UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

“Norte de la Universidad peruana”

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE AGRONOMÍA

DOCENTE
ATTILIO ISRAEL CADENILLAS MARTINES
INTEGRANTES:
ALVA GALLARDO KATHERIN NAYLI
ARRELUCE HORNA ELIAN LILIA
BECERRA BANDA ERIKA YASMIN
SOLIZ BRIONES KEITI ARACELY
VASQUEZ GARCIA ARIANA KATHERINE
CURSO
FERTILIZACIÓN BIOLÓGICA DEL SUELO
TEMA
RECOLECCIÓN, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL RHIZOBIUM
CICLO ACADÉMICO: 2021-II
GRUPO: A1
AÑO: 2022
Recolección, aislamiento y caracterización de Rhizobium E.A.P Agronomía

RECOLECCIÓN, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL RHIZOBIUM

I. INTRODUCCIÓN
El nitrógeno es uno de los elementos químicos esenciales para todos los seres vivos
ya que forma parte de los ácidos nucleicos y de las proteínas y, por lo tanto, es fundamental
en la estructura y el metabolismo celular (Paerl, 1998). Las plantas toman el nitrógeno
directamente desde el suelo en forma de nitratos (NO3 -) o amonio (NH4 +), algo que no
pueden hacer los animales, que precisan tomarlo en forma de compuestos orgánicos. Sólo
algunos procariotas pueden tomar el nitrógeno directamente desde la atmósfera, vía fijación
de nitrógeno, convirtiendo el nitrógeno molecular en nitrógeno asimilable por otros seres
vivos.
La fijación biológica de nitrógeno supone más del 60% de la fijación global del
nitrógeno en la tierra y los microorganismos que llevan a cabo este proceso se denominan
diazotrofos (Lloret y Martínez-Romero, 2005; Raymond et al., 2004). La enzima
responsable de la fijación de nitrógeno se denomina nitrogenasa y está compuesta por dos
metaloproteínas, una con Fe (ferroproteína o nitrogenasa reductasa) y otra con Fe y Mo
(ferromolibdoproteína o nitrogenasa propiamente dicha) como grupos activos.
La eficiencia de la fijación de nitrógeno es relativamente baja en el caso de los
fijadores libres ya que el nitrógeno fijado es posteriormente metabolizado y eliminado por
desnitrificación y lavado. La fijación en vida libre sólo aporta al suelo unos cientos de
gramos de nitrógeno por hectárea y año que, si bien son suficientes en condiciones naturales,
están muy lejos de satisfacer las necesidades de los cultivos (Olivares, 2004).
Sin embargo, la fijación en simbiosis es mucho más eficiente, calculándose que sólo
la asociación rhizobio-leguminosa puede llegar a aportar más de 300 kilogramos por
hectárea y año. Por ello determinados cultivos de leguminosas no requieren fertilización
nitrogenada para que se incremente su contenido en proteínas, contribuyendo además al
enriquecimiento del suelo en nitrógeno, que puede ser aprovechado por cultivos asociados
o por las plantaciones posteriores en una rotación de cultivos (Urzúa, 2005).

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1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
✓ Desarrollar el aislamiento y caracterización de Nódulos de Desmodium
intortum.
1.2. Objetivos específicos
✓ Identificar las características morfológicas, fisiológicas y químicas en
relación a los nódulos de Desmodium intortum.
✓ Determinar la velocidad de crecimiento de las bacterias de rhizobium de
la muestra obtenida.
✓ Desarrollar la inoculación de la semilla de Medicago sativa (Alfalfa).
2. MATERIALES Y EQUIPOS
2.1. A nivel de campo
Materiales Función
Zapapico Se utilizo para desprender la planta del suelo.
Guantes Para extraer la planta del suelo.
Bolsa plástica Para mantener la humedad en la planta.
Bolsa de cartón Para que la planta mantenga su humedad.

