa M, Hernández F,
García J, 2005).

En la tinción de Schaefer Fulton el colorante primario (verde de malaquita) se introduce

en la espora mediante el calentamiento a emisión de vapores de la preparación. El verde
de malaquita es soluble en agua y tiene una baja afinidad por el material celular, por lo
que las células vegetativas y las células madre de esporas pueden decolorarse con agua y
contrateñir con safranina (colorante de contraste) por la cual si tienen afinidad (Leboffe
MJ, Pierce BE.,2008).

Procedimiento:

1. Colocar en el portaobjetos una microgota de agua

Figura 38: Coloración de microgota

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

2. Realizar una extensión con el material a estudiar y homogeneizar con la

ayuda de una asa bacteriológica.

Figura 39: Extensión y homogeneización de la muestra

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez
3. Fijar el frotis con calor pasando el portaobjetos de 3 a 4 veces por encima de
la llama del mechero bunsen, cuidando que no se exceda la temperatura de
exposición al calor, empleando como referencia que el calor del portaobjetos
pueda ser tolerable para la parte interna de la mano.

Figura 40: Fijación del preparado

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

4. Colocar las gotas necesarias de verde de malaquita para cubrir la muestra y

calentar la emulsión de vapores con el calor directo del mechero bunsen por
15 min. La aplicación de calor debe ser por 3 segundos y alejado de la flama
del portaobjetos con la muestra por 30 segundos.

Figura 41: Calentamiento a emulsión empleado en verde de malaquita.

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

5. Lavar el preparado con agua.

6. Colocar las gotas necesarias de safranina durante 3 minutos.

 Figura 42: Aplicación de safranina
Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

7. Lavar con agua

Figura 43: Lavado del preparado

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

8. Dejar al aire y observar al microscopio a 40X Y 1000X.

Figura 44: Observación al microscopio

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

Luego del montaje al microscopio óptico, se observaron bacilos Gram positivos

esporulados; asimismo se apreciaron esporas solitarias de forma circular y bacilos que no
presentaban formación de esporas. Las esporas teñidas de verde y otras bacterias teñidas de
rosado.

Figura 45: Bacillus cereus , tincion de Schaeffer Fulton 100X

Fuente: UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

Figura 46: Cepas teñidas con 24 horas de incubación “Bacillus cereus”

Fuente: PACAL MEDLAB , Enero, 2013
 Figura 47: Cepas teñidas con 48 horas de incubación “Bacillus cereus”
Fuente: PACAL MEDLAB , Enero, 2013

7. COLORACIÓN DE CÁPSULAS (TINCIÓN NEGATIVA)

Fundamento:
Las cápsulas, por sus características químicas, no se tiñen por lo general con colorantes
básicos como el cristal violeta o la safranina. Sin embargo, se pueden observar
indirectamente mediante tinción negativa con tinta china, ésta emplea una solución
colorante en la cual el cromógeno es ácido y posee una carga negativa, la cual repele a la
célula cargada negativamente, por lo que dicha célula permanece sin teñir contra un
fondo coloreado. Además, este colorante está compuesto por partículas finas de carbono
suspendidas en agua formando un auténtico coloide. Las partculas son demasiado
grandes para penetrar a través de la matriz de la cápsula, por lo que sólo se teñirá el
medio circundante y las células aparecerán sin teñir sobre un fondo de color negro
(Leboffe MJ, Pierce BE.,2008)

Procedimiento:
1. Tomar una pequeña muestra del microorganismo sembrado en el medio de cultivo
(levadura) y colocarlo en el centro del portaobjetos.
2. Añadir al portaobjetos una gota de nigrosina o de tinta china.
3. Mezclar con el asa de siembra estéril y realizar una extensión.
4. Dejar secar la extensión a temperatura ambiente.
5. Observar la preparación en el microscopio óptico (Rodríguez, 2017).
 Figura 48: Tinción con tinta china, Klebsiella pneumoniae 100X
Fuente:UNAM, Roberto C. Gonzales Meléndez

V. DISCUSIÓN:

Las coloraciones o tinciones en microbiología se constituyen en el primer paso del proceso

del análisis en el laboratorio para la identificación presuntiva de agentes infecciosos. En el
análisis microbiológico, el microscopio es la principal herramienta que se utiliza de forma
rutinaria, por cuanto suministra información sobre la morfología, asociación y afinidad por
la o las coloraciones para la identificación presuntiva o definitiva de los microorganismos
(Corrales Ramírez, L. C., & Caycedo Lozano, L. ,2020).

