INOCUIDAD

VIRUS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS:

PRIMER REPORTE EN OSTRAS
(CRASSOSTREA GIGAS) DE LA PROVINCIA
DE BUENOS AIRES
Mozgovoj, Marina1; Barbieri, Elena2;
Gonzalez, Cintia3; Victoria Montero, Matías4;
López Tort, Fernando4; Cap, Mariana3;
Barón, Pedro2; Parreño, Viviana5
1Instituto de Tecnología de Alimentos - Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) -
CONICET. Argentina.
2Laboratorio de Oceanografía Biológica Lobio

Cesimar - CCT CONICET-CENPAT. Argentina.

3Instituto de Tecnología de Alimentos - Centro de

Investigación de Agroindustria - INTA. Argentina.

4Laboratorio de Biología Molecular - Departamento

de Ciencias Biológicas - CENUR Litoral Norte.

5Instituto de Virología e IncuINTA - Instituto Nacional

de Tecnología Agropecuaria (INTA) - CONICET

[Link]@[Link]

RESUMEN
Los norovirus (NoV), junto con los rotavirus (RV)
muestras se realizó según norma ISO/TS 15216-
humanos, son los principales agentes virales causantes
2:2013, con algunas modificaciones. La muestra se
de brotes de gastroenteritis en todo el mundo. Los
definió como un pool de ostras de 2g. La detección de
moluscos bivalvos, debido a su capacidad de concen-
los genomas virales se realizó mediante la técnica de
trar partículas virales en su sistema digestivo por filtra-
RT-PCR en tiempo real. Se evidenció la presencia de
ción de grandes volúmenes de agua, pueden estar con-
genoma de NoV perteneciente al genogrupo II (GII) y
taminados con estos patógenos. En la costa de nuestro
RVA, en dos pooles. La caracterización de la cepa de
país pueden distinguirse mejillones (Mitylus edulis),
NoV se realizó mediante RT-nested PCR, la cual permi-
vieiras (Aequipecten tehuelchus) y ostras (Crassostrea
tió amplificar un fragmento comprendido entre ORF1 y
gigas), como los más relevantes para la actividad pes-
ORF2 de 390pb. Estudios filogenéticos demostraron
quera regional y, potencialmente, para la comercializa-
que el genotipo encontrado correspondía a la variante
ción internacional. Como consecuencia de brotes cau-
de NoV GII.4, Sidney 2012. Con respecto al RVA, se rea-
sados por el consumo de alimentos contaminados con
lizaron cuatro pasajes ciegos en células MA104.
virus, el mercado internacional ha incrementado las exi-
Mediante RT-PCR en tiempo real, se mostró una dismi-
gencias sanitarias sobre la calidad de los productos que
nución en el valor del CT (ciclo umbral) correspondiente
se exportan. En este contexto, el objetivo de este trabajo
al cuarto pasaje de RVA (CT=25), respecto del valor del
fue determinar la presencia de virus en ostras
CT correspondiente al genoma del virus encontrado ini-
(Crassostrea gigas) del sur de la provincia de Buenos
cialmente en el pool de ostras (CT=36). La presencia de
Aires. Para ello, se obtuvieron ostras (n=88) a partir de
partículas virales infecciosas se evidenció mediante
un relevamiento realizado en el año 2015 de la zona sur
inmunofluorescencia directa, usando un nanoanticuer-
de la costa bonaerense. Se recolectaron ejemplares de
po VHH específico contra la proteína VP6 de RVA mar-
las zonas noreste y sureste de Isla Gama, ubicada frente
cado con ALEXA-fluor 488. Este ensayo demostró la
a la localidad de Bahía San Blas, por fuera de las zonas
viabilidad del RVA encontrado.
de restricción de SENASA. El procesamiento de las

