Microbiología, Métodos y Producción 5º Año TIP EETP nº 399

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01_El microscopio
Los microorganismos son demasiado pequeños para ser observados a simple vista, por lo cual debe utilizarse un
microscopio.
Los microbiólogos suelen usar una variedad de microscopios que usan la luz en su trabajo: los microscopios
ópticos (de campo luminoso), de campo oscuro, de contraste de fase y de fluorescencia son los más comúnmente
utilizados. Los microscopios modernos son todos microscopios compuestos. Eso significa que la imagen
formada por el lente del objetivo es posteriormente aumentada por uno o más lentes adicionales.

El microscopio óptico
El microscopio óptico es también llamado microscopio de campo luminoso porque este forma una imagen
oscura contra un fondo más brillante. El microscopio consiste de un cuerpo metálico sólido compuesto de una base y
un brazo sobre los cuales se ubican las demás piezas (Figura 3.1). Una fuente de luz se ubica en la base. Dos
perillas de enfoque, una de enfoque macrométrico y otra de enfoque micrométrico, se ubican a ambos lados del
brazo para mover la platina hacia arriba y hacia abajo para lograr el mejor enfoque. La platina se ubica a medio
camino del brazo y sostiene los portaobjetos. El portaobjetos puede ubicarse en la mejor posición mediante el uso del
carro que se ubica en la platina. El condensador se ubica debajo de la platina y su función es enfocar un cono
de luz hacia el portaobjetos. La cantidad de luz que ingresa al condensador desde la fuente de luz es regulada
por una pieza llamada diafragma.

La parte superior del brazo sostiene el cuerpo del microscopio. Los microscopios más avanzados tienen
piezas para los dos ojos y son llamados microscopios binoculares. El ensamblaje del cuerpo contiene una serie
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de espejos y prismas para magnificar la imagen generada por los objetivos. Los objetivos se ubican sobre el
revólver. Estos tienen diferentes aumentos, los cuales típicamente son de 4x, 10x, 40x y 100x, y pueden
seleccionarse rotando el revólver. Los espejos del cuerpo hacen un aumento adicional de 10x.
Idealmente un microscopio debería ser parafocal, o sea, que al cambiar de objetivos debería mantenerse el
enfoque.

Aumento total de la imagen

Para calcular la magnificación total generada por el cuerpo del microscopio debe multiplicarse el aumento del
objetivo por el aumento de los espejos, o sea, si se utiliza el objetivo 40x con un cuerpo que hace una magnificación
de 10x, el aumento total es de 400x.
La mayoría de los microscopios utilizados en microbiología poseen varias lentes objetivos, que proporciona 10X
(bajo aumento), 40X(gran aumento), 100X(de inmersión en aceite). La mayoría de los oculares amplían la imagen 10
veces.

Resolución del microscopio

La resolución (también llamada poder de resolución), es la capacidad de las lentes de distinguir detalles finos o,
más específicamente, la capacidad de distinguir una distancia separada determinada entre dos puntos. Por ejemplo,
si un microscopio tiene un poder de resolución de 0,4 nm es capaz de distinguir dos puntos como objetos separados
si están al menos a 0,4 nm de distancia.
Es por esto que la resolución es extremadamente importante. La resolución es la habilidad de un lente de
separar o distinguir dos objetos pequeños que están separados entre sí por una mínima distancia.
El poder de resolución de un microscopio depende de:
● la longitud de onda de la luz: Cuando más corta sea la longitud de onda de la luz utilizada en el instrumento
mayor será la resolución. La luz blanca utilizada en el microscopio óptico compuesto posee una longitud de
onda relativamente grande y no puede resolver estructura de 0,2 μm.
● La apertura numérica de las lentes que nos indica la cantidad de luz que entra en un objetivo desde el un
punto del campo del microscopio.
A menor longitud de onda y apertura numérica de las lentes, será mejor el poder de resolución del microscopio.
Cuando usamos aumentos de 1000X, es necesario controlar el efecto de dispersión de la luz,. Entonces, para
conservar la dirección de los rayos de luz en el máximo aumento se utiliza aceite de inmersión entre el portaobjetos y
la lente del objetivo de inmersión. El aceite de inmersión tiene el mismo índice de refracción que el vidrio, de modo
que el aceite se convierte en parte de la óptica del microscopio. Si no se utiliza aceite de inmersión con un objetivo de
100X, la imagen se torna borrosa, con mala resolución.
Para obtener una imagen clara con detalles precisos en el microscopio óptico las muestras deben teñirse para que
contrastan nítidamente con el medio que las rodea, es decir con la sustancia en la cual están suspendidas. Si bien, no
siempre es deseable teñir una muestra, hay que tener en cuenta que la célula no teñida tiene poco contraste con su
entorno y por consiguiente, es difícil de visualizar.

