CROMATOGRAFÍA

Y
ELECTROFORESIS
PRESENTADO POR: MSC. ING. NANCY ORTIZ VEIZAN
 CONTENIDO
Introducción a la cromatografía.

Clasificación de las cromatografías

Parámetros básicos de Cromatografía.

Características analíticas y aplicaciones.

Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). .

Introducción a HPLC.

Instrumentación en HPLC.

Características analíticas y aplicaciones de HPLC

Metodología en HPLC.
 Introducción a la cromatografía
La cromatografía es un proceso desarrollado en los años 50s, basado en técnicas analíticas de
separación cuyos resultados nos pueden llevar a análisis cualitativos o cuantitativos. La condición
que se considera es que los gases sean volátiles y térmicamente estables.
El intercambio de sustancias se da entre sólidos, líquidos y gases.
Según la fase formada se produce una cromatografía de adsorción o reparto.
La columna de separación puede ser de cuarzo o vidrio donde su superficie interna de la columna
de separación contiene la fase estacionaria líquida
Una separación puede definirse como una operación que implica dividir una mezcla (muestra)
en por lo menos dos partes de distinta composición, de forma que una de las fracciones se
enriquece en un componente (el analito) con relación al resto. Así se consiguen los siguientes
objetivos:
– Mejorar la selectividad. La aplicación directa de una técnica analítica a la muestra puede
fracasar debido a la interferencia de otras especies con propiedades fisicoquímicas similares a
las del analito, o que producen alteraciones en la señal de medida. Si se aísla el analito de
interés del resto, lógicamente se evitan estos problemas
Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y
electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permiten
separar componentes en mezclas, aun cuando los componentes estén íntimamente
relacionados, lo que en muchas ocasiones resultaría imposible por otros medios. Los
componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en
reposo mientras que la otra se mueve en una dirección definida. Inicialmente, la cromatografía
era exclusivamente una técnica de separación, que luego se transformó a una técnica de
análisis cuando se acopló con un sistema para monitor izar los componentes que se iban
separando. Así, la cromatografía se ha convertido en una técnica analítica que permite la
separación, identificación y cuantificación de los componentes separados
Las separaciones cromatográficas se efectúan haciendo pasar
continuamente una fase, denominada móvil, sobre una segunda
fase que permanece fija o estacionaria. La muestra se inyecta o
se coloca en la fase móvil. A medida que se van desplazando
junto con la fase móvil, los componentes de la muestra se
reparten entre la fase móvil y la fase estacionaria Las fases se
eligen de forma que los componentes se distribuyan de diferente
manera entre ambas. Las sustancias que son fuertemente
retenidas por la fase estacionaria se mueven más lentamente con
el flujo de la fase móvil, mientras que las que son débilmente
retenidas avanzan con mayor rapidez. La velocidad con que se
mueve cada sustancia dependerá de su afinidad relativa por cada
fase.
 Clasificación de las cromatografías
Las cromatografías se pueden clasificar atendiendo a varios criterios:

Según el estado físico de la fase móvil y la fase estacionaria

Cromatografía de líquidos. La fase móvil es un líquido, y la fase estacionaria

puede ser un sólido (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible
con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía
líquido-líquido).
Cromatografía de gases. La fase móvil es un gas inerte y la fase estacionaria un
sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido retenido por un sólido inerte
(cromatografía gas-líquido).
Cromatografía de fluidos supercríticos. La fase móvil es un fluido supercrítico, y
la fase estacionaria puede ser sólida o líquida
Según los mecanismos físicos o químicos responsables de la separación de los
componentes de la muestra