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 INOCUIDAD
En nuestro conocimiento, este trabajo constituye el pri- bancos de ostras se han desarrollado luego de la intro-
mer reporte de detección de NoV y RVA en Crassostrea ducción de especímenes para su producción en el año
gigas de nuestro país, y representa la primera detección 1982. Desde entonces, la especie ha expandido su dis-
de virus en alimentos en la Argentina. Ante un fortaleci- tribución desde el estuario de Bahía Blanca hasta la pro-
miento en los últimos años de la actividad pesquera de vincia de Río Negro. Las autoridades locales están pro-
moluscos bivalvos en nuestro país, los estudios realiza- moviendo activamente el desarrollo de esta industria, la
dos representan información epidemiológica de rele- cual ha crecido enormemente durante los últimos
vancia para la implementación de estrategias de control años8. Toda la zona se caracteriza por su cercanía a ciu-
sanitario que permitan la certificación de inocuidad dades importantes y balnearios con afluencia turística,
para la exportación segura de estos frutos de mar de siendo susceptibles de concentrar contaminantes de
alto valor económico. efluentes cloacales. Estudios previos demuestran que la
ostra Crassostrea gigas es capaz de bioacumular una
INTRODUCCIÓN variedad de virus, incluyendo patógenos del grupo
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) Calicivirus9. Los virus entéricos pueden persistir en los
representan uno de los principales problemas en salud sedimentos marinos y mariscos durante varias sema-
pública a nivel mundial. Éstas pueden ser causadas por nas o meses, no pudiéndose lograr la inactivación viral
bacterias, virus y contaminantes químicos. Con respec- completa luego de los procesos normales de depura-
to a los virus, sólo se requiere una mínima cantidad de ción10-11. En nuestro país la importancia real de los
partículas virales para generar enfermedad. Son muy virus en los casos de ETAs está subestimada. En este
estables y resistentes en el medio ambiente1. Entre contexto, en este trabajo se propone estudiar la presen-
ellos, norovirus genogrupo I y II (NoV GI y GII) y rota- cia de NoV y RVA en ostras (Crassostrea gigas) del sur
virus (RVA) causan gastroenteritis agudas, generando de la provincia de Buenos Aires.
una elevada morbi-mortalidad en los países en desarro-
llo. En la Argentina, alrededor de 1.200.000 de casos de
diarrea aguda se reportan anualmente y la mitad de
estos ocurre en niños menores de cinco años. NoV
afecta a humanos de todas las edades. La infección
suele ser autolimitada, sin embargo, en algunos casos
puede ser más severa e incluso comprometer la vida
del paciente2. Para el caso particular de NoV, se ha
demostrado que tiene la capacidad de unirse a recepto-
res específicos del tejido de los bivalvos, lo que expli-
caría por qué estos virus resisten los procesos depura-
tivos, representando un riesgo para el consumo de
ostras crudas o cocidas ligeramente3. RVA es la princi-
pal causa de diarrea en niños menores de dos años,
causando la muerte en los casos más graves4. Se han
descripto brotes asociados al consumo de alimentos
contaminados con RVA, si bien, son poco frecuentes.
Durante estos últimos años se han estudiado las carac-
terísticas zoonóticas de algunas cepas de RVA5. Los
moluscos bivalvos (ostras, mejillones, almejas) son ali-
mentos especialmente peligrosos porque concentran
activamente los virus al filtrar grandes volúmenes de
agua y porque, con frecuencia, se consumen crudos o
escasamente cocidos6. La gastroenteritis asociada al
consumo de moluscos bivalvos ha sido ampliamente
documentada7. En la Argentina, los moluscos costeros
incluyen a varias especies en las costas de la Patagonia
que están sujetas a explotación comercial y actividades
acuiculturales o utilizadas para consumo familiar. Los

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 MATERIALES Y MÉTODOS Detección de rotavirus
INOCUIDAD

