Ciencias Marinas

Universidad Autónoma de Baja California

[email protected], [email protected]
ISSN (Versión impresa): 0185-3880
MÉXICO

2007
KKIU. Arunakumara / Z. Xuecheng / X. Song
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA BIOACUMULACIÓN DEL PLOMO Y CADMIO EN
CIANOBACTERIAS SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803 BAJO CONDICIONES DE
LABORATORIO
Ciencias Marinas, septiembre, año/vol. 33, número 003
Universidad Autónoma de Baja California
Ensenada, México
pp. 271-280

Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal

Universidad Autónoma del Estado de México

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Ciencias Marinas (2007), 33(3): 271–280

Estudio comparativo de la bioacumulación del plomo y cadmio en cianobacterias

Synechocystis sp. PCC 6803 bajo condiciones de laboratorio

Comparative study on bioaccumulation of lead and cadmium by the cyanobacterium

Synechocystis sp. PCC 6803 under laboratory conditions

KKIU Arunakumara*1, 2, Z Xuecheng1, X Song1

1 College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, People’s Republic of China.
* E-mail: [email protected]
2 Department of Crop Science, Faculty of Agriculture, University of Ruhuna, Kamburupitiya, Sri Lanka.

Resumen

Con el objeto de limpiar cuerpos de agua que han sufrido contaminación por metales pesados, se han desarrollado técnicas
de biorremoción. En el presente estudio de laboratorio, se evaluó la bioacumulación de Pb2+ y Cd2+. Se utilizaron cianobacterias
Synechocystis sp. PCC 6803, organismo modelo que ha sido utilizado ampliamente en estudios genéticos, fisiológicos y
morfológicos. El crecimiento fue medido mediante el conteo de células, revelando que a bajas concentraciones de Pb2+ (0.5 y 1
µg mL–1) su influencia es positiva en Synechocystis sp. PCC 6803 resultando en una ligera estimulación del crecimiento. Sin
embargo, la especie no pudo resistir periodos largos expuesta a concentraciones altas de ambos metales (2, 4, 6 y 8 µg mL–1).
Las inhibiciones más altas registradas despues del periodo de incubación de 6 días fueron de 53.14% y 70.07% para Pb2+ y Cd2+
respectivamente a una concentración de 8 µg mL–1. Se observó una rápida remoción de los metales durante los dos primeros días
de incubación, seguida por una reducción gradual. Sin embargo, sólo se pudo encontrar una pequeña diferencia en la cantidad
acumulada, ya que el porcentaje de Pb2+ removido de la solución fue mayor que el del Cd2+ en todos los tratamientos. Aunque las
diferencias entre las cantidades acumuladas de los dos metales son muy reducidas, el porcentaje de Pb2+ removido de la solución
fue más alto que el de Cd2+ en el transcurso de incubación. Las cantidades de metal acumulado aumentaron en una relación
dependiente de la dosis para ambos metales. Las máximas acumulaciones (155.63 y 199.83 mg g–1 de peso seco,
respectivamente para Pb2+ y Cd2+) se registraron después de 6 días. La especie resultó ser un buen acumulador de metales con
altos factores de bioconcentración, de 20 657 y 24 980 respectivamente para Pb2+ y Cd2+.

Palabras clave: Synechocystis sp. PCC 6803, crecimiento, cantidades acumuladas, factor de bioconcentración.

Abstract

Bioremoval techniques have been employed in cleaning water bodies that suffer from detrimental effects of heavy metal
pollution. In the present laboratory study, bioaccumulation of Pb2+ and Cd2+ was assessed using the unicellular cyanobacterium
Synechocystis sp. PCC 6803, a model organism widely used in genetic, physiological and morphological studies. Growth was
measured as cell counts and showed that Pb2+, at low exposure concentrations (0.5 and 1 µg mL–1), had a positive influence on
Synechocystis sp. PCC 6803, resulting in slight growth stimulations; however, the species could not withstand long periods of
exposure to both metals at higher concentrations (2, 4, 6 and 8 µg mL–1). The highest inhibitions (53.14% and 70.07% for Pb2+
and Cd2+, respectively, at 8 µg mL–1) were recorded after six days. Rapid metal removal was observed during the first two days
of incubation, followed by a gradual reduction. Though the differences in accumulated amounts seemed to be narrow, the
percentage of Pb2+ removed from the solution was always higher than that of Cd2+ in all the treatments. Accumulated amounts
increased in a dose-dependent manner for both metals. The maximum accumulations (155.63 and 199.83 mg g–1 dry weight for
Pb2+ and Cd2+, respectively) were recorded at the end of six days. The species can be considered a good accumulator of metals,
with high bioconcentration factor values of 20 657 and 24 980 for Pb2+ and Cd2+, respectively.

Key words: Synechocystis sp. PCC 6803, growth, accumulated amount, bioconcentration factor.

