Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Ingeniería Bioquímica
Academia de Genética Microbiana

LABORATORIO DE GENETICA MOLECULAR

Rodríguez Lanuza Kevin Jonathan

Ríos Moreno José Alberto

PRÁCTICA 3:
AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS DE FUENTES NATURALES

Contenido y Evaluación
Aspecto Calificación
Objetivos
Resultados
Discusión
Conclusiones
Referencias bibliográficas
Total

Grupo Sección
6IM1 3

Fecha de Entrega: 02/06/2022

Objetivo general.
1. Identificar las características de las placas líticas que permiten la identificación de
bacteriófagos.
Objetivos de aprendizaje.
1. Emplear la metodología para con el trabajo de bacteriófagos.
2. Comprender las características principales de los bacteriófagos y su aplicación e
importancia en diversos campos de la ciencia.
Objetivos particulares.
1. Aislar bacteriófagos a partir de aguas negras.
2. Describir la morfología de placa de los bacteriófagos aislados y determinar el
título.
3. Comparar las placas observadas con las proporcionadas por los profesores de
los fagos lambda, T4 y M13.
Resultados
Descripción del lugar de toma de muestra: Zona urbana en Iztapalapa, tomada de
un pozo donde se recircula el agua hacia el drenaje profundo, debido a un desnivel
en parte de la colonia, sitio rodeado de únicamente de viviendas y una escuela,
primaria, el agua es turbia, tiene una coloración café con olor desagradable
Ubicación del lugar de muestreo: Calle Valle de Bravo, Lomas de Zaragoza ubicada
en la alcaldía Iztapalapa de la Ciudad de México.
Temperatura aproximada = 27°C Hora del muestreo: 12:15 PM

Imagen 1. Mapa del lugar de muestreo.

 Imagen 2. Muestra y sitio de la toma de muestra.
Tabla 1. Descripción de las placas observadas en cada cepa bacteriana y título
fágico total.

Título
Características
fágico
Cepa Imagen de las placas
total
observadas1
(UFP/mL)
* Turbio, con halo, no
homogéneo, irregular,
microcolonias,
puntiforme.
* Turbio, sin halo, no
homogéneo, irregular,
Escherichia coli tipo K 2mm. Incontable
* Claras, sin halo,
homogéneo, regular,
1.5mm.
* Claras, con halo,
homogéneo, regular,
puntiforme.

* Turbio, con halo, no

homogéneo, irregular,
puntiforme.
* Turbio, sin halo, no
homogéneo, irregular,
Escherichia coli TG1 puntiforme. Incontable
* Claras, sin halo,
homogéneo, regular,
1.7 mm.
 * Claras, sin halo,
homogéneas,
regulares,
Escherichia coli B837 puntiformes. 1.02x102
* Turbio, sin halo,
homogéneo, irregular,
puntiformes.

* Turbias, con halo,

homogéneo, irregular,
puntiforme.
* Turbias, sin halo,
Salmonella
homogéneo, irregular, 3.1x101
typhimurium puntiformes.
* Claras, sin halo,
homogéneo, regular,
2mm.

1. Se marcan con un color diferente cada placa diferente.

Tabla 2. Características de las placas líticas de los bacteriófagos Lambda, T4 y M13.

Bacteriófago
λ T4 M13

Imagen

Bordes regulares
Características de Claras con centros debido a la rápida Bordes irregulares
placa lítica turbios lisis de las células y turbias
huésped

