Juliette Aguilar Oropeza A01734535
Microbiología como herramienta para el aseguramiento de calidad en el procesamiento de alimentos
Método de número más probable (NMP) para coliformes totales y
Escherichia Coli
Objetivos
El objetivo de esta práctica es comprobar si un alimento mínimamente procesado cumple
con la inocuidad de ser consumido, ya que no debe de presentar microorganismos
potencialmente peligrosos como lo puede ser E.Coli o lo microorganismo que se
encuentran en la familia de coliformes.
Fundamento teórico
Se entiende que la importancia de la inocuidad de un producto para el consumo humano es
un aspecto fundamental dentro y fuera de las industrias, una de las mayores preocupaciones
en la industria de alimentos son las enfermedades trasmitidas por vía fecal-oral ya que en su
gran mayoría son trasportados en los mismos productos solidos y líquidos por igual. De
esta preocupación surgió la necesidad de utilizar indicadores de la contaminación fecal
como método preventivo de causar daño a los consumidores.
Es de esta manera que se creo un grupo llamado coliforme estos es un grupo de
microorganismos que son constantes, abundantes y casi exclusivos de la materia fecal, si
bien tienen características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del
intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza
como indicador de contaminación fecal en agua, aunque también he pueden tratar muestras
solidas trituradas y diluidas en un líquido (Drug Administration & Division of
Microbiology, 1978).
Como anteriormente se menciono este indicador se puede ocupar para tratar dos tipos de
muestras estas no indican lo mismo, mientras en aguas representa una contaminación con
aguas residuales por poner un ejemplo, en la industria alimentaria si se encuentran
resultados positivos en alimentos procesados (pasteurización, horneado, cocción, etc.), este
será indicador de malas prácticas sanitarias (Camacho et al., 2009).
Estos microrganismos (coliformes) constituyen un grupo heterogéneo con hábitat
primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, este mismo grupo
es comprendido por todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos no
esporulados (Tabla 1).
Tabla 1.- Principales género que conforman el grupo coliforme y bacterias representativas de cada
género.
Géneros (coliformes)
Enterobacter Escherichia Citrobacter Klebsiella
Este género causa Este genero se Estos causan Este género se
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principalmente caracteriza por ser infecciones por encuentra
infección del tracto quimiorganotróficas cepas comensales. principalmente en la
urinario y del tracto y provocan Algunos de ellos leche y derivados.
respiratorio principalmente pueden fermentar De igual manera este
(Medina, 2010). diarreas (Martínez, citrato (Mundy et afecta a el tracto
2006). al., 2006). digestivo y vías aéreas
superiore
(Jiménez,1977).
Enterobacter cloacae Agar Cromogénico Colonias de Colonias de
con E. coli. Citrobacter freundii. Klebsiella
pneumoniae.
El segundo indicador más relevante al analizar alimentos es la bacteria Escherichia Coli, si
bien esta puede encontrarse en el grupo de coliformes, es relevante la identificación de E.
Coli ya que esta misma se sub divide en diferentes cepas que son patógenas las principales
cepas identificadas son E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC),
E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvas
iva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC).
Cada una de las cepas anteriormente mencionadas son patógenas y representa un peligro
principalmente en menores de edad, ya que se sabe que la incurrencia es lata a nivel
mundial, el país con mayor incidencia es Argentina ya que alrededor de 13,9 casos de
infecciones por cada 100.000 niños menores de 5 años, son provocadas por Escherichia coli
serotipo O157:H7. Este serotipo en espacial es altamente agresivo ya que una infección de
esta puede conducir a ocasionar el síndrome urémico hemolítico (SHU) y esta causa una
supresión del sistema inmunológico conduciendo al paciente a un estado crítico (Rubeglio
& Tesone, 2017).
Método (NMP)
Este método consiste en un calculo a partir de la observación del crecimiento respecto a la
aparición de turbidez, en cultivos en caldo duplicados, inoculados con porciones de un ml
de diluciones decimales de la muestra. Las cifras que representan resultados positivos con
crecimiento en tres diluciones sucesivas, suelen denominarse número significativo.
La recaían que se desea cuantificar por medio de este método es la capacidad de las
bacterias coliformes de fermentar lactosa estas pueden representarse con la producción de
acido (turbidez) y la producción de gases, esto ocurre cuando son cultivados a 35° C ± 1 °C
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durante 48 h, en volúmenes decrecientes con respecto a la muestra a procesar. Estas
diluciones deben de ser en decimales consecutivos (1:10, 1:100, 1:100) (ISO 9308-2:1990).
Materiales
1. 18 tubos de 22 x 175 mm de 10.0 ml
2. 18 campana de Durham
3. Mechero Fisher
4. Licuadora
5. Balanza granataria digital
6. 6 pipetas gradadas de 1 o 2 ml
7. Pipeta graduada de 10 ml
8. Perilla
9. Rejilla
10. Incubadora
11. Agitador vortex
12. Un vaso de precipitado de 10 y 250 ml
Reactivos
1. Agua peptonada
2. Caldo bilis verde brillante
3. Caldo E. Coli
Preparación de materiales
Cada uno de los materiales de vidrio debe de ser esterilizado por medio de un proceso en el
auto clave (figura 1), por otro lado, los demás materiales deberán de ser sanitizados
perfectamente antes de uso para mantener la fidelidad de la prueba o estudio.