Introducción Introduction

La contaminación del ambiente acuático con metales pesa- Contamination of aquatic environments by heavy metals is
dos es un tema de constante preocupación (Srivastava y a subject of constant concern (Srivastava and Purnima 1998).
Purnima 1998). La biodegradación lenta de metales pesados The biodegradation of heavy metals is hazardous for all organ-
crea riesgos a todos los organismos (Sresty y Rao 1999), en isms (Sresty and Rao 1999), and in particular, bioaccumulation
particular, su bioacumulación en la cadena alimentaria acuática in the aquatic food chain is highly dangerous (Sanita-di-Toppi

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 Ciencias Marinas, Vol. 33, No. 3, 2007

es muy peligrosa (Sanita-di-Toppi y Gabbrielli 1999). La bio- and Gabbrielli 1999). Bioremoval, defined as the accumulation
rremoción, definida como la acumulación y concentración de and concentration of pollutants from aqueous solutions by the
contaminantes presentes en soluciones acuosas mediante use of biological material (Sag and Kutsal 1997), is a potential
materiales biológicos (Sag y Kutsal 1997), es una alternativa alternative to conventional methods of heavy metal removal
potencial a métodos convencionales para eliminar metales (Veglio et al. 1995). In this context, plant species that can pro-
pesados (Veglio et al. 1995). En este contexto han llamado la cess heavy metals have drawn considerable attention due to
atención algunas especies de plantas que son capaces de their efficient and ecologically sound approach (Srivastava and
procesar metales pesados, debido a su eficiencia y eficacia Purnima 1998). Aquatic plants and microorganisms are able to
ecológica (Srivastava y Purnima 1998). Plantas y microorga- remove metals from water through the processes of biosorption
nismos acuáticos son capaces de remover metales del agua and metabolism-dependent bioaccumulation (Wang et al.
mediante procesos de bioabsorción y bioacumulación asocia- 1998). Such is the case of the seagrass Cymodocea nodosa in
das al metabolismo (Wang et al. 1998); tal es el caso de la which Marín-Guirao et al. (2005) analyzed metal bioaccumula-
fanerógama marina Cymodocea nodosa en la que Marín- tion as part of a pollution assessment in the Mar Menor coastal
Guirao et al. (2005) estudiaron la bioacumulación de metales lagoon (SE Spain).
como parte de una evaluación de la contaminación en la laguna Due to their ubiquitous occurrence in nature and metabolic
costera del Mar Menor (SE de España). uptake with continuous growth, microalgae are considered
Debido a su amplia presencia en la naturaleza y su asimila- ideal candidates for metal bioaccumulation studies (Sobhan
ción metabólica con crecimiento continuo, las microalgas son and Sternberg 1999). Several aspects of metal removal by
consideradas candidatas ideales para realizar estudios de bio- algae have been researched and well documented (Sudhakar et
acumulacion de metales (Sobhan y Sternberg 1999). Ya se han al. 1991, Holan and Volesky 1994, deCarvalho et al. 1995).
hecho estudios y se ha documentado sobre varios aspectos de The intracellular polyphosphate bodies of living algae are
la eliminación de metales por medio de algas (Sudhakar et al. known to be responsible for metal sequestration (Zhang and
1991, Holan y Volesky 1994, deCarvalho et al. 1995). Majidi 1994). Moreover, the cell wall components of micro-
Se sabe que los cuerpos intracelulares de polifosfatos de las organisms, such as polysaccharides, proteins and lipids, could
algas vivas son los responsable del secuestro de metales offer many functional groups that can bind metal ions (Ari et
(Zhang y Majidi 1994). Además, componentes de la pared al. 1999). Cyanobacteria, a numerous and diverse group of
celular de microorganismos tales como polisacáridos, proteínas photosynthetic prokaryotes, have been employed extensively
y lípidos, ofrecen muchos grupos funcionales que pueden ligar in metal exposure assessments. The unicellular cyanobacte-
iones metálicos (Ari et al. 1999). Las cianobacterias, un nume- rium Synechocystis sp. PCC 6803 is a model organism that
roso y diverso grupo de procariotas fotosintéticos, se han displays a unique combination of highly desirable molecular,
empleado ampliamente en evaluaciones de exposición con genetic, physiological and morphological characteristics. This
metales. La cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC species has thus been used in several studies regarding photo-
6803 es un organismo modelo que presenta una combinación synthetic processes, assembly pathways, electron transfer
única de características moleculares, genéticas, fisiológicas y reactions involved in photosynthesis and chloroplast evolution
morfológicas, y ha sido utilizada en varios estudios sobre (Kashino et al. 2002, Roose and Pakrasi 2004). Strains of
procesos fotosintéticos, reacciones de transferencia de electro- Synechocystis sp. have shown to develop a thickened calyx
nes involucradas en la fotosíntesis y el desarrollo de los when exposed to copper-stressed growth conditions (Gardea-
cloroplastos (Kashino et al. 2002, Roose y Pakrasi 2004). Se Torresdey et al. 1996). The present study focused on the
demostrado que las cepas de Synechocystis sp. desarrollan un bioaccumulation of lead and cadmium by the unicellular
cáliz grueso cuando crecen expuestas a estrés con cobre cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 under laboratory
(Gardea-Torresdey et al. 1996). El presente estudio estuvo conditions.
enfocado en la bioacumulación de plomo y cadmio en las
cianobacterias unicelulares Synechocystis sp. PCC 6803 en Material and methods
condiciones de laboratorio.
Experimental strain
Materiales y Métodos
The strain Synechocystis sp. PCC 6803 was taken from the
Cepa experimental axenic stock cultures preserved in our laboratory at the College
of Marine Life Sciences, Ocean University of China. The
Se tomó Synechocystis sp. PCC 6803 del stock de algas cultures were grown in BG11 medium (Rippka et al. 1979)
cultivadas y preservadas en el laboratorio del Colegio de adjusted to pH 7.0 at 25 ± 1ºC. They were gently stirred and
Ciencias de la Vida Marina, de la Universidad del Océano, de illuminated with white light produced by neon tubes at an
China. La cepa experimental fue cultivada en medio BG11 intensity of 50 mmol photon m–2 s–1 under a 14:10-h light/dark
(Rippka et al. 1979) ajustado a pH 7.0 y a 25 ± 1ºC, agitada cycle. At the late exponential growth phase, cultures were
suavemente e iluminada con luz blanca fluorescente a una centrifuged at 4000 g for 10 min and the pellets were