2.2. A nivel de laboratorio

Materiales Equipos Colorantes
Placas Petri Agua destilada Estufa Cristal violeta
Pipeta Hipoclorito de Na 3% Autoclave Lugol-acetona 1:1
Bureta Alcohol 96% Microscopio óptico Safranina
Asa de siembra Cultivo de rhizobium
Matras Erlenmeyer
Mechero
Porta objetos
Papel secante
Cristalizador y varillas
de tinción.

Figura 1. Instrumentos y materiales utilizados para la siembra de Rhizobium

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3. MARCO TEÓRICO
3.1.Nódulo radicular
Los nódulos radiculares son estructuras vegetales presentes en las raíces de
plantas, principalmente leguminosas, que forman simbiosis con bacterias fijadoras de
nitrógeno. Bajo condiciones limitantes de nitrógeno, las plantas capaces forman una
relación simbiótica con un tipo específico de bacterias conocidas como rizobios.
Dentro de los nódulos radiculares de las leguminosas, el gas nitrógeno de la atmósfera se
convierte en amoníaco, que luego se asimila en aminoácidos, nucleótidos y otros
constituyentes celulares como vitaminas, flavonas y hormonas. Su capacidad para fijar
nitrógeno gaseoso convierte a las leguminosas en un producto agrícola ideal, ya que se
reduce su necesidad de fertilizantes nitrogenados. De hecho, el alto contenido de
nitrógeno bloquea el desarrollo de nódulos ya que no hay ningún beneficio para la planta
de formar la simbiosis. La energía para dividir el gas nitrógeno en el nódulo proviene del
azúcar que se transloca de la hoja .
3.2. Rhizobium
Los rizobios son bacterias del perfil de suelo que fijan nitrógeno diazotrófico después de
haberse establecido endosimbióticamente dentro de nódulos radiculares de las leguminosas
(Fabaceae). Los rizobios no pueden independientemente fijar nitrógeno atmosférico:
requieren una planta hospedante. Morfológicamente son, en general, gram negativas,
mótiles.
3.3. Simbiosis
Las plantas y los microorganismos del suelo interaccionan aportándose beneficios
mutuos, lo cual podemos utilizar para favorecer la conservación del medioambiente. Las
leguminosas establecen simbiosis con rizobios, bacterias del suelo con el potencial para fijar
el nitrógeno atmosférico, formando nódulos. El cultivo de leguminosas inoculadas con
rizobios es una alternativa barata y respetuosa con el medio ambiente, que permite la
regeneración de suelos marginales y su enriquecimiento en nitrógeno para que el posterior
cultivo de otras especies vegetales no requiera el uso de fertilizantes, evitando así la
contaminación de aguas superficiales y subterráneas.
3.4. Leguminosa (Desmodium intortum)
Es un género de planta leguminosa con múltiples especies, que se dan por naturaleza en las
tierras de trópico medio y bajo (clima templado a cálido), como parte de la flora propia de
los ecosistemas tropicales en muchos países de América. Es común encontrarla en las tierras
cubiertas por pastizales con participación de arvenses nativas, pero como se ha vuelto
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habitual, el ganadero no las ha valorado en su afán por establecer monocultivos de gramíneas

tropicales «mejoradas».
3.5. Fijación del nitrógeno
La fijación de nitrógeno por parte de bacterias tiene notable importancia ambiental
relacionada con el mundo agrario. Los géneros de bacterias Rhizobium y Bradyrhizobium,
integrantes del microbiota autóctono del suelo, provocan la formación de abultamiento en
las raíces de algunas plantas, las leguminosas. La relación que se produce entre la bacteria
y la planta es simbiótica, es decir, donde ambos individuos se ayudan y benefician
mutuamente. Las bacterias fijan el nitrógeno atmosférico y lo incorporan a la base proteica
del vegetal. Por el contrario, este último da cobijo y ambiente propicio para el correcto
desarrollo del microorganismo en su interior.
[Link]ón para la Recolección de Nódulos
3.6.1. Datos generales
[Link].Fecha de recolección: 4 de abril del 2022
[Link].Localización
Los nódulos fueron extraídos de:
País: Perú
Región: Cajamarca
Provincia: Cajamarca
Distrito Namora (El Cumbe).