Muestras de ostras (Crassostrea gigas) -PCR en tiempo real. Se amplificó un fragmento alta-
En colaboración con la Dra. Elena Barbieri y el Dr. mente conservado correspondiente a la secuencia de la
Gaspar Soria. se obtuvieron muestras de ostras de las proteína no estructural de NSP3, según Zeng AQ y col
zonas noreste y sureste de Isla Gama. (2008)17. Se utilizaron los primers, sonda y condiciones
de ciclado descriptos en dicho trabajo.
Preparación de los homogenatos -Nested PCR. Se realizaron diferentes PCR a fin de
Se realizó acorde la norma ISO/TS 15216-2:201312. En con- amplificar las secuencias codificantes correspondientes
diciones de esterilidad se abrió el molusco bivalvo, se sepa- a los genes de VP4, VP7, VP6 y NSP4. Para el caso de
ró el hepatopáncreas mediante un bisturí estéril y se colocó VP4 y VP7, se realizó según lo descripto Victoria M y
en una placa de Petri. Se realizaron grupos de glándulas col, (2014)18. Se utilizaron los primers 9con1 y 9con2
digestivas de varios individuos hasta obtener 2,0±0,2g. Cada para el primer round de VP7 y 4con3 y 4con4 para el
grupo se disgregó mecánicamente hasta lograr una consis- primer round de VP4. Para el segundo round, se utiliza-
tencia pastosa. Se adicionaron 2ml de proteinasa K (SIGMA) ron los juegos de primers VP7F/VP7reg y VP4F/VP4R
(0,1 mg/ml). La mezcla se incubó a 37°C por 1h en agitación para VP7 y VP4, respectivamente. A su vez, se utilizaron
(320 rpm), seguida de una incubación a 65°C durante 15m los primers descriptos por Garaicoechea L y col
(inactivación de la enzima). Se realizó la clarificación (2006)19. Para VP6 y NSP4, los primers utilizados y las
mediante centrifugación a 3000 g, durante 5m para obtener PCR empleadas, se basaron en lo descripto por Afrad
la fracción soluble. La muestra se conservó a -80°C. MH y col. (2013)20.
Controles de extracción: Como control de proceso se utilizó -Aislamiento viral y detección por inmunofluorescen-
el bacteriófago PP7, el cual se adicionó al homogenato de cia directa (IF). El aislamiento de los RVA se realizó
ostras (10 ul), previo a la adición de proteinasa K. según lo descripto por Castells y col (2018)13. Se sem-
braron por duplicado los homogenatos (que hayan
Extracción de ARN y síntesis de ADNc resultado positivos por real time) diluidos ½ en MEM-D
La extracción de ARN a partir de las muestras de bival- con 1% pancreatina en placas de MA104 de 96 pocillos
vos se realizó según el protocolo descripto por norma (Nunc), se incubaron a 37°C, 5% CO2 durante 1 hora, se
ISO/TS 15216-2:201312. El ARN extraído se conservó a retiró el inóculo y se agregaron 100 ul de MEM-D suple-
-80°C. La síntesis de ADNc se realizó empleando ran- mentado con 1% de pancreatina. Las placas se incuba-
dom hexámeros (Promega) y MMLV (promega) según ron durante 96 horas a 37°C, 5% CO2. Se realizaron
lo descripto por Castells M y col, (2018)13. El ADNc se cuatro pasajes ciegos. Luego, se cosechó el virus y se
conservó a -20 hasta su uso. tituló en placas de 96 pocillos en células MA104. A 18hs
posteriores a la incubación a 37ºC, en atmósfera de 5%
Cálculo de eficiencia de la extracción. de CO2, se descartó el sobrenadante y las monocapas
Cuantificación del fago PP7 infectadas se fijaron con acetona al 70% durante 15
Se cuantificó el fago pp7 (SPC) a partir de una curva minutos, a temperatura ambiente. La infección se reveló
estándar construida previamente en nuestro laborato- con un anticuerpo monoclonal contra RVA, marcado
rio, según Rajal y col, (2007)14. La eficiencia de extrac- con ALEXA. El número de unidades formadoras de
ción en todos los casos fue >1%. focos fluorescentes (UFF) se determinó por lectura en
un microscopio de fluorescencia (Olympus). El título
Detección de NoV GII infeccioso se obtuvo a partir de la siguiente fórmula:
-PCR en tiempo real. Se realizó según Victoria y col (2016) UFF/ml= (número de focos x inversa dilución) / volumen
y Pang X y col (2005)15,16. Se utilizó un control sin templado del inóculo.
y un control positivo para NoV GI y GII (muestras de mate-
ria fecal cedidas por el Dr. Juan Stupka, ANLIS-Malbrán). Secuenciación y análisis filogenético
-Heminested PCR. Se realizó según Victoria y col. Los amplicones obtenidos mediante la técnica de RT-
(2016)15. Los primers forward y reverse están dirigidos Nested PCR aplicada se purificaron empleando el Kit
al sitio de unión ORF1-ORF2 y a una región de 50 pb del QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) según las especifi-
gen VP1 (región C), respectivamente. Para NoV GII, se caciones del fabricante. Luego se secuenciaron automá-
emplearon: COG2F/G2SKR (390 bp) y G2SKF/G2SKR ticamente en ambas direcciones (MACROGEN). Para el
(340 bp) correspondientes al primero y segundo round, caso de RVA, las secuencias nucleotídicas fueron edita-
respectivamente. das y ensambladas utilizando el programa