Cromatografía de adsorción. Se usa una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o
gaseosa. Las sustancias pueden adsorberse en la superficie de las partículas sólidas de la fase
estacionaria por fuerzas de Van der Waals. El equilibrio de adsorción/desorción de la sustancia
entre la fase sólida y la fase móvil es la causa de la separación.
Cromatografía de reparto. En la cromatografía de reparto la fase estacionaria es un líquido
retenido sobre un soporte sólido. El analito se equilibra o reparte entre este líquido estacionario
y una fase móvil líquida o gaseosa.
Cromatografía de intercambio iónico. En este tipo de cromatografía se unen aniones o cationes
covalentemente a una fase estacionaria sólida, de forma que adquiere una carga neta.
Cromatografía de afinidad. Se utilizan interacciones altamente específicas entre un tipo del
moléculas de la muestra y otras moeculas que se unen (inmovilizan) covalentemente a la fase
estacionaria.
Cromatografía de exclusión molecular (o filtración en gel). A diferencia de lo que ocurre en otras
formas de cromatografía, en ésta no existen interacciones entre la fase estacionaria y los
componentes de la muestra; la fase estacionaria actúa como un simple tamiz
 Según la disposición de la fase estacionaria
Cromatografía en columna. La fase estacionaria está contenida en un tubo a través del cual se
hace pasar la fase móvil. Esta se desplaza por capilaridad, gravedad o presión.
Cromatografía plana. La fase estacionaria se coloca en un soporte plano. La fase móvil es líquida,
y su flujo se consigue por capilaridad o por capilaridad y gravedad.

Pueden ser a su vez:

– Cromatografía en papel . El papel actúa como fase estacionar ia, o como soporte de algún
líquido que hace entonces de fase estacionaria.
– Cromatografía en capa fina. La fase estacionaria es un solido finamente dividido o un liquido
inmovilizado sobre un solido colocado en un soporte plano, tal como una placa de vidrio o una
lamina de aluminio
 Parámetros básicos de Cromatografía

En la cromatografía de gases se utiliza como fase móvil un gas portador inerte, que
eluye los componentes de una mezcla a través de una columna que contiene una fase
estacionaria inmovilizada, este gas normalmente es He, N2 o H2, mientras que la fase
estacionaria puede ser:
-Un sólido adsorbente.
-Un líquido no volátil retenido en un soporte sólido (columna empaquetada) o
impregnando las paredes de una columna capilar (columna abierta)
 Características analíticas y aplicaciones
La cromatografía es una técnica rápida, sencilla, relativamente de bajo coste y con una gran
aplicabilidad como herramienta de separación. Además, se puede emplear para la identificación
cualitativa y para la determinación cuantitativa como se verá a continuación.
Análisis cualitativo
La cromatografía, a efectos analíticos, es una técnica ciega. Los métodos cromatográficos pueden
informar, como mucho, del número de compuestos químicos existente en una mezcla (según el
número de picos que aparezcan en el cromatograma), pero no pueden aportar información sobre
su naturaleza.
Análisis cuantitativo
El análisis cuantitativo está basado en la medida de la altura o el área del pico cromatográfico del
analito, que se compara normalmente con la altura o el área de uno o más patrones inyectados
bajo las mismas condiciones cromatográficas.
La medida de la altura de pico es fácil, pero solo aporta una exactitud razonable cuando los picos
son agudos, estrechos, están bien definidos y son simétr icos. Es aplicable a análisis de rutina,
donde la sencillez y rapidez son importantes, en detrimento de la exactitud.
Cromatografía líquida de alta eficacia
(HPLC)
 Introducción a HPLC