272
 Arunakumara et al.: Bioaccumulation of lead and cadmium by Synechocystis sp. PCC 6803

intensidad de 50 fotón mmol m–2 s–1 con un ciclo luz:oscuridad resuspended in fresh BG11 medium in order to be used in the
14:10 h. En la fase de crecimiento exponencial tardío, los culti- metal treatments.
vos fueron centrifugados en 4000 g durante 10 min y las
células fueron resuspendidas en medio BG11 fresco antes de Apparatus, chemical products and analytical methods
ser usados en los respectivos tratamientos con metales.
The chemicals were of analytical grade and used without
further purification. Deionized water from a Millipore Milli-Q
Aparatos, productos químicos y métodos analíticos
system was used throughout the experiment. Lead and cad-
Se utilizaron productos químicos de grado analítico sin mium stock solutions of 1000 µg mL–1 were prepared using
purificación adicional. En todos los experimentos el agua fue Pb(NO3)2 and CdCl2, respectively, and all working solutions
ionizada mediante el sistema Millipore Milli-Q. La concentra- were prepared by properly diluting the stock solutions. An
ción de las soluciones de plomo y cadmio fue de 1000 µg mL–1, atomic absorption spectrophotometer (PGeneral, TAS-986)
utilizando Pb(NO3)2 y CdCl2, respectivamente, a partir de was used to determine Pb2+ and Cd2+ concentrations in the
solución madre. Para determinar la concentración de Pb2+ y medium, and optical density was measured using a spectro-
Cd2+ en el medio se utlizó espectrofotometría de absorción photometer (UV-2102). All measurements of weight were
atómica (PGeneral, TAS-986), mientras que la densidad óptica performed using a digital balance (Sartorins, BS 210S), and pH
fue medida usando un espectrofótometro UV-2102. Todas las of the medium was measured with a pH/ISE meter
mediciones de peso se realizaron en una báscula digital (model 868).
(Sartorins, BS 210S) y el pH del medio fue medido con un
Bioaccumulation
aparato pH/ISE modelo 868.
Bioaccumulation studies were carried out separately for
Análisis de bioacumulación two metals using 150-mL elementary flasks that contained
100 mL of algal suspensions (initial OD750 = 0.1). The algal
Los análisis de bioacumulación se llevaron a cabo por sepa- suspensions were treated with several initial metal concen-
rado para los dos metales utilizando frascos simples de 150 mL
trations (0, 0.5, 1, 2, 4, 6 and 8 µg mL–1) and homogenized
de capacidad con 100 mL de suspensión algal (OD750 inicial =
continuously in a rotary shaker at 100 rpm. The incubation was
0.1). Las suspensión algal fue tratada inicilamente con varias carried out for six days under the conditions described above.
concentraciones de metal (0, 0.5, 1, 2, 4, 6 y 8 µg mL–1) y From each suspension, 5-mL aliquots were withdrawn once
homogeneizada continuamente en una coctelera rotatoria de every two days, centrifuged at 15,000 rpm for 10 min and the
100 rpm. La incubación fue realizada durante 6 días en las con- supernatant was separated for determinations of total dissolved
diciones anteriormente mencionadas. Cada dos días se tomaron metal concentration in the medium. The accumulated amount
alícuotas de 5 mL de cada suspensión, las cuales fueron centri- (q) of metal (mg g–1 dry weight) was calculated using the
fugadas a 15,000 rpm por 10 min separando el sobrenadante simple concentration difference method (Volesky and Holan
para determinar las concentraciones metálicas en el medio. Se 1995):
calculó la cantidad acumulada (q) de metal (mg g–1 peso seco)
usando el método diferencial de concentración simple (Volesky q = ( C 0 – C t )V/W
y Holan 1995):
where C0 is the initial metal concentration in the medium
q = ( C 0 – C t )V/W (mg L–1), Ct is the metal concentration at time t (mg L–1), V is
the total volume of suspension (L) and W is the dry weight of
donde C0 es la concentración inicial del metal en el medio the alga (g).
(mg L–1), Ct es la concentración del metal al tiempo t de incu- The ratio between the accumulated amount, which included
bación (mg L–1), V es el volumen total (L) y W es el peso seco metal bound in cell-wall adhering precipitate plus that accumu-
del alga (g). lated in the cells, and the metal concentration in the solution
Para calcular el factor de bioconcentración (BCF) se utilizó was used to calculate the bioconcentration factor (BCF). [The
la proporción entre la cantidad acumulada, que incluía el metal degree to which a contaminant will concentrate in an organism
contenido en el precipitado adherido a la pared celular y el is expressed as BCF; thus, a BCF of 100 means that the organ-
acumulado en las células, y la concentración de metal en la ism concentrates the chemical to a concentration 100 times
solución. [El grado al que un contaminante se concentrará en greater than in the surrounding media.] Algal growth was
un organismo es expresado como BCF; así, un BCF de 100 sig- monitored by recording optical density at 750 nm and direct
nifica que el organismo concentra la sustancia química 100 cell counts (XB-K-25, Shanghai, 0.1 mm deep) under a light
veces más que los medios circundantes.] Se monitoreó el creci- microscope (Olympus, Transmission, LM). The linear relation-
miento de las algas registrando la densidad óptica a 750 nm y ship, dry weight (g L–1) = 0.3574 × OD750 nm (r = 0.9923),
mediante el conteo directo de las células (XB-K-25, Shanghai, derived in this study was used to estimate the algal dry weight
0.1 mm de hondo) al microscopio (Olimpo, Transmisión, LM). at relevant OD values. To measure the algal dry weight, cells