46 La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214

 INOCUIDAD
SeqMan®(DNASTAR®, Madison, USA) y el programa Para el caso de NoV, se utilizó la herramienta Norovirus
Bioedit ([Link] Genotyping Tool Version 2.022. La reconstrucción filo-
Las matrices de datos se construyeron realizando una bús- genética fue realizada utilizando el método de Neighbor-
queda de similitud en la base de datos Genbank joining (NJ), utilizando el modelo evolutivo de Kimura
([Link] utilizando la 2-Parameter (K2P) implementado en MEGA6 (Kumar et
herramienta BLAST al., 2016). El soporte estadístico se realizó mediante el
([Link] El alineamiento método de remuestreo (bootstrap) con 1000 réplicas.
múltiple de secuencias se realizó utilizando el programa Fue utilizada por lo menos una secuencia de referencia
Muscle implementado en Aliview21 (REF) y ClustalX por cada genotipo del Genogrupo II obtenidas a través
([Link] implementado en Bioedit. de sus números de acceso disponibles en GenBank•.
El análisis filogenético se realizó por el método
de Neighbor-joining (NJ), utilizando el modelo evolutivo RESULTADOS
de Kimura 2-Parameter (K2P) implementado en MEGA6 Detección y análisis filogenético de NoV
(Kumar et al., 2016). El soporte estadístico se realizó en ostras de Buenos Aires
mediante el método de remuestreo (bootstrap) con El análisis filogenético de NoV muestra que la secuen-
1000 réplicas. cia argentina de NoV clasificó como perteneciente al
Las cepas argentinas que han sido secuencia- genotipo 4 del Genogrupo II con un bootstrap del 79%
das hasta el momento fueron incluidas en el análisis, y (Figura 1).
las cepas de referencia de los diferentes genotipos des-
critos para VP7, VP4, VP6 y NSP4 (G, P, I y E, respec- Detección y análisis filogenético de RVA
tivamente) fueron obtenidas a través de sus números en ostras de Buenos Aires
de acceso disponibles en el artículo científico publicado La caracterización molecular de las cepas a partir del
por Matthijnssens y col. (2011) y de la lista de genoti- análisis filogenético de las secuencias parciales de ADN
pos aceptados disponible en la web del RCWG de los genes VP7, VP4, VP6 y NSP4 obtenidas, demos-
([Link] tró la circulación de los genotipos G8, P[1], I2 y E2, res-
classification/rcwg). pectivamente, en un pool de ostras positivos para RVA
(Figura 2). No se descarta aun la
FIGURA 1 - Análisis filogenético realizado a partir de la secuencia
presencia de otros genotipos en la
nucleotídica de NoV GII detectado en ostras
muestra.

(A) La cepa OystersBA/2019 (l)

pertenece al genogrupo II, genotipo 4
(GII.4) (Norovirus Genotyping Tool).
(B) El árbol filogenético muestra que la
cepa argentina agrupa con
GII.4/Sidney/2012 y comparte la rama
con cepas de China y Australia.

La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214 47

INOCUIDAD

48 La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214

Figura 2 (A, B,C y D) - Análisis filogenético realizado a partir de secuencias parciales de los genes VP4, VP7, VP6

INOCUIDAD
y NSP4. Referencias de las figuras: cepa identificada en este estudio (l), cepas vacunales (p), cepas argentinas
humanas y animales previamente reportadas (n).

La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214 49

INOCUIDAD

En la figura 2 se muestran los números de acceso de rama próxima contiene cepas humanas y animales. Las
cada una de las cepas utilizadas para los análisis. Los cepas vacunales (genotipo G1) no se relacionan con la
números en los nodos indican los valores de soporte cepa estudiada. (C) NSP4 (E-type). El gen de NSP4 agru-
estadístico obtenidos (>75%). La barra de escala que se pa dentro del genotipo E2 relacionado con cepas de bovi-
observa en la parte inferior del árbol representa la distan- nos de Brasil y cepas humas de Japón, India, Turquía y
cia nucleotídica entre las cepas (sustituciones por posi- USA. Las cepas vacunales agrupan en una rama relacio-
ción nucleotídica). (A) VP4* (P-type). El gen de VP4 nada al gen detectado. (D) VP6 (I-type). El gen de VP6
agrupa con cepas bovinas y humanas genotipo P[1]. Las agrupa junto a una cepa canina de Turquía y en la rama
cepas vacunales (P[8]) y las demás cepas Argentinas no próxima una cepa bovina de Brasil. En las ramas relacio-
se relacionan con la cepa detectada. (B) VP7 (G-type). El nadas se observan nuevamente las cepas de Asia. Las
gen de VP7 agrupa en una rama propia dentro del geno- cepas vacunales y las cepas argentinas no se relacionan
tipo G8, no relacionada directamente con otras cepas. La con la cepa estudiada.