Tabla 3. Cepas utilizadas en la práctica y sus genotipos

Cepa Genotipo
Escherichia coli B837 Silvestre
Escherichia coli K Silvestre
endA-, thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5(rK –
Escherichia coli TG1
mK –) F′ [traD36 proAB + ]
Salmonella typhimurium LT2 rpsL(strR), his-, Lac
Discusión.
Las cepas utilizadas en la práctica fueron, primero, 3 tipos diferentes de Escherichia
coli, de los cuales dos pertenecen al linaje K (K silvestre y TG1) y uno al linaje B
(B837), la diferencia entre los linajes radica en sus patrones de metilación del DNA,
los cuales son específicos para cada linaje según el sistema de restricción-
modificación (M-R) que es usado por bacterias para protegerse de ataques de DNA
exógenos que ingresen a la bacteria, distinguiéndolo del ADN propio. El ADN propio
no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha
modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que
transfiere grupos metilo desde S-Adenosil-Metionina (SAM) a bases específicas.12
Otra diferencia importante entre Escherichia coli K y B837 es que la primera es una
donadora F+ (posee el pili sexual) y B837 es un a receptora F- (no posee el pili
sexual), por lo tanto, una infección por fagos que reconozcan las proteínas del pili
sexual de la bacteria como sitio específico para la absorción (como el fago M13)
sería imposible en Escherichia coli B837. 3
Además, se utilizó la cepa Salmonella typhimurium. La estructura general del
cromosoma y el orden génico están muy conservados entre Escherichia coli K-12 y
S. typhimurium LT2, aunque con algunas diferencias.
Salmonella typhimurium es una bacteria Gram negativa, es decir que posee
membrana externa, pared celular y membrana interna, donde el componente
lipopolisacárido (LPS), sobresale de la membrana externa y que actúa como una
barrera de protección a agentes externos.4
En la práctica únicamente se utilizó el medio L para sembrar las cepas en los 3
medios que se debían utilizar en la práctica eran los medios ricos:
• Medio LB: contiene 10g/L de triptona, extracto de levadura 5g/L, NaCl 10g/L
lo cual favorece la infección por fagos T4, ya que tiene un alto contenido de
nutrientes que deben ser usados por la bacteria para crear las copias del fago
y posteriormente lisarse.
• Medio Lambda: a diferencia del medio L y 2YT no tiene extracto de levadura,
pero tiene vitamina B1, además contiene: triptona 10 g/L, NaCl 10 g/L, esto
favorece la infección por fagos λ ya que al ser un fago lisogénico y lítico no
se requiere que el medio sea tan rico, ya que de serlo la lisogenia no será
reprimida y la célula no se lisara.
• Medio 2YT: que contiene 16g/L de triptona, extracto de levadura 10g/L, NaCl
10g/L, y 1.5% agar para medio sólido, el propósito de este medio era
favorecer la infección por fagos M13 ya que en el ciclo de multiplicación de