273
 Ciencias Marinas, Vol. 33, No. 3, 2007

Se utilizó la relación lineal encontrada en el presente estudio were filtered through a 0.22-µm membrane and dried at 103ºC
[peso seco (g L–1) = 0.3574 × OD750 nm (r = 0.9923)] para esti- for 2 h. All procedures were perfomed in triplicate under
mar el peso seco de algas en valores de OD relevantes. A fin de aseptic conditions.
medir el peso seco de algas, las células fueron filtradas a través
de una membrana de 0.22 µm, y luego secadas a 103ºC por 2 h. Results
Todos los procedimientos fueron realizados en condiciones
asépticas y los resultados fueron obtenidos por triplicado en Growth
cada una de las muestras de cultivo.
Growth measured as cell counts is illustrated in figures 1
Resultados and 2 for Pb2+ and Cd2+ exposure, respectively. Low concentra-
tions of Pb2+ (0.5 and 1 µg mL–1) had a positive influence on
Crecimiento Synechocystis sp. PCC 6803, producing slight growth stimula-
tions (2.69% and 6.99% after two days); however, at
El resultado del crecimiento en las células expuestas a Pb2+ concentrations higher than 2 µg mL–1 the species could no
y Cd2+ es ilustrado en las figuras 1 y 2 respectivamente. Las longer withstand exposure to Pb2+. On the other hand, Cd2+ had
concentraciones bajas de Pb2+ (0.5 y 1 µg mL–1) podrían influir an adverse effect on growth even at very low concentrations
positivamente en Synechocystis sp. PCC 6803, resultando leves (13.95% inhibition at 0.5 µg mL–1). Furthermore, inhibitions
estímulos en su crecimiento (2.69% y 6.99% después de dos
caused by Cd2+ were considerably higher than those of Pb2+ at
días); sin embargo, la especie no pudo resistir por tiempos pro-
all concentrations. The highest inhibitions (53.14% and
longados concentraciones >2 µg mL–1 de Pb2+. Por otra parte,
70.07% for Pb2+ and Cd2+, respectively, at 8 µg mL–1) were
el Cd2+ pareció afectar adversamente el crecimiento aun a con- observed after six days.
centraciones muy bajas (13.95% de inhibición a 0.5 µg mL).
Además, las inhibiciones causadas por el Cd2+ resultaron consi-
Metal removal
derablemente mayores que las causadas por el Pb2+ en todas las
concentraciones. Las mayores inhibiciones (53.14% y 70.07% Removal of metals from the solution was high during the
respectivamente para Pb2+ y Cd2+ a 8 µg mL–1) se observaron first two days of incubation, followed by a gradual reduction
luego de 6 días. (table 1). Percentage removal of Pb2+ was higher than that of

Figura 1. Efecto de diferentes concentraciones de Pb2+ (µg mL–1) en el Figura 2. Efecto de diferentes concentraciones de Cd2+ (µg mL–1) en el
crecimiento (por conteo de células) de Synechocystis sp. PCC 6803 crecimiento (por conteo de células) de Synechocystis sp. PCC 6803
cultivada en medio BG11 (pH 7.0) bajo iluminación de 50 mmol fotón m–2 s– cultivada en medio BG11 (pH 7.0) bajo iluminación de 50 mmol fotón m–2 s–
1
a 25 ± 1oC. Media ± DE, n = 3. 1
a 25 ± 1oC. Media ± DE, n = 3.
Figure 1. Effect of different concentrations of Pb2+ (µg mL–1) on the growth Figure 2. Effect of different concentrations of Cd2+ (µg mL–1) on the growth
(by cell counts) of Synechocystis sp. PCC 6803 cultured in BG11 medium (by cell counts) of Synechocystis sp. PCC 6803 cultured in BG11 medium
(pH 7.0) under illumination of 50 mmol photon m–2 s–1 at 25 ± 1oC. Mean ± (pH 7.0) under illumination of 50 mmol photon m–2 s–1 at 25 ± 1oC. Mean ±
SD, n = 3. SD, n = 3.

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 Arunakumara et al.: Bioaccumulation of lead and cadmium by Synechocystis sp. PCC 6803

Tabla 1. Cambios en la concentración de metal en el medio. Media ± DE, n = 3.

Table 1. Changes in metal concentration in the medium. Mean ± SD, n = 3.

Residual metal concentration

in the medium (µg mL–1)
Treatment
Metal
(µg mL–1) Period of incubation (days)

2 4 6

Pb2+ 0.5 0.022 ± 0.009 0.034 ± 0.002 0.041 ± 0.004

1.0 0.133 ± 0.008 0.133 ± 0.005 0.120 ± 0.006
2.0 0.424 ± 0.008 0.502 ± 0.058 0.379 ± 0.023
4.0 0.763 ± 0.009 0.758 ± 0.015 0.728 ± 0.017
6.0 1.722 ± 0.050 1.718 ± 0.036 1.468 ± 0.033
8.0 2.860 ± 0.018 2.842 ± 0.047 2.034 ± 0.061

Cd2+ 0.5 0.031 ± 0.010 0.033 ± 0.030 0.033 ± 0.003

1.0 0.138 ± 0.120 0.242 ± 0.013 0.248 ± 0.060
2.0 0.425 ± 0.032 0.525 ± 0.050 0.522 ± 0.050
4.0 1.781 ± 0.157 1.748 ± 0.153 1.658 ± 0.119
6.0 3.190 ± 0.048 2.919 ± 0.153 2.704 ± 0.036
8.0 4.271 ± 0.020 4.000 ± 0.021 3.541 ± 0.146