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 INOCUIDAD

Viabilidad de RVA detectado en ostras DISCUSIÓN

La capacidad infectiva del aislamiento de RVA fue eva- El cultivo de moluscos bivalvos en la Argentina es una
luó mediante RT-PCR en tiempo real e IF. Se observó industria en desarrollo. Dentro de los moluscos, las
una disminución en el valor del CT (ciclo umbral) ostras constituyen una parte importante de la explota-
correspondiente al cuarto pasaje de RVA (CT=25), res- ción ([Link]/sitio/areas/acuicultu-
pecto del valor del CT correspondiente al genoma del ra/cultivos/marina/[Link]). Los bivalvos concentran
virus encontrado inicialmente en el pool de ostras activamente los virus al filtrar grandes volúmenes de
(CT=36). En cuanto al aislamiento viral, se observó un agua y, con frecuencia, se consumen crudos o escasa-
claro CPE luego del cuarto pasaje. La viabilidad del mente cocidos, representando un peligro para la salud
virus se confirmó mediante IFD con un nanoanticuerpo pública17. La descarga de aguas residuales (tratadas o
específico para la proteína VP6 de RVA (Figura 3). sin tratar) en las zonas costeras ha traído como conse-

La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214 51

 vacuna comercial. Esto podría ser debido a que la
INOCUIDAD
Figura 3 - Detección de partículas virales
infecciosas de RVA mediante IF. industria pesquera nacional trae barcos provenientes de
todo el mundo, los que liberan sus aguas residuales al
mar dispersando de esa forma los patógenos que luego
son concentrados por los moluscos bivalvos.
Cabe mencionar que es altamente probable que
existan otros genotipos de NoV o de RVA presentes en
las ostras debido a que concentran los virus presentes
en agua. Nuestro estudio requiere ser profundizado
dado que es muy probable que sólo hayamos detectado
las cepas predominantes. Es importante destacar que
se pudo demostrar la viabilidad de RVA aislado, lo cual
confirma el riesgo de enfermedad en caso de consumo
de ostras contaminadas.
El presente trabajo describe, por primera vez
en nuestro país, la presencia de virus patógenos en
cuencia la disminución de la calidad sanitaria del agua ostras de la provincia de Buenos Aires. Las muestras
donde se desarrollan explotaciones de moluscos bival- utilizadas en este estudio se recolectaron en una zona
vos, contaminándolos con patógenos humanos16. En ubicada frente a la localidad de Bahía San Blas, por
nuestro estudio, fue posible detectar las variantes NoV fuera de las zonas de restricción de SENASA. Si bien los
GII.4 Sidney 2012 y RVA G8P[1] en un pool de mues- organismos de control regulan la producción de molus-
tras de ostras (Crassostrea gigas) del sur de la provin- cos bivalvos, hasta el momento no contemplan la detec-
cia de Buenos Aires. ción y circulación de virus patógenos como fuente de
La detección de NoV y RVA en moluscos bival- contaminación. En este sentido, este trabajo demuestra
vos ha sido reportada previamente6. Sin embargo, este la necesidad de estudiar la presencia de virus en molus-
constituye el primer reporte realizado en la Argentina. cos bivalvos y aporta información a los organismos de
Los NoV genogrupos GI, GII y GIV son los principales control a fin de contribuir en el mejoramiento de políti-
responsables de las infecciones en humanos. Siendo el cas públicas que aseguren la inocuidad de los produc-
GII.4 uno de los genotipos que causa gastroenteritis tos de consumo humano.
más severas23. Desde mediados de los ’90 se han regis-
trado la aparición de nuevas cepas, incluyendo a la cepa BIBLIOGRAFÍA
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doi:10.1016/[Link].2017.03.006
Por otro lado, la detección de RVA genotipo
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G8-P[1]-I2-E2 en otro pool de ostras de la misma zona and phylogenetic analysis of a zoonotic human G8P[14] rotavirus
podría indicar que están siendo liberados al agua pató- strain. Infect Genet Evol. 2010. doi:10.1016/[Link]-
genos humanos, los que potencialmente pueden ser gid.2010.05.001
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consumidos por personas, generando así un brote de la and animal enteric caliciviruses in oysters from different coastal
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52 La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214

 INOCUIDAD
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La Industria Cárnica Latinoamericana Nº 214 53