Figura 2. Zonas de muestreos de nódulos.

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[Link].Georreferenciación
➢ Altitud: 2914 m.s.n.m
➢ Coordenadas UTM
Coordenada Este: 800269.04 m E
Coordenada Norte: 9202989.54 m S

Figura 3. Georreferenciación de la zona de muestreos de los nódulos

[Link].Nombre del recolector
✓ Soliz Briones, Keiti Aracely
[Link]. Dirección, Email, Celular
✓ Distrito: Namora
✓ Ksolizb20_2@[Link]
✓ Cel: 970262219
[Link].Nombre de la planta
✓ Nombre científico: Desmodium intortum.
✓ Nombre común: Pie de perro, Amor seco

Figura 4. Pie de perro, Amor seco

3.6.2. Datos del lugar de Recolección

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✓ Lote de ensayo: Ensayo de inoculación.

✓ Lote cultivado: No es un lote destinado para el cultivo, este está
rodeado de arbustos como (Vaccinium floribundum (Pushgay),
Taraxacum officinale (Chicoria), Rubus plicatus (Zarzamora)
Bejaria resinosa (purunrosa), cucharilla, entre otras).
✓ Edad del cultivo: No hay cultivos, solo presencia de plantas
silvestres.
✓ Bosque: Se manifiesta la presencia de un sotobosque.
3.6.3. Propiedades del suelo
✓ pH del suelo: Suelos cercanos a la neutralidad (pH 6.7).
✓ Contenido de humedad: Presenta un contenido de humedad media.
✓ Clase textural: Franco arenoso
✓ Fertilidad natural: Mantiene una fertilidad media.
✓ Fertilización: Este suelo es fertilizado de manera natural, a través de
la descomposición de las especies vegetales que se desarrollan de
manera natural en tal lugar.
[Link]ísticas de la Planta y de la Nodulación
3.7.1. Planta: La planta utilizada en este estudio no ha sido inoculada. Para el
estudio han sido recolectadas plantas con un 5% de floración ya que este es
un indicador de una presencia máxima de nódulos.
3.7.2. Nódulos: Los nódulos son provenientes de la misma planta (Desmodium
intortum).
3.7.3. Otras características: Muchas veces se hace necesario el empleo de una
cepa eficiente para obtener buenos resultados con este género, ya que en el
suelo no siempre se encuentran las cepas nativas capaces de producir una
buena fijación de nitrógeno. Así se ha observado en D. intortum, que al
inocular una buena cepa de Rhizobium hay un beneficio amplio en el primer
año, pero al transcurrir el tiempo la proporción de cepas salvajes que se
encuentran en los nódulos se hace mayor, debido a que la planta estimula el
desarrollo de las bacterias nativas, que pueden competir fuertemente con la
cepa inoculada (Date, 1977), lo cual conlleva a que se produzcan
nodulaciones no efectivas. Desmodium, en general, puede fijar alrededor de
90 kg de N/ha/año (Nutman, 1976), aunque esto puede depender de la
especie, ya que en estudios realizados por Whitney et al. (1967) se obtuvo
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que D. canun fijó 76 kg de N/ha/año y D. intortum llegó a fijar 303 Kg de

N/ha/año.
3.8. A nivel de Laboratorio
3.8.1. Aislamiento de los Rizobios de los Nódulos
1. Cuando no se puede realizar el aislamiento de los rizobios
inmediatamente después de la recolección de los nódulos, es mejor
mantenerlo en frascos que contengan un desecante.
2. Si el proceso de aislamiento, parte de los nódulos secos, se debe sumergir
en agua estéril por una o dos horas.
3. Lavar los nódulos con agua estéril, ver la siguiente figura.