Remoción de metal Cd2+ at all concentrations, though the differences in the

accumulated amounts of both metals seemed to be narrow.
La remoción de metal de la solución fue mayor durante los Accumulated amounts of both metals increased with increased
dos primeros días de la incubación, seguido de una reducción metal concentration in the medium and exposure time;
gradual (tabla 1). El porcentaje de Pb2+ removido resultó mayor however, some exceptions were observed at lower concentra-
que el de Cd2+ para todas las concentraciones a lo largo del tions (e.g., 0.5 and 1 µg mL–1 of Cd2+, and 0.5, 1, 2 and 4 µg
periodo; sin embargo existen pocas diferencias entre las mL–1 of Pd2+), the accumulated amounts decreasing as the incu-
cantidades acumuladas de los dos metales. Las cantidades bation progressed. The maximum accumulations were 155.63
acumuladas de ambos metales aumentaron tanto con la
and 199.83 mg g–1 dry weight for Pd2+ and Cd2+, respectively,
concentración de metal en el medio como con el tiempo de
after six days (table 2).
exposición. Sin embargo, es posible ver algunas excepciones
cuando los organismos fueron expuestos a menores concentra-
Bioconcentration factor
ciones (por ejemplo, a 0.5 y 1 µg mL–1 Cd2+ y a 0.5, 1, 2, 4 µg
mL–1 Pd2+), donde las cantidades acumuladas disminuyeron
Figures 3 and 4 show the changes in BCF for Pb2+ and Cd2+,
conforme avanzó la incubación. Las acumulaciones máximas
respectively, during the six-day period. At low concentrations
fueron 155.63 y 199.83 mg g–1 peso seco para Pd2+ y Cd2+,
(0.5, 1, 2 and 4 µg mL–1), the BCF of Pb2+ showed a peak at
respectivamente, a los 6 días (tabla 2).
day 2, followed by a gradual decrease. A similar trend was
Factor de bioconcentración observed at low concentrations (0.5 and 1 µg mL–1) of Cd2+,
but at higher concentrations, the BCF continued to increase
Las figuras 3 y 4 (para Pb2+ y Cd2+, respectivamente) ilus- with time. Moreover, the highest BCF after two days exposure
tran los cambios de BCF durante el periodo de 6 días. En bajas was recorded for the lowest concentration (0.5 µg mL–1) of
concentraciones (0.5, 1, 2 y 4 µg mL–1), el BCF de Pb2+ alcanzó both metals.
un máximo en 2 días, seguido por una reducción gradual. A
concentraciones bajas de Cd2+ (0.5 y 1 µg mL–1) también se vió Discussion
una tendencia semejante, mientras que a concentraciones altas
el BCF continuó aumentado con el tiempo. Además, el BCF As it reflects the metabolism of the cell, growth proved to
más alto después de 2 días se registró a la menor concentración be a key indicator of metal toxicity to microorganisms. Cell
(0.5 µg mL–1) para ambos metales. density has often been used as a growth parameter in assessing
algal reponses to metal toxicity (Carr et al. 1998). Heng et al.
Discusión (2004) studied the effect of Cd2+ and Pb2+ on Anabaena
flosaquae and concluded that Cd2+ is more toxic to cyanobacte-
Como lo refleja el metabolismo de la célula, el crecimiento ria than Pb2+. Our findings confirmed this view, since 14%
resultó ser un indicador clave de la toxicidad metálica en growth inhibition was recorded at 0.5 µg mL–1 of Cd2+,

275
 Ciencias Marinas, Vol. 33, No. 3, 2007

Tabla 2. Cambios en la acumulación de Pb2+ y Cd2+ en células de Synechocystis sp. PCC 6803 cultivadas en medio
BG11 (pH 7.0) bajo iluminación de 50 mmol fotón m–2 s–1 a 25 ± 1oC. Media ± DE, n = 3.
Table 2. Changes in the accumulation of Pb2+ and Cd2+ in cells of Synechocystis sp. PCC 6803 cultured in BG11
medium (pH 7.0) under illumination of 50 mmol photon m–2 s–1 at 25 ± 1oC. Mean ± SD, n = 3.

Accumulated amount*
(mg g–1 dry weight)
Treatment
Metal
(µg mL–1) Period of incubation (days)

2 4 6

Pb2+ 0.5 10.35 ± 0.49 8.54 ± 0.36 6.85 ± 0.14

1.0 19.42 ± 0.74 15.38 ± 0.51 13.12 ± 0.25
2.0 34.19 ± 2.08 28.06 ± 0.81 24.21 ± 0.66
4.0 68.96 ± 2.76 55.79 ± 2.96 59.49 ± 0.31
6.0 107.33 ± 5.10 98.23 ± 0.66 111.39 ± 4.63
8.0 137.18 ± 4.38 129.81 ± 3.65 155.63 ± 8.97

Cd2+ 0.5 9.76 ± 0.19 8.60 ± 0.28 7.70 ± 0.31

1.0 18.07 ± 0.12 16.85 ± 0.09 16.45 ± 0.97
2.0 32.81 ± 0.07 34.54 ± 0.76 37.52 ± 0.75
4.0 53.23 ± 3.16 60.30 ± 3.30 63.86 ± 1.82
6.0 70.24 ± 1.18 83.30 ± 1.01 89.09 ± 1.84
8.0 93.17 ± 0.50 144.64 ± 3.14 199.83 ± 11.36
* Accumulated amount refers to the metal bound in cell-wall adhering precipitate plus that accumulated in the cells.