Figura 1.- Uso de auto clave.
Muestra
Esta muestra es de un
alimento
mínimamente
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procesado, el cual era un brócoli, el cual no fue tratado con ningún desinfectante previo, se
conservo en un refrigerado a una temperatura constante de 3 a 5 °C con el objetivo de
mantener lo fresco.
Procedimiento
Este método de igual manera se divide en 4 etapas principales, todas laS etapas se deben de
realizar en un ambiente estéril (este ambiente se consiguió gracias al mechero Fisher):
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Resultados y Observaciones
De acuerdo a las tablas presentadas en la NOM-210-SSA1-2014 (tabla 2) se puede concluir
que para la prueba de coliformes totales se tiene como un resultado de 1100 NMP/g y en la
prueba para E. Coli se presenta un resultado de superior a 1100 NMP/g confirmando de esta
manera una contaminación por coliformes totales y confirmando la presencia de una de las
cepas de E. Coli. Como observación se logró percibir la formación de biomasa en todos los
tubos de concentración de 1:10 tanto de verde brillante bilis y en caldo E. Coli.
Tabla 2.- NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando tres tubos con 0.1g, 0.01g y
0.001g de muestra (NOM-210-SSA1-2014).
Resultados obtenidos
Coliformes totales = ► Verde
E. Coli = ► Amarillo
Conclusión
Este alimento no cumple con los niveles establecidos en la NOM-210-SSA1-2014 para
vegetales, este alimento es considerado un peligro para el consumidor se debe de realizar su
destrucción inmediata ya que exhibe niveles muy altos de microorganismos peligrosos.
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Inoculación de muestras diluidas en medios de cultivos por
extensión de superficie (agar papa dextrosa) y aislamiento directo
(agar soya tripticaseina)
Objetivos
Esta practica tiene como objetivo logar aislar colonias para realizar un conteo e
identificación de la misma, para asegurar la sanidad del alimento estudiado y comprobar si
cada uno de los aspectos que promete el mismo son ciertos.
Fundamento teórico
Se sabe que se puede hacer crecer microorganismos con diferentes objetivos algunos de
estos métodos se especializan en hacer pruebas rápidas y otros más se enfocan en la
especificación de los resultados. El que un resultado tenga una alta especificidad ayuda a
resolver de mejor manera un problema puntual, es por esta razón cuando un resultado de
NMP es positivo naturalmente este se acompaña de una inoculación en un medio de cultivo
selectivo para poder identificar adecuadamente al microorganismo que está provocando la
contaminación (ISO 9308-2:1990).
De esta necesidad por comprender e identificar, cada uno de los microorganismos se
desglosa la rama de la biología la cual es llamada microbiología esta ciencia estudia los
organismos que cuentan con un tamaño inferior a 0.1 mm, en esta amplia gana de seres
vivos se distribuyen en distintos grupos taxonómicos; estos pueden incluir también algunos
animales como pueden ser los protozoos, estos suelen estudiarse con ayuda de instrumentos
ópticos, pero si bien es importante observarlos de manera unicelular. Cobra relevancia
observar estos organismos de manera pluricelular, ya que si se coloca en un medio de
cultivo adecuado estos pueden generar características únicas en ese medio en específico
(Stanier & Villanueva, 1996).
Es en este punto donde se comprende la importancia de los medios de cultivo selectivos ya
que cada uno de los microorganismos requiere una variedad de nutrientes orgánicos e
inorgánicos este requerimiento se comprende de mejor manera si se analiza o se compara,
con un tejido extirpados de plantas. Estos parámetros nutritivos deben de encontrarse en
niveles específicos para las necesidades de virus, bacterias, levaduras o hongos (Krikorian,
1991).
Los medios de cultivos se entienden que tienen parámetros específicos para cada uno de los
microorganismos, pero existen elementos que todos los medios deben de poseer para hacer
crecer cualquier tipo de vida en ellos, esto son carbono, nitrógeno, azufre, fosforo y sales
inorgánicas. Otro de los parámetros importantes es la textura con la que debe de contar, si
bien se sabe que pueden desarrollarse en un medio liquido para poder estudiar colonias es
preferible que tenga una consistencia mas rígida para esto se le agregan algunas sustancias
como lo pueden ser albúmina, grenetina o agar (Vallejo, 2014).
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Método extensión de superficie por muestras diluidas (agar papa
dextrosa)
Este método de extensión es sumamente simple, el objetivo principal de este tipo de
sembrado es conseguir sembrar cantidades conocidas en una serie paralela de placas Petri,
estas diluciones será tal que, al distribuir una parte de ella en la placa, originará colonias
separadas. De esta manera se conocerá el numero de colonias, la cantidad sembrada y la
dilución correspondiente, esto permite evaluar el número de gérmenes viables en la muestra
original (Sanz, 2011).