Figura 5. Esquema de siembra de Rhizobium

[Link]ón de los Rizobios
3.9.1. Características de los nódulos
➢ Forma del nódulo: Presentaron una forma esférica.
➢ Color: Externo: Marrón Interno: Rojizo
➢ Medidas: Largo: 2 mm Ancho: 1mm
3.9.2. Caracterización de las colonias de rhizobium en medio LMA (Levadura
Manitol Agar) a las 24,48 horas.
24 horas:
➢ Forma: Esférica
➢ Color: Transparente con consistencia lechosa.
➢ Elevación pulvinada: Convexa
➢ Borde: Entero
➢ Afinidad: +
➢ Precipitación: ++
➢ Apariencia: Lisa brillante

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➢ Consistencia: Gelatinosa
48 horas:
➢ Forma: Circular
➢ Color: Transparente lechoso
➢ Elevación pulvinada: Convexa
➢ Borde: Entero
➢ Afinidad: ++
➢ Precipitación: +++
➢ Apariencia: Lisa brillante
➢ Consistencia: Gelatinosa
[Link]ón de la reacción de las cepas a los 5 días de sembrarse en
medio de cultivo (LMA):
➢ pH: Cercano a la neutralidad 6.8 – 7.1
[Link]ón Bioquímica de las cepas de rhizobios aisladas
4.12.1. Tolerancia a diferentes valores de pH
Todas las cepas que toleraron pH 6.8 a 7.1 pertenecían al grupo de las
de crecimiento rápido
4.12.2. Crecimiento a diferentes temperaturas
Los datos expuestos en este estudio mediante este factor
condicionante están de acuerdo con Osa-Afiana y Alexander, que
encontraron que la temperatura máxima de crecimiento para los
rizobios de zonas tropicales es de 42 ºC. Además, Munévar concluye
que las cepas de rizobios son capaces de crecer a temperaturas de
entre 27 y 45 ºC, lo cual coincide con lo que se encontró en este
estudio.
4.12.3. Resistencia a Zn+2, Al+2 y Co+2
Los mismos autores encontraron que en este estudio, el cual encontró
que las cepas de crecimiento rápido (posiblemente Rhizobium)
toleraron la presencia de estos metales. De los tres metales evaluados,
la tolerancia al aluminio es una característica realmente deseable para
la selección de un bioinóculo principalmente en suelos ácidos, donde
éste suele acumularse. El Al+2 es un metal tóxico y el primer indicio
de su existencia es el descenso del crecimiento en longitud de las

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raíces. El Al+2 puede actuar inhibiendo el alargamiento y la división

celulares.
En suelos ácidos con pH de 5,0, donde la presencia de metales es
relevante, la presencia de Al+2 inhibe también la nodulación; se han
encontrado cepas de Rhizobium y Bradyrhizobiumque fueron
resistentes a Al+2 50mM a bajos pH (5,0). Johnson y Wood
reportaron que el Al+2 se enlaza al DNA de cepas sensibles y
tolerantes de rizobios, pero la síntesis de DNA no se afecta en las
cepas tolerantes de R. loti; entre tanto, Richardson y colaboradores
encontraron que 7,5 mM de Al+2 reprimen la expresión del gen nod.
4.12.4. Resistencia intrínseca a los antibióticos
La identificación y selección de cepas eficientes de rizobios se ha
llevado a cabo utilizando diferentes metodologías; dentro de éstas, la
resistencia intrínseca a antibióticos es útil por su fiabilidad a bajos
niveles de antibiótico, estabilidad y reproducibilidad durante un largo
período. Aunque la variación en la resistencia de cepa a cepa puede
ser notable, en general, los rizobios de crecimiento rápido son
intrínsecamente más sensibles que los de crecimiento lento a
estreptomicina, contrario a lo hallado en este trabajo, en el cual las
cepas de crecimiento rápido fueron más resistentes a las
concentraciones de estreptomicina que las cepas de crecimiento lento.
En las cepas de crecimiento rápido resistentes a estreptomicina se
encontró alta sensibilidad a la concentración de 500 ppm de
ampicilina, pero alta resistencia a 500 ppm de cloranfenicol.