microorganismos. La densidad de células a menudo es usada whereas no considerable inhibition was recorded at the same
como un parámetro de crecimiento en la evaluación de la concentration of Pb2+. The high toxicity of Cd2+ at very low
respuesta de las algas a la toxicidad metálica (Carr et al. 1998). concentrations was further confirmed by Lasheen (1990), who
Heng et al. (2004) estudiaron el efecto del Cd2+ y el Pb2+ en reported algal growth inhibition even at 0.05 µg mL–1. Other
Anabaena flosaquae y concluyeron que el Cd2+ es más tóxico algal species that are highly sensitive to Cd2+ include Chlorella
para las cianobacterias que el Pb2+. Nuestras conclusiones con- vulgaris, Chlorella saccharophila, Skeletonema costatum,
firmaron su punto de vista, dado que el 14% de inhibición del Asterionella formosa and Selenastrum capricornutum, which
crecimiento se registró a 0.5 µg mL–1 de Cd2+ mientras que a la showed growth inhibitions at 0.06, 0.11, 0.05, 0.01 and 0.08 µg
misma concentración de Pb2+ no se registró ninguna inhibición mL–1 of Cd2+, respectively (Bartlett et al. 1974, Bertand et al.
considerable. La alta toxicidad de Cd2+ en muy bacas concen- 1977, Rosko and Rachlin 1977, Conway 1978, Rachlin et al.
traciones fue confirmada por Lasheen (1990), quien reportó 1982). We observed slight growth stimulations at low concen-
una inhibición del crecimiento de algas hasta 0.05 µg mL–1. trations of Pb2+, which is in agreement with El-Enany and Issa
Entre las especies de algas sumamente sensibles al Cd2+ están (2000), who also observed growth stimulations in Nostoc
Chlorella vulgaris, Chlorella saccharophila, Skeletonema linckia and Nostoc rivularis at 0.4 and 1.6 µg mL–1 of Cd2+ and
costatum, Asterionella formosa y Selenastrum capricornutum, Zn2+, respectively. Fathi et al. (2000) and Fathi (2002) reported
las cuales han mostrado inhibiciones del crecimiento a 0.06, a concentration-dependent reduction in cell counts of
0.11, 0.05, 0.01 y 0.08 µg mL–1 de Cd2+, respectivamente Anabaena spiroides and Scenedesmus bijuga. Fargasova
(Bartlett et al. 1974, Bertand et al. 1977, Rosko y Rachlin (1999) studied the effects of Cd2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+ and Fe2+ on
1977, Conway 1978, Rachlin et al. 1982). Observamos un leve the green alga Scenedesmus quadricauda and concluded that
estímulo al crecimiento con concentraciones bajas de Pb2+, lo toxocity for all the metals tested increased with increased metal
que coincide con El-Enany e Issa (2000), quienes observaron concentration. All these reports confirm the dose-dependent
también un estímulo en el crecimiento de Nostoc linckia y growth inhibition observed in the present study.
Nostoc rivularis a 0.4 y 1.6 µg mL–1, de Cd2+ y Zn2+ respectiva- Heavy metals that penetrate into the algal cell eventually
mente. Fathi et al. (2000) y Fathi (2002) observaron una compete for the protein-binding sites, active enzymes and
reducción dependiente de la concentración, en el número de several biological reactive groups, interrupting the routine
células de Scenedesmus bijuga y Anabaena spiroides. metabolic processes (Visviki and Rashin 1991). In the case of
Fargasova (1999) estudió los efectos del Cd2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+ Pb2+, membrane damage (in particular thylakoids) causing poor
y Fe2+ en el alga verde de Scenedesmus quadricauda y carbon assimilation seemed to be a major contributor to growth

276
 Arunakumara et al.: Bioaccumulation of lead and cadmium by Synechocystis sp. PCC 6803

Figura 3. Cambios del factor de bioconcentración (BCF) de Pb2+ para Figura 4. Cambios del factor de bioconcentración (BCF) de Cd2+ para
Synechocystis sp. PCC 6803 cultivada en medio BG11 (pH 7.0) bajo Synechocystis sp. PCC 6803 cultivada en medio BG11 (pH 7.0) bajo
iluminación de 50 mmol fotón m–2 s–1 a 25 ± 1oC. El BCF se refiere a la iluminación de 50 mmol fotón m–2 s–1 a 25 ± 1oC. El BCF se refiere a la
proporción entre la cantidad acumulada de Pb2+ y la concentración de Pb2+ proporción entre la cantidad acumulada de Cd2+ y la concentración de
en la solución. Media ± DE, n = 3. Cd2+ en la solución. Media ± DE, n = 3.
Figure 3. Changes in the bioconcentration factor (BCF) of Pb2+ for Figure 4. Changes in the bioconcentration factor (BCF) of Cd2+ for
Synechocystis sp. PCC 6803 cultured in BG11 medium (pH 7.0) under Synechocystis sp. PCC 6803 cultured in BG11 medium (pH 7.0) under
illumination of 50 mmol photon m–2 s–1 at 25 ± 1oC. The BCF refers to the illumination of 50 mmol photon m–2 s–1 at 25 ± 1oC. The BCF refers to the
ratio between the amount of Pb2+ accumulated and the concentration of ratio between the amount of Cd2+ accumulated and the concentration of
Pb2+ in the solution. Mean ± SD, n = 3. Cd2+ in the solution. Mean ± SD, n = 3.

