UNIVERSIDAD PRIVADA FRANZ TAMAYO
AREA DE SALUD: CARRERA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
GV.EA.D.15
G
HITO 3
DOCENTE: Silvia Vargas Cadena
ASIGNATURA: Inmunología II
CARRERA: BIOQUIMICA Y FARMACIA
Nombre y Apellidos: Mishiel Nicole Gomez Centellas C.I.: 9939576
Sede: La Paz Fecha: 08-05-2022
Inicial Paterno
PRACTICA 2. PRUEBAS INMUNOSEROLOGÍCAS
PROTEINA C REACTIVA ( PCR) Y TEST DE LATEX
1. INTRODUCCION
La prueba de PCR mide el nivel de proteína C reactiva en la sangre. La PCR es
una proteína producida por el hígado. Se envía al torrente sanguíneo en respuesta
a una inflamación. La inflamación es la manera en que el cuerpo protege los
tejidos cuando ocurre una lesión o una infección. Puede causar dolor,
enrojecimiento e hinchazón en la región lesionada o afectada.
2. RESULTADOS DEL APRENDIZAJE
a. Determinar el fundamento de la técnica de PCR de inmunodiagnóstico.
b. Determinar el material, reactivos y equipos empleados en la técnica.
c. Describir brevemente la técnica de PCR.
d. Realizar la lectura e interpretación de resultados.
e. Identificar los factores de interferencia de los resultados.
f. Realizar la Interpretación o aplicación clínica.
3. FUNDAMENTO Y UTILIDAD
La detección de Proteína C Reactiva (PCR) emplea la técnica de aglutinación
indirecta la cual utiliza partículas inertes de látex poliestireno recubiertas con
anticuerpos anti PCR humano. Es capaz de precipitar un carbohidrato
neumocócico denominado sustancia “C”. Tiene utilidad en la detección de
enfermedades infecciosas o inflamatorias no infecciosas.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
MUESTRA
Suero (no hemolizado, no lipémico, no turbio)
EQUIPOS
Centrifuga
Agitador
MATERIAL
Micropipeta de 50 ul, 200 ul.
Tips
Gradilla
Tubos de ensayo
Placa de vidrio
Laminas negras
Aplicadores de plástico
REACTIVOS
PCR/Látex: suspensión de partículas de látex-poliestireno sensibilizadas
con anticuerpos anti-PCR.
Control positivo: dilución de suero positivo.
Control negativo: dilución de suero negativo.
Diluyente de muestra (tampón salino de glicina, solución fisiológica, PBS)
5. PROCEDIMIENTO
Toma de muestra
Primero realizamos la toma de muestra de sangre siguiendo los respectivos
pasos:
1. Identificar al paciente y explicarle el procedimiento que se va a realizar.
Pedirle que siente o se recueste
2. Lavarse las manos de acuerdo al procedimiento establecido
3. colocarse los guantes desechables
4. preparar la jeringa (la envoltura desechar a los desechos comunes)
5. prepara los tubos (identificando el nombre completo y las pruebas a
realizarse)
6. La inspección debe realizarse con un orden predeterminado Las venas en
general son fácilmente palpables acompañadas de un examen visual.
7. Aplicar el torniquete 4 centímetros por encima de la flexura antero superior
del codo
8. Pedirle al paciente que abra y cierre su puño.
9. Desinfectar el área de la punción alcohol al 790% (técnica de la parte
interna hacia la parte externa)
10. Con el dedo índice de la mano izquierda fijar la vena a puncionar
11. Extracción de muestra de sangre en cuanto la sangre empieza a fluir dentro
de la jeringa se debe retirar el torniquete y solicitar al paciente que suelte el
puño.
12. Traccionar el embolo llenando la jeringa con el volumen requerido
13. Mientras se retira la aguja se aplica el algodón seco haciendo presión sobre
la zona de punción
14. Con la ayuda de una pinza retirar la aguja para desechar al contenedor de
corto punzante.
15. Cargar Al tubo, y determinar el volumen requerido. Si necesitamos suero se
coloca en el tubo rojo y el plasma es en el tubo morado anticoagulante
EDTA
16. En caso que necesite algún anticoagulante realizar la rotación e inversión
unas 10 veces con cuidado de no formar espuma.
17. Observar la, inexistencia de sangrado en el área de punción.
18. Colocar una curita.
19. Apreciar el estado del paciente ante que abandone el área de toma de
muestras
Luego ya una vez teniendo nuestra muestra de sangre en nuestros tubos prosigue
llevarlo a centrifugación entre 5-10 min 3500-2500 r.pm.
Técnica cualitativa
1. Una vez ya lista nuestra muestra de sangre centrifugada, observamos si
hubo aparición del suero, Luego se procede a Llevar los reactivos y
muestras de suero a temperatura ambiente entre 15 a 30 minutos.
2. Mezclar el reactivo PCR/Látex antes de usar para resuspender las
partículas inertes.