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4.13. Formato guía para evaluar la morfología de nódulos presentes en raíces de

(sp evaluada)

Parcela agrícola: Sotobosque Muestra Nº: 01

CARACTERÍSTICAS EXTERNAS:
a. Color: Marrón

b. Forma: Esféricos
c. Tamaño. Diámetro promedio de los nódulos: 1 mm
d. Distribución: Raíces laterales
e. Tipo de nodulación: Nodulación de raíz lateral
f. Número: 35 nódulos
CARACTERÍSTICAS INTERNAS
a. Color: Rojizo

OBSERVACIONES ADICIONALES: Desmodium, en general, puede fijar alrededor

de 90 kg de N/ha/año. Desmodium como plantas que nodulan con un amplio rango de
cepas de Rhizobium, pero esta nodulación frecuentemente resulta inefectiva,
presentando 2 subgrupos de inoculación, por lo que se hace necesario el empleo de una
cepa eficiente.

[Link] de la evaluación morfológica de nódulos.

Cuando realizamos una recolección de nódulos de leguminosas, obtenemos

varias muestras procedentes de diferentes lugares registrando sus características
de la siguiente manera.

Tabla N° 01 Evaluación Morfológica de nódulos

Parcela N° N° de Diámetro Distribución Forma Tamaño Color Color Superficie
Nódulos por Promedio en la raíz (mm) Externo interno
planta
1 35 2mm Raíces Esférica 1 mm Marrón Rojizo Entero
laterales

5. AISLAMIENTODE LOS RIZOBIOS

5.1. Desinfección de nódulos

Para el procesamiento de las muestras se tuvieron en cuenta las técnicas descritas por
el Centro Internacional de Agricultura Tropical y Somesagaran. Los nódulos fueron
sumergidos en alcohol al 70 % (1 min) e hipoclorito de sodio al 2% (4 min), finalmente se
realizaron siete lavados diferentes de nódulos con agua destilada estéril con el fin de eliminar

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las trazas de hipoclorito de sodio, y evitar de esta manera la contaminación por cualquier
tipo de microorganismos diferentes a los géneros bacterianos de interés. Tras ser lavados, a
los nódulos, se les debe verificar mediante un estudio macroscópico la actividad de la
nitrogenasa, identificada como positiva al observar una coloración rojiza en su interior, que
indica la producción de leghemoglobina. Luego se debe realizar las pruebas de pureza a fin
de descartar la presencia de contaminantes; la caracterización de las cepas y la autenticación
para confirmar la inducción de nodulación y producción de nitrogenasa.

El lavado se repite 7
veces
Figura 6. Esquema de desinfección de Rhizobium

Tabla 2: Aislamiento de rizobios de nódulos (CIAT, 1987).

Desinfección Tiempo

Desinfección con alcohol al

1 minuto por cultivo
70 %

Hipoclorito de Na 3% 3 minutos por cultivo

Agua destilada (enjuague 5

3 minutos por cultivo
veces)

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Separación de nódulos viejos

Pasamos los nódulos

esterilizados a la placa estéril

Triturado de los nódulos y

siembra por estría en medio
LMA.

Sembrar y fijar la muestra

Incubar a 28°C y
24 a 72 horas
conservación de cepas a 4°C

5.2. Preparación del medio de aislamiento

El cultivo que se utiliza es original Vicent, 1975 Ferrera Cerrato et al 1993 (EL MARC).

Tabla 3: Composición del medio El MARC

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Componente Cantidad
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 7H2O 0,2 g
NaCl 0,1 g
Manitol 10,0 g
Extracto de levadura 0,5 g
Agar 15,0 g
Solución roja de Congo (*) 1ml
Agua destilada 1000 ml
pH 6.5 – 6.8

Completar a 1000 ml con agua destilada, corregir el pH a 6.8 con NaOH (0.5 N)
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 120 grados centígrados y 15 libras de presión;
Se distribuye el medio en cajas Petri estériles en una proporción de 2025 ml.

