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Método Sanger: Identificación de Aminoácidos Terminales

Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la molécula de hemoglobina. El método implica la preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina, seguido de una cromatografía en papel del derivado para separarlo y medir las distancias de movimiento para identificar el aminoácido terminal.

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Método Sanger: Identificación de Aminoácidos Terminales

Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la molécula de hemoglobina. El método implica la preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina, seguido de una cromatografía en papel del derivado para separarlo y medir las distancias de movimiento para identificar el aminoácido terminal.

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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS


BIOQUIMICA GENERAL
Bitácora 4: Practica. Determinación de aminoácidos terminales con
grupo alfa amino libre.
Método de Sanger

Morales Ramos Priscila, Grupo: 4QV1 Sección: 1


INTRODUCCIÓN
Son muy importantes los métodos usados para identificar los restos aminoácidos
terminales. El primer método útil para determinar el N-terminal de los polipéptidos
fue descrito por Sanger, quien encontró que el grupo alfa amino libre de los péptidos,
que no han captado protones, reaccionan con el 2,4- dinitrofluorobenceno (DNFB)
y forma derivados 2,4- dinitrofenilados. Cuando tales derivados de un péptido se
someten a hidrolisis con HCl 6 N, todos los enlaces peptídicos se hidrolizan, pero el
enlace entre el grupo 2,4-dinotrofenilo y el grupo alfa amino del aminoácido N-
terminal es relativamente estable frente a la hidrólisis ácida. Por lo consiguiente, el
hidrolizado del péptido dinitrofenilado contiene todos los restos aminoácidos de la
cadena peptídica en forma de aminoácidos libres, a excepción del resto N-terminal,
el cual aparece como derivado 2,4-dinitrofenilado, de color amarillo. Este resto
marcado puede separarse fácilmente de los aminoácidos no sustituidos e
identificarse por comparación cromatografía con los derivados dinitrofenilados
conocidos de los diferentes aminoácidos.

OBJETIVOS
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de
hemoglobina mediante el método de Sanger.
DIAGRAMA DE FLUJO

Preparación del derivado


dinitrofenilado de la hemoglobina.

Si

a) Colocar 30 mg de la
hemoglobina en un tubo
con tapón de rosca

No

1
No

Si

No

Si
No

Si

Se elimina
i) Calentar los extractos etéreos en
una parrilla casi a sequedad,
enfriar y disolver el residuo en
0.5 mL de acetona o alcohol
absoluto.

j) Realizar la cromatografía
en papel del derivado
dinitrofenilado de la
hemoglobina.

a) Cortar una tira de papel


Whatman No. 1 de 22 x 50
cm y trazar con lápiz, a lo
ancho del papel, tres líneas
paralelas a 2.5, 6 y 8 cm

Doblar la primera línea


hacia enfrente y la
segunda hacia atrás.
En los primeros 4
puntos colocar 7-9
aplicaciones de
derivados difenilados.

En el punto faltante
colocar 40-50
aplicaciones de la
muestra

Colocar el cromatograma
con solvente de ácido
cítrico y citrato de sodio
0.1 ft y dejarlo por 2 hrs.

Desarrollar en forma
descendente con el
mismo solvente por
4.5 – 5 horas

Sacar los cromatogramas, marcar


con lápiz el frente del solvente,
dejar secar, circunscribir el lugar
donde están las manchas
dinitrofeniladas

Se puede intensificar el
color amarillo sometiendo la
hoja a vapores de amoniaco.

Medir las distancias y


calcular los valores
de Rf.
Referencias
Cabrera Riaño N. (2007) Fundamentos de química analítica básica. Análisis
cuantitativo Editor Eniversidad de Caldas. Colombia Pp. 175-176.
Murray R y col., (1997) Bioquímica de Harper. Manual Moderno, México, 14
edición. Pp. 43.

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