Se conoce ampliamente como HPLC, por sus siglas en inglés (“High Performance Liquid
Chromatography”).
En HPLC la separación se efectúa debido a las interacciones de la muestra y la fase
estacionaria, tales como reparto líquido-líquido, adsorción líquido-sólido, intercambio de
iones y exclusión por tamaño, y a las interacciones entre la muestra y la fase móvil. Sean
cuales sean las interacciones que tengan lugar, el equipo básico y sus componentes son
esencialmente los mismos.
Lo que varía es la naturaleza de la fase estacionaria y la fase móvil, dando lugar a los
diversos tipos de cromatografía líquida.
 Tipos de cromatografía líquida.
Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto (o cromatografía de partición) es probablemente el tipo de cromatografía
líquida de alta resolución más utilizado. Es una cromatografía que emplea como fase estacionaria un
líquido retenido sobre un soporte sólido, o bien enlazado químicamente al mismo (fase estacionaria
ligada). La separación de los componentes de la muestra se basa en la diferente solubilidad entre la
fase móvil y la fase estacionaria.
Fases móviles que se utilizan frecuentemente en la cromatografía de partición son agua, acetonitrilo,
metanol, etanol, dioxano, tetracloruro de carbono y ciclohexano, puros o combinados en proporciones
adecuadas.
Cromatografía de exclusión por tamaño
En la cromatografía de exclusión por tamaño la base de la separación es la capacidad del soluto para
penetrar en los poros del empaquetamiento de la columna. La fase estacionaria actúa solo de soporte
inerte, y las características de la fase móvil no constituyen un factor decisivo en la discriminación de
componentes.
La fase estacionaria puede ser de naturaleza silícea, pero también se emplean geles de
poliacrilamidas, dextranos (comercialmente denominado Sephadex), agarosa y poliestireno
Cromatografía de adsorción
En la cromatografía de adsorción el relleno sólido de la columna actúa como fase estacionaria.
Suele emplearse sílice o alúmina. La fase estacionaria normalmente es polar, por lo que suelen
utilizarse fases móviles no polares o de polaridad baja. Fases móviles típicas son hexano,
isooctano y cloruro de metileno.
Cromatografía de intercambio iónico
En la cromatografía de intercambio iónico la fase estacionaria es una resina polimerizada
mediante enlaces cruzados, unida de forma covalente a grupos funcionales iónicos. Los
contraiones de estas cargas fijas son móviles, y pueden ser desplazados por iones que compiten
por los lugares de intercambio.
La fase móvil suele ser un tampón acuoso, cuyo pH y composición iónica determinan el tiempo de
retención de los componentes.
Componentes de un equipo de HPLC
Sistema de suministro de fase móvil
La cromatografía de líquidos utiliza una fase móvil liquida. Esta fase puede ser un disolvente puro o
una mezcla de disolvente. Además, la fase móvil puede mantener durante todo el proceso la misma
composición, realizándose entonces una elución isocrática, o, lo que es más frecuente, pueden
usarse dos o más disolventes cuya relación va variando a lo largo del proceso, de forma
programada. Esta elución se denomina en gradiente, y aumenta considerablemente la eficacia de la
separación.
Sistemas de inyección de la muestra
Se trata de montajes más o menos sofisticados diseñados para introducir un volumen pequeño de
muestra líquida en el sistema, lógicamente entre el sistema de bombeo y la columna.
La introducción de la muestra en la columna suele ser el factor limitante en la precisión de las
medidas en cromatografía
Un inyector ideal debe tener las siguientes características:
– Introducir volúmenes pequeños y reproducibles de muestra, del orden de microlitros.
– Originar la menor dispersión física posible del volumen mezclado para evitar que los picos
cromatográficos se ensanchen.
– Dar resultados reproducibles, tanto en el volumen de muestra introducido como en el
ensanchamiento de banda que produce.
– No alterar las características hidrodinámicas del sistema: no debe interrumpir el flujo ni variar
momentáneamente la presión o el caudal.
– Ser de fácil manejo.
 Columna
Es la parte esencial del cromatógrafo de líquidos, ya que en
ella, a través de diferentes mecanismos, tiene lugar la
separación de los analitos. Es condición indispensable para la
reproducibilidad de los resultados una gran homogeneidad en
la distribución de la fase estacionaria, lo que implica la
necesidad de técnicas precisas y complejas de preparación de
las columnas. Las casas comerciales ofrecen una gran
variedad y resulta fundamental una correcta elección para
cada separación.
Las columnas son tubos de acero que miden entre 10 y 30 cm
de longitud y cuyo diámetro oscila entre 2 y 10 mm
normalmente (figura 14.6). Por lo general son rectas, aunque
en algunas ocasiones se pueden encontrar columnas
configuradas con forma helicoidal.
 Detector
Los detectores se sitúan a la salida de la columna, y proporcionan de forma continua