• Solución Rojo de Congo

✓ 1g rojo de Congo
✓ 400ml de agua destilada estéril

[Link] de bacterias

Cuando los nódulos han sido esterilizados, se trituran colocando en un tubo de

ensayo con 5 ml de agua destilada y se maceran. De cada tubo se toma una muestra de la
suspensión y se siembra en estrías en cajas de Petri con medio de cultivo ELMARC, se
incuba a 28 ºC por un periodo de 3 a 10 días, para observar el crecimiento de las colonias
de bacterias (Ángeles-Núñez y Cruz Acosta, 2015; Vincent, 1970).

Figura 7. Siembra del contenido del nódulo en cajas Petri.

Para la purificación de los aislados, de cada caja se seleccionan aquellas colonias
blancas o ligeramente rosadas, con poca o nula absorción de rojo Congo, característica
de las bacterias de Rhizobium (Pérez et al., 2008). Las colonias seleccionadas se
resiembra cinco veces en cajas de Petri siguiendo el mismo procedimiento.

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[Link]ón Gram

La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian

Gramen el año 1884. En la cual, las colonias seleccionadas debían estar formadas por
bacterias Gram negativas y de tipo bacilar.

Procedimiento:
• Colocamos una gota de agua estéril en una lámina portaobjetos.

Figura 8. Incorporación de agua estéril

• Tomamos la muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada, del cultivo de
las colonias extendiéndola en el cubreobjetos.

Figura 9. Expansión de las colonias de Rhizobium.

• Fijar la muestra, colocar el portaobjetos con el frotado sobre el mechero con
movimientos circulares o en zig zag por encima de la llama del mechero, levantando
constantemente la muestra para que no se nos queme, la muestra debe quedar totalmente
seca y por lo tanto fijada.

Figura 10. Etapa de la fijación de la muestra de Rhizobium.

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• Tinción, una vez seco, se echan sobre el frotis 3 o 4 gotas de violeta de genciana o
cristal de violeta y se deja actuar durante un minuto (algo más si la temperatura es muy
inferior a 23 grados) Deberá reposar sobre un recipiente sujeto por rejilla o agitadores
de vidrio. Transcurrido el tiempo, se debe lavar la lámina al grifo o con frasco lavador.
El agua debe caer desde arriba suavemente en chorro fino, nunca directamente sobre la
muestra.

Figura 11. Etapa de la tinción con violeta de genciana.

• Decolorar aplicando Lugol durante 1 minuto. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble con el azul de genciana o el cristal de violeta.

Figura 12. Aplicación de Lugol a la muestra de Rhizobium.

• Observar al microscopio, con aceite de inmersión, se verán todas las células azules,
tanto las Gram+ como las Gram-. Pasado el minuto, se decolora el frotis con alcohol o
una mezcla de alcohol-acetona, con cuidado, dejándolo escurrir sobre la muestra hasta
que el líquido escurra transparente, sin color azul.

Figura 13. Decoloración del frotis con alcohol.

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• Pasado el minuto, se decolora el frotis con alcohol o una mezcla de alcohol-acetona,

con cuidado, dejándolo escurrir sobre la muestra hasta que el líquido escurra
transparente, sin color azul.

Figura 14. Decoloración del frotis con alcohol.

• Tinción de contraste con un colorante rojo (safranina o fucsina) para poder observar
todas las bacterias a la vez. Recordemos que las Gram – nos han quedado incoloras y
no las podemos ver.

Figura 15. Tinción de contraste con safranina.