3. En diferentes círculos de la placa de reacción colocar:
Muestra de suero 1 gota (50 ul)
1 gota de control negativo
1 gota de control positivo
En le primer círculo marcamos el Control (+) y en el segundo el control (-) y en el
tercer circulo la muestra del suero lo añadimos 1 gota (ul) usando la micropipeta.
4. Añadir una gota de reactivo PCR/Látex en cada muestra y controles.
5. Mezclar con aplicadores de plástico con movimientos circulares de dentro
hacia fuera, y esperar 2 minutos
6. Observar la presencia de aglutinación visualmente o en microscopio con
objetivo de 10 X.
Técnica cuantitativa
En caso de presencia de aglutinación se realiza las DISOLUCIONES
Las muestras que presenten aglutinación deben ser tituladas realizando las
siguientes diluciones 1/2, 1/4, 1/8 ,1/16, 1/32, 1/64.
1. Utilizar una lámina negra colocando 50 ul de solución fisiológica en cada
circulo. Utilizando la micropipeta.
2. Y colocar en el primer círculo 50 ul de muestra. En tal en el primer circulo
tendremos 100 ul en total de esos 100 sacaremos 50 ul y pasaremos al otro
circulo y asi hasta terminar el ultimo circulo y lo ultimo que de de 50 ul lo
desecharemos.
3. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación
visible macroscópicamente. La concentración aproximada de PCR en la
muestra puede ser calculada por la fórmula siguiente:
PCR (mg/l) = Título x Sensibilidad de la reacción (6 mg/l)
Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. Su concentración de PCR es de 2 x
6 = 12 mg/l.
Valor de referencia
Hasta 6 mg/l.
LECTURA E INTERPRETACION
Control Positivo: Aglutinación visible
Control Negativo: Ausencia de aglutinación
Muestra Positiva: Aglutinación visible
Muestra Negativa: Ausencia de aglutinación
Una muestra positiva indica una concentración de PCR mayor al
valor normal en el suero sin diluir.
El título de una muestra positiva se lee en la última dilución que
presente aglutinación para obtener los resultados en unidades se
deben utilizar factores de conversión descritos en la técnica.
INFORME FINAL
Al final en el PCR-LATEX la muestra resulto ser positiva. Y Se realiza la titulación
correspondiente de acuerdo hasta donde llego la aglutinación multiplicando por el
valor de referencia que en este e caso es 6mg/l.
RECOMENDACIONES
Conservar los reactivos de 2 – 8 grados centígrados. No congelar
Efectuar una lectura inmediata después de los 3 minutos. Lecturas posteriores
pueden producir reacciones falsamente positivas por efecto de secado de los
reactivos.
CONTROL DE CALIDAD
* Utilizar siempre los controles negativos y positivos en cada determinación para
comparar el tipo de aglutinación con las muestras.
* Utilizar un suero ya procesado con diferentes títulos para verificar la
reproducibilidad de los resultados.
6.- CUESTIONARIO.
1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de PCR?
R.- La PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalización,
hibridación y extensión.
Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y
separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo
depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta,
será necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el
apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las
bases de A-T. Además, depende de la velocidad en la que el termociclador
aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Al final de
esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado
para el siguiente paso.
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que
se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de
hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila
entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la
adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo
templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida;
agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La
extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’
a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa
temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los
amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb)
que deberá ser conocido por el investigador.
2. ¿Cuáles son los valores de PCR y en qué tipo de procesos se encontrarían
elevadas?
R.- La PCR (proteína C reactiva) se mide en miligramos por litro (mg/l).
Normalmente, los resultados de una prueba estándar de PCR se dan de la
siguiente manera: Normal: menos de 10 mg/l. Alto: igual o más de 10 mg/l.
Un alto riesgo de enfermedad cardiovascular si su nivel de PCR-as es superior
a 3,0 mg/L.
3. ¿Cuál es el método de cálculo de resultados, y cuando se los realiza?
R.- La titulación se realiza con la concentración aproximada de PCR en la
muestra del paciente se obtiene aplicando la siguiente fórmula: 6 x Título de
PCR = mg/L, se los realiza cuando hay aglutinación.
7.- CONCLUSIONES.
El PCR-LATEX se encuentra comúnmente aumentada en: artritis reumatoidea
activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre reumática activa, infarto agudo de
miocardio, etc. En la práctica que realizamos logramos tener experiencia el
momento de utilizar los reactivos hasta usamos solo 25 ul, pero al hacer esto no
altero los resultados.
8.-ANEXOS.
MUESTRA DE SUERO Y PLASMA REACTIVOS
APLICADORES DE PLASTICO LAMINAS NEGRAS
USO DE MICROPIPETA LAMINA NEGRA CON LOS
REACTIVOS
MEZCLACION CON APLICADORES ROTULACION,
IDENTIFICACION
Control (+) Reactivo PCR LATEX Control (-) Reactivo PCR
LATEX
9.- BIBLIOGRAFÍA.
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2. Inlasa. [Internet]. Procedimiento para toma de muestra. [Recuperado el 8 mayo
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3. Mediagraphic. [Internet]. Fundamentos de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. [Recuperado el 8 mayo de 2022].
Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