concluyó que la toxicidad aumentó con el aumento en la inhibition. However, as reported by Vymazal (1995), the inter-
concentración de todos estos metales. Todos estos reportes actions of Pb2+ with polyphosphates may also negatively influ-
confirman que la inhibición de crecimiento es dependiente de ence growth as a result of phosphate precipitation. On the other
la dosis, tal y como se observó en el presente estudio. hand, growth inhibition caused by Cd2+ may link to interrupted
Los metales pesados que penetran en las células de las metabolic processes, since Cd2+ could interact with the thio
algas eventualmente compiten por los sitios que ligan a las components of cyanobacteria (Mushrifah and Peterson 1990)
proteinas, las enzimas activas y varios grupos biorreactivos, and N2/NO3– metabolism (Mallick and Rai 1994).
interrumpiendo procesos metabólicos de rutina (Visviki y Algal removal of metals from a solution can basically
Rashin 1991). En el caso de Pb2+, el daño a la membrana (en be described as a biphasic phenomenon, namely energy-
particular, thaylakoids) que causa una pobre asimilación del independent metal ion exchange with the ions present in the
carbono pareció ser la principal causa de la inhibición del cell wall and energy-dependent active uptake. In the case of
crecimiento. Sin embargo, según un reporte realizado por cyanobacteria, metal binding onto the cell surface or cell wall
Vymazal (1995), las interacciones del Pb2+ con polifosfatos is known to be the major mechanism (Mahan et al. 1989). This
también podrían influir negativamente en el crecimiento was further confirmed by Chojnacka and Mowoyta (2001),
debido a la precipitación del fosfato. Por otra parte, la inhibi- who studied the mechanism of heavy metal removal by
ción del crecimiento causada por el Cd2+ puede llevar a la Spirulina spp. The rapid metal removal we observed during the
interrupción de procesos metabólicos dado que el Cd2+ podría first two days of incubation could be the first adsorption stage
interactuar con los tiocomponentes de las cianobacterias as reported by Sloof et al. (1995) for cadmium uptake by living
(Mushrifah y Peterson 1990) y el metabolismo N2/NO3– Selenastrum capricornutum. The continued slow removal after
(Mallick y Rai 1994). the second day may be the physiological metabolic stage.
La remoción de metales en solución por las algas puede ser In fact, living microorganisms have the ability to regenerate
descrito básicamente como un fenómeno de dos fases, a saber: themselves and thus could continue to be effective in removing
intercambio independiente de la energía del ión metálico por metals as incubation progressed. The accumulated amount
los iones presentes en la pared celular y asimilación activa of metals increases with the exposure time and metal
dependiente de la energía. En el caso de las cianobacterias, se concentration in the medium (Lamaia et al. 2005). This dose-
sabe que la acumulación de metales en la superficie de la célula dependent accumulation pattern was also observed in Chlorella

277
 Ciencias Marinas, Vol. 33, No. 3, 2007

o pared celular es el mecanismo principal (Mahan et al. 1989). for Cd2+ and Zn2+ uptake (Costa and Leite 1990) and in
Esto fue reconfirmado por Chojnacka y Mowoyta (2001), Stichococcus bacillaris for Pb2+ (Pawlik 2000). The changes in
quienes estudiaron el mecanismo de eliminación de metales the accumulated amounts of the present study concur with the
pesados por Spirulina spp. La eliminación rápida del metal que above reports; however, when exposed to very low concentra-
observamos durante los primeros dos días de incubación podría tions, the results were slightly different.
ser la primera etapa de adsorción reportada por Sloof et al. In general, the accumulated amounts of Pb2+ and Cd2+
(1995) para la asimilación del cadmio por Selenastrum were high. Lamaia et al. (2005) reported that Cladophora
capricornutum. La posterior remoción lenta, del segundo día fracta could accumulate 61,400 mg g–1 of Pb2+ when exposed
en adelante, podría ser la etapa metabólica fisiológica. De to 80 µg mL–1, and 4,090 mg g–1 of Cd2+ when exposed to
hecho, los microorganismos vivos tienen la capacidad de 8 µg mL–1. Anabaena flos-aquae was able to accumulate
regenerarse a sí mismos y así continuar eliminando metales 70 mg g–1 of Pb2+ and 26 mg g–1 of Cd2+ at the respective
efectivamente conforme avanza la incubación. La cantidad exposures of 1 and 0.15 µg mL–1 (Heng et al. 2004). The maxi-
acumulada de metales aumenta con el tiempo de exposición y mum accumulated amounts of Pb2+ and Cd2+ in the present
la concentración de metal en el medio (Lamaia et al. 2005). study were 156 and 200 mg g–1, respectively, when exposed to
Esta pauta dependiente de la dosis en la acumulación se 8 µg mL–1. The diverse reports on accumulation ability are
observó también en Chlorella para Cd2+ y Zn2+ (Costa y Leite clear indications of the species-dependent manner of responses
1990) y Stichococcus bacillaris para Pb2+ (Pawlik 2000). Los to heavy metal exposure. Moreover, metal accumulation by
cambios en las cantidades acumuladas en el presente estudio algae is influenced by a number of abiotic (e.g., pH, chelating
están de acuerdo con los reportes anteriormente mencionados; agents, redox potential, temperature, light) and biotic (e.g.,
sin embargo, cuando las cianobacterias fueronn expuestas a cellular activity, algal biomass concentrations, extra cellular
concentraciones muy bajas los resultados fueron un poco products) factors (Fathi and Omair 2006).
diferentes. The BCF has been widely used to compare the metal accu-
En general, las cantidades acumuladas de Pb2+ y Cd2+ resul- mulation capacity of species (Raskin et al. 1994). Lamaia et al.
taron elevadas. Lamaia et al. (2005) reportaron que C. fracta (2005) reported that the BCF values of Pb2+ were significantly
acumuló 61,400 mg g–1 de Pb2+ al exponerse a 80 µg mL–1, higher than those of Cd2+. In this study, a similar trend was
mientras que al exponerse a 8 µg mL–1 la acumulación fue de observed on day 2, but as incubation progressed, the BCF
4,090 mg g–1 de Cd2+. Anabaena flosaquae acumuló 70 mg g–1 values for Cd2+ were higher than those for Pb2+. The decreased
de Pb2+ y 26 mg g–1 de Cd2+ al exponerse respectivamente a 1 y BCF values with increased metal concentrations are also simi-
0.15 µg mL–1 (Heng et al. 2004). La mayor cantidad acumu- lar to the findings of Lamaia et al. (2005). Our results also
lada de Pb2+ y Cd2+ en el estudio presente fue de 156 y 200 mg confirmed the views of Rai and Chandra (1992), who stated
g–1, respectivamente, después de la exposición a 8 µg mL–1. that ambient metal concentration is the major factor influenc-
Diversos informes de la capacidad de acumulación indican ing metal uptake efficiency and concomitantly the BCF values.
claramente que esta depende de la respuesta específica a la To be an ideal candidate for phytoremediation, a good accumu-
exposición a metales pesados; además de que la acumulación lator should possess a BCF of more than 1000 (Zayed et al.
metálica por las algas está influenciada por varios factores 1998). Based on this criterion, Synechocystis sp. PCC 6803
abióticos (e.g., pH, agentes quelantes, potencial redox, tempe- proved to be a good accumulator, with high BCF values of
ratura, luz) y bióticos (e.g., actividad celular, concentraciones 20,657 and 24,980 for Pb2+ and Cd2+, respectively. In conclu-
de biomasa de algas, productos extracelulares) (Fathi y Omair sion, Synechocystis sp. PCC 6803 seemed to be more sensitive
2006). to Cd2+ than to Pb2+; however, no marked differences were
El BCF ha sido ampliamente utilizado para comparar found between the two metals in terms of accumulated
especies en cuanto a su capacidad de acumulación de metales amounts. Though the species showed its potential to be used in
(Raskin et al. 1994). Los valores de BCF registrados al cleaning contaminated waters, practical viability must be con-
segundo día del presente estudio concuerdan con Lamaia et al. firmed by studies performed under field conditions.
(2005) quienes publicaron valores considerablemente más
altos de BCF para Pb2+ que para Cd2+ para todas las concentra- Acknowledgements
ciones probadas con C. fracta; sin embargo, al avanzar la
incubación progresó, el Cd2+ pareció generar valores de BCF We gratefully acknowledge the financial support for this
más altos que el Pb2+. La disminución gradual encontrada en study from the Chinese Scholarship Council. We also thank G
los valores de BCF cuando el Pb2+ y Cd2+ aumentan es también Gomez for the language editing and all the colleagues in our
similar a lo reportado por Lamaia et al. (2005). Nuestras laboratory who helped in one way or another.
conclusiones también confirman lo reportado por Rai y
Chandra (1992) quienes afirmaron que la concentración de Gardea-Torresdey JL, Cano-Aguilera A, Webb R, Tiemann K,
metales en el ambiental es el principal factor que influye en la Gutierrez-Corona F. 1996. Copper adsorption by inactivated cells
eficacia en la asimilación de metales y, en consecuencia, en el of Mucor roxii: Effect of esterification of carboxyl groups. J.
incremento en los valores de BCF. Desde el punto vista de la Hazard. Mat. 48: 171–180.