• Se lava con agua para quitar los restos de alcohol. Se deja secar el portaobjeto al aire
libre. luego se procede a la tinción de contraste utilizando, safranina o fucsina básica y
se deja actuar durante un minuto. Pasado el minuto, se enjuaga el portaobjetos con agua
con el mismo método que la vez anterior. Se deja escurrir el agua y se seca al aire.

Figura 16. Extracción de los restos de alcohol.

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• Observación. Se coge la muestra y se pone encima un cubreobjetos. Se le echa por

encima una gota de aceite de inmersión. Se observa con el microscopio de 100
aumentos, con cuidado de que no lo acerquemos demasiado al cubreobjetos porque se
rompería.

Figura 17. Observación al microscopio.

Figura 18. Procedimiento de la coloración Gram

Figura 19. Observaciones al microscopio de bacilos de rhizobium Gram –

Nota: Los rhizobios son bacilos Gram-

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6. Velocidad de crecimiento de las cepas de Rhizobium

Tabla 4: Velocidad de crecimiento de las cepas de Rhizobium.
Cepas Velocidad Origen NaCl Temperatura Al+2 pH
1 2 días NC + 28 °C + 6.8-7.2 (+)
2 5 días NC + 28°C + 4- 5.5(-)
NC: Namora-Cajamarca
+: Crecimiento
-: Inhibición de crecimiento
GRÁ[Link] DE CRECIMIENTO DE RHIZOBIUM

Velocidad Temperatura pH

28°C 28°C

6.8
5 5.5
2

1 2
Número de cepas

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7. INOCULACIÓN A PARTIR DE CULTIVOS PUROS DE RIZOBIOS

Se desarrollo dos tipos de inoculación detallados a continuación:

7.1. Inoculación simple
Es uno de los métodos más antiguos, que consiste en la mezcla del inoculante con
la semilla en la proporción. Un mejoramiento de este método es humedecer la
semilla o disolver el inoculante. Si se usa agua con azúcar es mejor porque mejora
la adherencia y supervivencia del inóculo.
Materiales
✓ Azúcar 10g
✓ Agua destilada
✓ Semilla limpia (Medicago sativa)
✓ Inoculante para leguminosas 1sobre/10Kg semilla
✓ Bandeja
✓ Matras Erlenmeyer

Procedimiento

1. Primero se hace la solución azucarada agregando unos 10 gramos de

azúcar y completamos los 100 mL con agua destilada.

Figura 20. Observaciones de la solución azucarada.

2. Luego se disuelve el inoculante en el agua azucarada revolviendo
enérgicamente hasta lograr una disolución homogénea.

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Recolección, aislamiento y caracterización de Rhizobium E.A.P Agronomía

Figura 21. Inoculante de leguminosas Rhizocaj

3. Por último, puede disponerse la semilla en una bandeja y posterior a ello
revolver con la mano y mezclar con el inoculante.

Figura 22. Inoculación simple de Medicago sativa.

4. Una vez inoculada la semilla debe sembrarse el mismo día. Esta siembra
puede ser en días nublados (tarde o maña). Si esta inoculación se realiza
en campo, debe mantenerse en la sombra.

Figura 23. Siembra de Medicago sativa con Rhizocaj.

7.2. Peleteado
También se le llama pelletizado o pildorización. El producto de este método es un
pelle o píldora formada por: la semilla, el inoculante y una capa de carbonato de
calcio. El objetivo de este método es dar las mejores condiciones al inoculante para
lograr la nodulación óptima en condiciones difíciles de suelo. La capa de carbonato
de calcio cumple, entre otras, las siguientes funciones:

✓ Mejora la supervivencia de los rizobios en la cercanía de la semilla cuando

se siembra en suelos ácidos.

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✓ Además de facilitar una buena nodulación, reduce las necesidades de cal

como correctora de acidez del suelo. Esta función es más importante cuanto
mayor sea la acidez en relación con la requerida por la planta.
✓ Mejora la supervivencia del inóculo si el pelle queda en seco, pues reduce su
desecación.
✓ También puede mejorar las relaciones con la humedad del suelo, actuando
como conductor de ésta hacia la semilla, es decir, como humectante,
mejorando la germinación y nodulación.