El agar papa dextrosa se caracteriza por ser un medio selectivo para hongos, mohos y
levaduras, como su nombre lo indica esta formada por una base rica en infusión de papa. La
dextrosa es uno de los carbohidratos fermentables como fuente de carbono y energía, en
cuanto el agente solidificante es el agar bacteriológico. Este tipo ayuda a la identificación
de hongos y levaduras en paralelo con su morfología celular, o en métodos de microcultivo
en porta objetos (Microgen LABG&M, 2021).
Materiales
1. 6 cajas Petri
2. Asa de vidrio
3. Mechero Fisher
4. Pipeta graduada de 1 ml
5. Perilla
6. 3 tubos de 22 x 175 mm de 10.0 ml
7. Incubadora
Reactivitos
1. Agar papa dextrosa en una concentración del 40%
Muestra
Esta muestra es de un alimento mínimamente procesado, el cual era un brócoli, el cual no
fue tratado con ningún desinfectante previo, se conservó en un refrigerado a una
temperatura constante de 3 a 5 °C con el objetivo de mantener lo fresco.
Preparación de materiales
Cada uno de los materiales de vidrio debe de ser esterilizado por medio de un proceso en el
auto clave (figura 1), por otro lado, los demás materiales deberán de ser sanitizados
perfectamente antes de uso para mantener la fidelidad de la prueba o estudio.
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Procedimiento
Resultados y
Observaciones
No se pudieron obtener resultados ya que no se logró aislar correctamente ninguna colonia
de las que re realizo el sembrado. Se logro observar que en el agar control no se encontró
ningún crecimiento de esta manera se aseguro que las muestras procesadas no exhibieron
ninguna contaminación externa.
Como segunda observación en todas concentraciones de los agares se presentó una sobre
carga microbiana, haciendo imposible una lectura correcta de el numero de colonias, en el
caso que se hubieran podido asilar correctamente estas se debieron de contar, para
posteriormente aplicar la siguiente formula:
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UFC=N umero de colonias × ( ml delinoculo
1
)× ( Dilución
1
)= UFC
ml
En este tipo de alimento el cual es clasificado como un vegetal crudo se tiene como límite
100 UFC/g de listeria monocytogenes (y se debe de terne una ausencia de cualquier otro
microrganismo (BOE-A-1983-33964).
Conclusión
No se podrá afirmar que existe una contaminación que inflija las leyes, aunque es altamente
probable ya que exhibe un presunto crecimiento de hongos en todas las concentraciones
cultivadas. Se recomienda hacer nuevas diluciones con valores menores de muestra para
poder lograr un aislamiento exitoso.
Método de aislamiento directo por estriado (agar soya tripticaseina)
Este al igual que el anterior es un método simple y principalmente rápido de agotamiento
progresivo y continuo del inoculo en un medio sólido. El objetivo es obtener a partir de un
elevado número d bacterias un número reducido de ellas distribuidas individualmente a lo
largo de la caja Petri, esto con el objetivo de emular distintas concentraciones en paralelo
de la misma muestra. Al realizar esta incubación se deberán de formar colonias aisladas en
la misma placa generando un cultivo puro en el ultimo cuadrante que se estrié (Sanz, 2011).
Las características principales del agar soya tripticaseina, es que fomenta el crecimiento de
una amplia variedad de microorganismos de importancia microbiológica tanto anaerobios,
aerobios, facultativos y estrictos, gran positivos o negativos, hongos y levaduras. Este
medio tiene múltiples usos como puede ser análisis de aguas y alimentos y monitoreo
microbiológico de áreas y superficies (Microgen LABG&M, 2021).
Materiales
1. 3 cajas Petri
2. Asa metálica
3. Mechero Fisher
4. Pipeta graduada de 1 ml
5. Perilla
6. Incubadora
Reactivitos
1. Agar agar soya tripticaseina en una concentración del 40%
Muestra
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Esta es una muestra de un alimento procesado, el cual se refrigero aproximadamente a 10 a
27° C previamente, este producto venia sellado así que no se requirió acondicionamiento
previo de la muestra.
Preparación de materiales
Cada uno de los materiales de vidrio debe de ser esterilizado por medio de un proceso en el
auto clave (figura 1), por otro lado, los demás materiales deberán de ser sanitizados
perfectamente antes de uso para mantener la fidelidad de la prueba o estudio.
Procedimiento
Resultados y Observaciones
Se logro aislar adecuadamente por esta razón se realizó una tinción de Gram (figura 2) para
poder realizar una identificación de que tipo de microrganismos, después de una
observación en el lente de 1 x 100 se logró identificar bacilos Gram negativas y cocos
positivos (figura 3).
Figura 2.- Técnica de la tinción de grama (López et al. 2014).
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Lente 10 x 4 Lente 10 x 10 Lente 10 x 40 Lente 10 x 100
Figura 3.- Observaciones al microscopio
Conclusión
Este alimento cumple con la presencia de probióticos como lo indica en su etiqueta, por ello
no realiza publicitad engañosa y lo veneficios que promete en la publicidad y en la misma
etiqueta se puede presumir como ciertas.
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