278
 Arunakumara et al.: Bioaccumulation of lead and cadmium by Synechocystis sp. PCC 6803

fitoremediación, un buen bioacumulador debería poseer un Heng LY, Jusoh K, Ling CHM, Idris M. 2004. Toxicity of single and
BCF de más de 1000 (Zayed et al. 1998) y sobre la base de combinations of lead and cadmium to the cyanobacteria
Anabaena flos-aquae. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 72: 373–
este criterio, Synechocystis sp. PCC 6803 mostró ser un buen
379.
bioacumulador de metales, con altos valores de BCF: 20,657 Holan ZR, Volesky B. 1994. Biosorption of lead and nickel by
y 24,980 para Pb2+ y Cd2+, respectivamente. Para concluir, a biomass of marine algae. Biotechnol. Bioeng. 43: 1001–1009.
pesar de que el Cd2+ fue encontrado más tóxico para Kashino Y, Lauber WM, Carroll JA, Wang Q, Whitmarsh J, Satoh K,
Synechocystis sp. PCC 6803 que el Pb2+, sólo se encontraron Pakrasi HB. 2002. Proteomic analysis of a highly active
leves diferencias entre las cantidades acumuladas de los dos photosystem II preparation from the cyanobacterium
Synechocystis sp. PCC 6803 reveals the presence of novel
metales. Aunque la especie resultó tener buen potencial para
polypeptides. Biochemistry 41: 8004–8012
ser usada en la limpieza de aguas contaminadas, la viabilidad Lamaia C, Kruatrachuea M, Pokethitiyooka P, Upathamb ES,
práctica de este procedimiento debe ser confirmada mediante Soonthornsarathoola V. 2005. Toxicity and accumulation of lead
estudios realizados en condiciones de campo. and cadmium in the filamentous green alga Cladophora fracta: A
laboratory study. ScienceAsia 31: 121–127.
Agradecimientos Lasheen MR. 1990. Effect of cadmium, copper and chromium (VI) on
the growth of Nile algae. Water Air Soil Pollut. 50: 19–30.
Mahan CA, Majidi V, Holcombe JA. 1989. Evaluation of the metal
Se agradece el apoyo financiero del Consejo Chino de
uptake of several algae strains in a multicomponent matrix
Becas a este estudio, así como a G Gómez su ayuda en la edi- utilizing inductively coupled plasma emission spectrometry. Anal.
cion del lenguaje y a todos los colegas de nuestro laboratorio Chem. 61: 624–627.
por su ayuda. Mallick N, Rai LC. 1994. Kinetic studies of mineral uptake and
enzyme activities of Anabaena doliolum under metal stress. J.
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