✓ Reduce los efectos nocivos de los fertilizantes ácidos sobre el incoulante.

Figura 24. Esquema del corte de un pelleteado de semilla de leguminosa.

Procedimiento de inoculación

1. Preparación de la solución adherente.

2. Disolución del inoculante.
3. Mezcla de la semilla con la solución inoculante.
4. Adición de carbonato de calcio que se usa en el proceso de pelletización.
5. La semilla inoculada se extiende a la sombra si se desarrolla en campo.
6. La siembra debe realizarse el mismo día.

Figura 25. Inoculación con pelleteado de semilla de leguminosa.

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Recolección, aislamiento y caracterización de Rhizobium E.A.P Agronomía

7. RESULTADOS Y DISCUSIONES

❖ De los diferentes tipos de inoculación presentes se puede inferir que el más eficiente
y además uno de los métodos más antiguos, es el método simple el cual se realizó
una mezcla del inoculante con la semilla en la proporción. Un mejoramiento de este
método es humedecer la semilla o disolver el inoculante. Si se usa agua con azúcar
es mejor porque mejora la adherencia y supervivencia del inóculo.
❖ El aislamiento de los nódulos se tiene en cuanta que estos estén sanos y tengan mayor
tamaño para una mayor producción de Rizobium.
❖ A pesar de la escasa presencia de nódulos radiculares en la especie vegetal
Desmodium intortum se ha logrado obtener Rizobium para la inoculación.
❖ D. intortum, al inocular una buena cepa de Rhizobium hay un beneficio amplio,
aunque al transcurrir el tiempo la proporción de cepas salvajes que se encuentran en
los nódulos se hace mayor, debido a que la planta estimula el desarrollo de las
bacterias nativas, que pueden competir fuertemente con la cepa inoculada.
❖ Desmodium, en general fija alrededor de 90 kg de N/ha/año. Desmodium como
plantas que nodulan con un amplio rango de cepas de Rhizobium, pero esta
nodulación frecuentemente resulta inefectiva, presentando 2 subgrupos de
inoculación, por lo que se hace necesario el empleo de una cepa eficiente.
❖ El tipo de inoculación llamada peleateado además de tener un nivel efectivo da las
mejores condiciones al inoculante para lograr la nodulación óptima en condiciones
difíciles de suelo.

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8. CONCLUSIONES

• La asociación Rhizobium-leguminosa es un proceso de alta eficiencia en

fijación biológica del nitrógeno atmosférico (FBN) y puede ser capaz de
abastecer hasta 90 % de las necesidades de nitrógeno en dichas plantas.
• La tinción Gram identifico a las bacterias de Rhizobium, quienes pertenecen a
la familia Gram negativas y al ser observadas en el microscopio presentan una
coloración rosado transparente y una forma de bastón.
• Es importante la siembra de rizhobium de leguminosas, para poder inocular en
semillas así de esta manera obtendremos una mejor producción de cultivo.
• La inoculación correcta en semillas ayudara a estas en su crecimiento y
desarrollo vegetativo, así como también los rizhobium ayudaran en la fijación
de nitrógeno.
• Gracias a la tinción Gram pudimos identificar a las bacterias de Rhizobium que
pertenecen a la familia de las Gram negativas y presentan un color rosado.

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9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Moreno-Chirinos, Z. E., Valdez-Núñez, R. A., Soriano-Bernilla, B. S., & Ruesta-

Campoverde, N. A. (2016). Nodulation efficiency by native rhizobia from nodules
of Pisum sativum “pea” collected from different Departments of Peru. Scientia
agropecuaria, 7(SPE), 165–172. [Link]

(S/f). [Link]. Recuperado el 8 de mayo de 2022, de

[Link]

(S/f-b). [Link]. Recuperado el 8 de mayo de 2022, de

[Link]

25