1
Molecular cell biology. Lodish, Harvey
2
Rodriguez, D. Cervantes, A. (2004)
3
Loeb, T. (1960).
4
Calva, E. (2012).
 este tipo de fago, se necesita conservar los nutrientes necesarios para que
la célula conserve un estado metabólico normal y además desarrolle la
multiplicación del fago, esto se logra con el alto contenido de extracto de
levadura y triptona como fuente de nitrógeno que proporciona el medio.
Para diferenciar los fagos temperados, virulentos y virulentos no líticos por
morfología de placa, se tiene que cada fago se puede diferenciar en su ciclo de
multiplicación y se sabe que cada fago puede infectar a una cepa en específico.
Por ejemplo, algunos tipos de fagos pueden infectar solo células que expresan cierto
tipo de pilus sexual asociado a la conjugación en sus superficies. Estos fagos son
capaces de infectar a células donantes capaces de transferir DNA. Uno de estos es
el fago M13. Por lo tanto, el fago M13 puede infectar a la cepa Escherichia coli TG1
por ser una cepa donadora (F+) y presentar el pili sexual con el cual tiene
receptores específicos para que el fago pueda adsorberse en la superficie de la
bacteria, en ese sentido, la morfología esperada de este fago no lítico, son placas
turbias en el medio de cultivo 2YT, debido a que la liberación de estos se da por
extrusión, lo cual confiere turbidez a la placa, pues parte de la bacteria se
encuentra presente. A diferencia de otros fagos, los fagos filamentosos, como el
M13, no inyectan su DNA, en cambio, la célula “ingiere” el fago completo y la
cubierta proteica se elimina del DNA a medida que el fago atraviesa la membrana
citoplasmática interna de la bacteria. Y dado que estos fagos no lisan las células
infectadas y se filtran lentamente, las células que son infectadas crecen lentamente,
por lo que sus placas líticas presentan microcolonias.5 Por este motivo es que este
medio de cultivo 2YT, contiene una mayor cantidad de nutrientes para que las
bacterias puedan crecer y ser infectadas por este tipo de fagos que de alguna
manera ralentizan el metabolismo de la bacteria debido a que se sintetiza DNA del
fago, y de esta manera, su metabolismo se dirige a este propósito.
Para un fago virulento (como el bacteriófago T4) experimentalmente se tienen
placas claras, circulares, con bordes bien definidos, pues el ciclo de multiplicación
del fago implica la lisis total de la bacteria, y cuya cepa receptora es Escherichia coli
K. En ese sentido, un fago virulento, como lo es T4, produce una placa bastante
pequeña, aproximadamente de 1mm, como sucedió en la placa de la cepa
indicadora Escherichia coli K. El tamaño resulta de un fenómeno poco conocido
llamado “inhibición de la lisis”, es decir, cuando la MOI es alta, como es el caso
cuando una placa se acerca a la madurez, la lisis se retrasa o se inhibe. 5
Finalmente para un fago temperado (como el bacteriófago λ) resulta en una
morfología con placas con micro colonias, centro claro y periferia turbia, debido a
que su ciclo de replicación es lítico y lisogénico (fago temperado), en el caso de
seguir un ciclo lisogénico, el DNA fágico se integra al cromosoma bacteriano
aprovechando las enzimas de la recombinación de la bacteria, lo cual general las