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Taller
1. Realiza un mapa conceptual sobre las principales ideas desarrolladas en la clase.
2. ¿Por qué o para qué utilizamos un microscopio en microbiología?
3. ¿Qué diferencia hay entre aumento y resolución? ¿Puede aumentar uno sin que aumente la otra?
Fundamenta tu respuesta.
4. ¿Cómo se llaman los cristalitos que contiene la
muestra que queremos observar en el
microscopio?
5. Anotar las partes del microscopio óptico:
a. …………………………..
b. ………………………….
c. …………………………
d. …………………………
e. …………………………..

6. Calcular el aumento total del núcleo celular

observado con ocular de 10X y un objetivo de
inmersión en aceite.
7. ¿En un microscopio óptico se puede observar un
virus? Fundamenta tu respuesta.

Actividad de Laboratorio:
Rutina de enfoque:
1. Verifique que la perilla de intensidad de la luz del microscopio esté en la intensidad mínima, que el objetivo
que apunte a la muestra sea el de 4X y que la platina se encuentre abajo.
2. Conecte el microscopio y enciéndalo del interruptor ubicado en la base.
3. Ajuste la luz del microscopio usando la perilla ubicada en la base. Para iniciar utilice entre 1/4 y 3/4 de la
intensidad luminosa máxima del microscopio.
4. Ubique la muestra a observar en el portaobjetos, y ésta en el carro ubicado en la platina del
microscopio.
5. Ubique la muestra debajo del objetivo de 4X usando los tornillos que mueven el carro. Enfoque la muestra
utilizando los tornillos macrométricos ubicados a ambos lados del brazo.
6. Una vez enfocada la muestra con el objetivo 4X, y sin mover la platina, gire el revólver para que quede
ajustado en el objetivo 10X. Enfoque usando los tornillos macrométricos.
7. Una vez enfocada la muestra con el objetivo 10X, y sin mover la platina, gire el revólver para que ajustado
en el objetivo 40X. Enfoque usando los tornillos micrométricos.
8. Una vez enfocada la muestra con el objetivo 40X, y sin mover la platina, gire un poco el revólver y ponga una
gota de aceite de inmersión sobre la muestra. Complete el giro del revólver para que quede ajustado en
el objetivo 100X. Enfoque usando los tornillos micrométricos.
Se recomienda disminuir la intensidad de la luz usando bien sea la perilla de la base del microscopio o el
diafragma del condensador.
9. Al terminar de observar todas las muestras baje la intensidad de la luz hasta el mínimo. Baje la
platina, retire la muestra y ponga el revólver con el objetivo de 4X apuntando hacia la platina. No olvide
limpiar el aceite de inmersión del objetivo 100X con papel de arroz. Apague el microscopio del interruptor
ubicado en la base y desconecte el equipo.

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➤ Actividad 1: Utilización del microscopio óptico

1. Se tendrán que observar diferentes muestras y dibujar lo observado:

1. Papel periódico Cada objeto tendrá que ser dibujado en los objetivos de 10X y
2. Láminas de corcho 40X. Sólo el frotis seco bacteriano observado con el objetivo 100X.
3. Sulfato de cobre Del frotis seco bacteriano se entregarán los dibujos en 40X y 100X
4. Hilos
5. Cabello
6. Frotis seco bacteriano
Preguntas para responder:
2. ¿En qué posición se ven las letras de periódico cuando se observan al microscopio? ¿Cómo explica este
resultado?

➤ Actividad 2: Cálculo del campo de visión

Para calcular el diámetro del campo de visión para un determinado aumento hay que seguir los
siguientes pasos:
1. Recortar un cuadrado de 1 cm de lado de papel milimetrado.
2. Ponerlo entre un portaobjeto y un cubreobjeto y ubicarlo sobre la abertura central
3. Observando por el ocular y con el objetivo de 4X, mover la muestra hasta lograr que la línea 0 mm
quede en el borde izquierdo del campo visual
4. Medir el campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo
de visión: Contar el número de milímetros que se ven (recuerde que la distancia entre dos líneas es
un milímetro) y estimar aproximadamente la fracción sobrante, si la hay. El resultado será el diámetro del
campo visual para ese aumento (objetivo x ocular).
Nota: Si queremos calcular el diámetro del campo de visión para aumentos mayores, hay que
tener en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, el campo será menor, es decir, se verá menos de la
muestra que estemos observando. De forma que, si el aumento es el doble, el campo será la
mitad, si el aumento es el triple, el diámetro será la tercera parte, etc. (inversamente proporcionales).
Por tanto, bastará con realizar un sencillo cálculo matemático para saber el nuevo diámetro. Así se
puede calcular los diámetros de objetos microscópicos, células, amebas,entre otros.

Preguntas para responder:

1. ¿Al mover el portaobjetos de derecha a izquierda a qué lado se mueve la imagen?
2. Calcule el diámetro del campo de visión para aumentos de 10X, 40X del mismo cuadrado de 1 cm de
lado de papel milimetrado.
3. ¿Con qué objetivo se logra un campo de visión más grande?
4. ¿Con cuál objetivo el campo de visión es mayor con el de mayor o menor aumento?10. ¿Cuál es la
utilidad del microscopio?

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