información acerca de la composición del eluyente que circula a su través. Comparan o
detectan la diferencia en alguna propiedad física entre la fase móvil y la fase móvil más
muestra.
Un detector ideal en HPLC debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito, dar una
respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo que dura el
cromatograma.
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos:
1. Detectores que se basan en la medida de una propiedad de la fase móvil, tal como el índice
de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica en presencia del analito.
2. Detectores basados en alguna propiedad de los componentes de la muestra, como la
absorbancia en el ultravioleta, fluorescencia, o corriente límite.
Características analíticas y aplicaciones de HPLC
Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación
más ampliamente utilizada. Se trata de una técnica de elevada sensibilidad, fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas exactas, idónea para la separación de especies no volátiles o
termolábiles y, sobre todo, de gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la
industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de
estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, glúcidos,
drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad
de sustancias inorgánicas. Actualmente, HPLC se puede acoplar a espectroscopia de masas
obteniendo unas prestaciones analíticas muy buenas
 Metodología en HPLC
Para llevar a cabo un análisis por HPLC es fundamental tener en cuenta una serie de
pasos, que se detallan a continuación.
Tratamiento de la muestra
En HPLC se trabaja con muestras líquidas o sólidas previamente disueltas. Para
disolverlas se emplea la misma fase móvil que va a utilizarse en el análisis. Si la
muestra no fuera completamente soluble en la fase móvil, puede adicionarse ácido
fórmico, acético o alguna sal; este procedimiento mejora la solubilidad y no afecta a
la separación, siempre y cuando estos agentes se encuentren en bajo porcentaje. Si
la muestra es gaseosa se hace burbujear a través de un disolvente adecuado que
retiene a los analitos.
Todos los disolventes que se utilicen en el tratamiento de la muestra deben ser de
alta pureza o calidad HPLC
Elección de fase estacionaria y fase móvil
La elección del sistema cromatográfico debe realizarse en función de la
naturaleza de las sustancias que se vaya a separar. Este conocimiento puede
aportar una orientación sobre qué mecanismo de separación puede ser más
apropiado, en función de la propiedad para la que existen diferencias más
notables entre las sustancias que componen la muestra.
Tratamiento de la fase móvil
Los eluyentes que se van a usar deben filtrarse y desgasificarse antes de su
utilización.
Purga del sistema
Antes de colocar la columna se debe purgar el sistema de conducciones con la
fase móvil autilizar para evitar restos de otros eluyentes, así como para eliminar
las burbujas de aire que pudiera haber. Normalmente el manual de instrucciones
del equipo indica el tiempo de purga necesario, que conviene respetar
Columna
Una vez elegida la columna de trabajo, se coloca en el equipo. Las columnas
disponen de una etiqueta en la que, además de informar de qué tipo de columna
se trata, se indica con una flecha la dirección que debe seguir el flujo de fase
móvil. En primer lugar, se coloca la entrada de la columna a la salida del inyector,
se introduce la fase móvil a un flujo bajo, y se espera hasta que salga por el
extremo opuesto. Entonces se conecta el final de la columna con el detector.
Desarrollo del método
Seguir el método elegido, seleccionando en el controlador del equipo las
condiciones del análisis.
Al acabar el análisis
-Lavar adecuadamente la columna, como se indique en sus instrucciones, y en
función del uso que haya tenido.
-Si la columna va a ser usada nuevamente en un corto periodo de tiempo, se
puede dejar colocada en el sistema.
-Lavar la bomba
 APLICACIONES
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos
naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular.
Dentro de las principales industrias exitosas mundialmente se encuentra la
farmacéutica, posicionada por ser una de las más requeridas por su alto impacto en la
salud actualmente. Uno de los métodos que definen el uso de los medicamentos es la
Cromatografía Liquida de Alto Desempeño (HPLC) que analiza los ingredientes de cada
uno de ellos.
Cada laboratorio que requiera la HPLC para regular el procesamiento y consumo de
cada medicamento que sea utilizado en el mundo. Frecuentemente la cromatografía de
líquidos se desarrolla en el laboratorio de calidad de farmacéuticas, tienen muestras
de materiales terminados por medio de máquinas de HPLC que después pasan a ser
analizados los resultados.
 BIBLIOGRAFIA
■ Química analítica cuantitativa. [Link], JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18.
■ [Link] High Performance Liquid
Chromatography HPLC . Fecha de acceso 16/05/18