5
Snyder, et al. 2010
microcolonias en las placas, pues en este ciclo al tener un profago este no induce
infección y no destruye a la célula hospedadora, y la bacteria adquiere resistencia
a infección solo a este tipo de fago. Sin embargo, en el ciclo lítico el fago no se
integra al genoma bacteriano (es más habitual que se comporte como un virus de
ciclo lítico) provocando la lisis total de la bacteria dando las zonas claras en las
placas.
Cuando el ciclo lisógeno pudiera ocurrir a una MOI alta, los genes del fago podrían
mantenerse indefinidamente porque el lisógeno crecería siempre que los nutrientes
estuvieran presentes. En ese sentido, cuando se siembra el fago para obtener
placas, el fago y la bacteria se mezclan en agar blando con una MOI de 0.1, en este
caso, las bacterias crecen rápidamente, por lo que se produce en ciclo lítico ya que
el porcentaje de células infectadas depende de las concentraciones de fagos y
bacterias, si el fago y la bacteria están muy concentrados, chocan entre sí para
iniciar una infección con más frecuencia que si están más diluidos. Sin embargo, a
medida que aumenta el tiempo de incubación, la MOI aumenta, y algunas células
se lisogenizan, debido a que la disponibilidad de nutrientes aún no limita el
desarrollo de las células huésped. Por lo tanto, si un fago puede infectar una
bacteria y multiplicarse (ciclo lítico), el número de fagos descendientes aumenta
rápidamente. Sin embargo, si las bacterias estuvieran creciendo muy lentamente
porque los nutrientes limitados están disponibles en el medio circundante, es posible
que el fago infectante no pueda reproducirse porque los fagos crecen solo en
bacterias que están metabolizando activamente.
Cuando el número de fagos excede el número de bacterias, el fago no puede
multiplicarse más porque no hay más bacterias sensibles; hasta que aparece una
célula huésped, las partículas de fago no tienen posibilidad de aumentar en número.
Sin embargo, si su produjera un lisógeno a una MOI alto, los genes del fago podrían
mantenerse indefinidamente porque el lisógeno crecería siempre que los nutrientes
estuvieran disponibles.
Cuando las bacterias carecen de nutrientes, degradan su propio mRNA, y proteínas
antes de que se vuelvan latentes. La restauración de nutrientes permite que las
bacterias crezcan de nuevo. Esto no es cierto para una célula infectada por fagos
en la que su ciclo lítico se ha interrumpido; por lo general la capacidad para producir
fagos se pierde permanentemente, probablemente porque las funciones esenciales
del fago se destruyen por la degradación de la proteína y mRNA. Por el contrario, el
fago puede sobrevivir en el huésped en la vía lisogénica, porque el DNA del fago
puede mantenerse inactivo dentro de la bacteria. Cuando se reanuda el crecimiento
de la bacteria, los genes del fago se replican como parte del cromosoma.6
Aunado a lo anterior, el medio de cultivo para este tipo de fagos que se utilizó no
contenía una alta concentración de nutrientes como lo es el caso del medio 2YT,
para que no se indujera el ciclo lítico, es decir, que la MOI no fuera muy baja. Por lo
6
Stanley R, et al. 1994
tanto, las dos condiciones que estimulan una respuesta a la lisogénia de un fago
temperado son el agotamiento de nutrientes y una MOI alta.7
Con respecto a la amplitud de huésped se obtuvo que como Escherichia coli tipo
K presento 4 morfologías diferentes de placa (Tabla 1), por ende, ésta puede ser
infectada por al menos 4 fagos distintos de los que contenía la muestra de aguas
negras. En ese sentido, se observaron placas líticas muy similares, sin embargo, lo
que los hizo suponer que eran 4 fagos distintos, son los tamaños de las placas, ya
que todas las cepas fueron incubadas a un tiempo igual.
Por su parte Escherichia coli TG1 puede ser infectada por 3 tipos de fagos,
Escherichia coli B837 únicamente puede ser infectada únicamente por 2 tipos de
fagos, mientras que Salmonella typhimurium puede ser infectada por al menos 3
tipos de fagos distintos de los que estaban presentes en la muestra de agua.
De las distintas morfologías de placa, la mayoría son turbias, pero todas las
bacterias excepto Escherichia coli tipo K (en la cual si se presentaba un halo) tienen
un único tipo de placas claras las cuales son homogéneas, sin halo y borde regular.
En cuanto a las placas turbias podemos identificar que dos de las morfologías
observadas en Esterichia coli tipo K (Turbio, con halo, no homogéneo, irregular,
microcolonias, puntiforme. Y turbio, sin halo, no homogéneo, irregular) son similares
a 2 observadas en Escherichia coli TG1, incluso en tamaño, y ya que ambos cultivos
tienen el mismo tiempo de incubación, podemos suponer que se trata de los mismos
fagos.
Según lo anterior, podemos suponer que en la muestra se encontraba un fago
virulento capaz de infectar a 3 bacterias diferentes (Esterichia coli B837, TG1 y
Salmonella typhimurium) y dos fagos ya sean virulentos que no producen lisis o
temperados, que pueden infectar a 2 bacterias distintas (Esterichia coli K y TG1).
Con respecto a lo anterior, se pueden observar placas claras pero con diferente
tamaño en Escherichia coli K, una de 1.5 mm y otra menos de 1 mm (puntiforme),
al igual que en TG1, donde se obtuvo una placa con una medida de 1.7 mm, ambas
cepas son de linaje K. Se ha encontrado que existen mutantes rII (mutantes de lisis
rápida tipo II). Los fagos con una mutación de lisis rápida se pueden distinguir por
la apariencia de sus placas, en bacterias indicadoras como E. coli B. Las placas
formadas por lo fagos r+ de tipo salvaje tienen bordes borrosos y pequeños debido
a la inhibición de la lisis. Sin embargo, los mutantes de tipo r no muestran inhibición
de la lisis, lo que hace que formen placas transparentes con bordes definidos y de
varios mm de diámetro. La propiedad de los mutantes rII que los distingue de los
otros tipos de mutantes de lisis rápida es que no pueden multiplicarse en cepas de