Según William Grizzie en el 2001. Al fijar la muestra con calor es esencial para que las
células se adhieran al portaobjetos, ya que el calor desnaturaliza las proteínas además
pretende no sólo la conservación de la microanatomía, sino además de los componentes
químicos tisulares.

En el caso de la tinción Gram esta consiste en decolorar con alcohol, para que no queden
residuos ya que los Gram positivas no se decoloran porque sufren deshidratación y hace que
el colorante no salga de la célula. Las Gram negativas van a tomar un color rojo de la
safranina (Bartha, R.; 2001).
En la actualidad, se están desarrollando principalmente tres técnicas distintas de nanoscopías
ó microscopía de fluorescencia de alta resolución, cuyo fundamento y aplicaciones
comentaremos muy brevemente. La primera técnica de imágenes de alta resolución,
caracterizada en 1994, es la denominada STED (Stimulated Emission Depletion). Esta
técnica combina dos fuentes de iluminación láser, con el fin de romper el índice de
difracción. El primer láser, denominado de excitación, emite a la longitud de onda necesaria
para excitar el fluorocromo utilizado. El segundo ó láser STED se fija a una longitud de
onda mas larga, que inactiva rápidamente al fluorocromo. Utilizando este esquema se ha
conseguido hasta un poder de resolución de 20 nm. Otra alternativa tecnológica es FPALM
(Fluorescente-Photoactivation Localization Microscopy) que consigue resoluciones de 10
nm y se emplea generalmente en la localización génica ó proteica, utilizando como sonda la
GFP (“Green fluorescent protein) ó sus derivados. El método FPALM se ha aplicado, por
ejemplo, para estudiar la dinámica de citoesqueleto bacteriano. Por último, otra metodología
de alta resolución es STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) que, al igual
que la anterior, tiene resolución a nivel de nanoescala y proporciona imágenes en tres
dimensiones. Sin duda, esta microscopía de fluorescencia de super-resolución es una
herramienta eficaz, alternativa a la microscopía electrónica de transmisión, que va a
proporcionar detalles inéditos de la estructura subcelular y funcionamiento de las células
procariotas (Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M. I., & Serrano, S, 2011).

VI. CONCLUSIONES:

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico oportuno

y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión
del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar la tinción adecuada
de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones
son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico
microbiológico.

La efectividad de cada tipo técnica de tinción depende relativamente del espécimen que se
requiere observar, ya que en el caso de la tinción Gram, la cual sirve para la diferenciación y
visualización de bacterias, mediante el principio de teñir la pared de las bacterias de color
morado, permite identificar la presencia de bacterias gram positivas que caso contrario el
color fuese rosado serian Gram negativas. Esta técnica es de suma utilidad en la
identificación de bacterias patógenas causantes de infecciones.
Por otra parte la tinción de Ziehl Neelsen la cual aplica el principio de que las paredes de
ciertas bacterias contienen ácidos grasos como el ácido micólico de largas cadenas que les
permite resistir la decoloración con alcohol – ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por lo que se le podría considerar como una técnica de tinción rápida y económica
usada para la identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Entre las cual se
encuentran las micobacterias, la lepra y tuberculosis En el caso de la observación de
esporas y endosporas la tinción de Scheffer – Fulton es la mas adecuada, ya que permite
identificarlas tiñendo la endosporas de color verde y las bacterias en rojo.

por lo que podemos finalizar diciendo que al igual que las técnicas anteriormente
mencionadas hay muchas más que nos ayudan con la identificación e incluso con el
entendimiento de las estructuras y composición del microorganismo.

Al finalizar la tincion de Schaeffer Fulton, serán positivos a tener esporas, cuando se teñiran
de color rosado las estructuras citoplasmaticas y de color verde las esporas, este es el caso de
Bacillus cereus.

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