7
Snyder, et al. 2010
Escherichia coli que son lisógenas para lambda, como lo es la cepa Escherichia coli
K8.
Por otra parte, se ha observado que el fago lambda está restringida para las cepas
de Escherichia coli tipo B, por lo que únicamente puede infectar a las cepas K.
Asimismo, E. coli B contiene una endonucleasa de restricción (EcoB); y el fago
lambda contiene esta secuencia de restricción que es reconocido por EcoB, por lo
que cuando su DNA se inyecta en E. coli B, el DNA del fago se degrada, esta cepa
contiene esta secuencia y destruiría su propio DNA. Sin embargo, una enzima de
metilación específica del sitio (EcoB metilasa) metila una adenina en la secuencia,
lo que la hace que la secuencia sea resistente a la nucleasa EcoB. Sin embargo,
cuando el fago lambda que es especfífica para la cepa K, infecta a una cepa B, unas
pocas moléculas de DNA de fago en la gran población de células infectadas se
metilan antes de restringirse. Por lo tanto, se evita la restricción en estos fagos, por
lo que se produce una pequeña población de fagos que pueden infectar a las cepas
de Escherichia coli de linaje B. Esto podría ser unos de los motivos por la que se
obtuvieron muy pocas placas líticas turbias en la cepa de E. coli B, debido a lo
anteriormente explicado. Por su parte, el fago temperado muestra especificidad por
la cepa K así como TG1, por lo que en estos medio se observaron mayor cantidad
de placas líticas turbias9.

Conclusiones.
1. Se encontraron fagos virulentos cuyas placas líticas características fueron
encontradas en los medios de Esterichia coli B837, TG1 y Salmonella
typhimurium). Aunque se encontraron pequeñas diferencias en las placas,
por lo que se asume que son fagos virulentos distintos.
2. Se encontraron fagos temperados cuyas placas líticas con características
turbias fueron encontradas en las cepas Esterichia coli K y TG1.
3. Las bacterias estudiadas; Escherichia coli K, Escherichia coli TG1,
Escherichia coli B837 y Salmonella typhimurium, son susceptibles a la
infección por 4, 3, 2 y 3 fagos distintos respectivamente de los contenidos en
la muestra.
4. En la muestra se encontraba un fago virulento capaz de infectar a 3 bacterias
diferentes (Esterichia coli B837, TG1 y Salmonella typhimurium) y dos fagos
ya sean virulentos que no producen lisis o temperados, que pueden infectar
a 2 bacterias distintas (Esterichia coli K y TG1).
5. Los fagos que pueden infectar bacterias Esterichia coli de linajes K, no
pueden infectar a bacterias de linajes B, ya que los patrones de metilación
del DNA de la bacteria son específicos.

8
Snyder, et al. 2010.
9
Stanley R, et al. 1994
Referencias Bibliográficas.
1. Molecular cell biology. Lodish, Harvey F. 5. ed. : - New York : W. H. Freeman
and Co., 2003, 973 s. b ill. ISBN 0-7167-4366-3
2. Rodríguez Dorantes, M., Téllez Ascencio, N., Cerbón, M. A., López, M., &
Cervantes, A. (2004). Metilación del ADN: un fenómeno epigenético de
importancia médica. Revista de investigación clínica, 56(1), 56-71.
3. Loeb, T. (1960). Isolation of a bacteriophage specific for the F+ and Hfr mating
types of Escherichia coli K-12. Science, 131(3404), 932-933.
4. Calva, E. (2012). Salmonella typhi y la fiebre tifoidea: de la biología molecular
a la salud pública. Recuperado de: http://www. biblioweb. tic. unam.
mx/libros/microbios/Cap4.
5. Larry S y col. (2010). Molecular Genetics Of Bacteria. 4 ed. ASM PRESS.
Washington, pp 298-317.
6. Stanley R., y col. (1994). Microbial Genetics. 2 ed. Sales. England, pp 309-
335.