Cromatografía HPLC

Química Analítica II
Prof. Loreto Ascar
2017
 GASES FLUIDO LIQUIDO
SUPERCRITICO

CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA COLUMNA PLANAR

GAS - SOLIDO GAS - LIQUIDO

LSC BPC IEC SEC TLC PC

BPC - RP BPC - NP GPC GFC

 Cromatografía líquida
• Fase Móvil: líquido
Muestras: líquidas (no volátiles)
sólidas disueltas en un solvente adecuado
termolábiles

Fase Estacionaria:
Origen: Cromatografía en columna
columnas de vidrio
Diámetro: 1 a 5 cm
Longitudes: 50 a 500 cm
Diámetro partículas: 150 a 200 µm
Tiempos de análisis largos (varias horas)
Eficacia de la columna en HPLC

dp: Diámetro de las partículas

de relleno, cm
 : Factor de empaque

Rellenos de 3 a 10 um  HPLC
Debido a la disminución del tamaño de las partículas y el aumento
de la densidad del empaque, fue necesario incorporar presión al
sistema para ayudar a la fase móvil a pasar a través de la columna.
 Esta cromatografía líquida a altas presiones se denominó:
HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Debido a que la presión por si sola no ayuda a los procesos de

separación, se modificó este nombre por:

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATROGRAPHY

(HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía líquida moderna se caracteriza por:

 Columna reusables de diámetro pequeño (2-5 mm)

 Columnas rellenas con partículas muy pequeñas (3-10 µm)

 Altas presiones de la fase móvil y velocidad de flujo controlado.

 Detectores especiales, con detección continua para cantidades de
muestras pequeñas.
 Instrumentos automatizados.
Instrumentación para HPLC
Instrumentación para HPLC
Recipientes para la fase móvil
 Filtrar la fase móvil
 Desgasificar

 Un solo disolvente o una mezcla

  Filtración de la fase móvil

Para evitar tapar los filtros, válvulas y la columna

Se utilizan filtros de 0,45 a 0,20 µm
  Desgasificación de la fase móvil
Bombeo de vacío
Destilación
Reflujo
Agitación
 Purga con gas inerte (He)
 Desgasificador en línea
 Características de la Fase móvil

 Componentes de la muestra deben ser solubles en ella

 No degradar ni disolver a la fase estacionaria

 Tener baja viscosidad

 Compatible con el detector

 Se puede utilizar un disolvente solo durante el análisis o una

mezcla de dos o más disolventes
A y B son las fracciones
de volumen de los solventes
 Tipos de elución

 Isocrática
Composición de la fase móvil constante en el tiempo

 En Gradiente
Composición de fase móvil variable en el tiempo
Tipos de elución
Elución Isocrática
A: Tampón acuoso
(KH2PO4 25mM a pH 3,5)
B: Acetonitrilo

(1) Alcohol bencílico

(2) Fenol
(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona
(4) Benzoína
(5) Benzoato de etilo
(6) Tolueno
(7) 2,6 dimetoxitolueno
(8) o-metoxibifenilo
Elución en Gradiente

(1) Alcohol bencílico

(2) Fenol
(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona
(4) Benzoína
(5) Benzoato de etilo
(6) Tolueno
(7) 2,6 dimetoxitolueno
(8) o-metoxibifenilo
Instrumentación para HPLC
 Sistemas de Bombeo
 Flujo continuo y reproducible en el tiempo

 Presiones de trabajo altas, debido al pequeño tamaño de las

partículas de relleno

 Libre de pulsaciones

 Intervalo de caudal 0,05 a 10 mL/min

 Componentes resistentes a la corrosión

 Tipos de bombas
 De desplazamiento
no permiten elución en gradiente
 Neumáticas
 Recíprocas

Permiten flujo constante y libre de son baratas, no presentan impulsos,

pulsaciones, tiene una capacidad de tienen un limitada capacidad y presión
disolvente limitada (aprox 250 mL) y es de salida (inferiores a 2000psi).
poco práctico el cambio de solvente
  Bombas Recíprocas

El disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por

un motor.
Pequeño volumen interno (35 a 400 µL), altas presiones a la salida, fácil
adaptación a la elusión con gradiente y flujos constantes
Instrumentación para HPLC
 Sistema de inyección de muestra

 Precisión en la medición de la muestra, es un factor limitante

en HPLC
 Se debe introducir la muestra como un tampón
 No se debe despresurizar el sistema

Esta parte del instrumento exige cuidadoso diseño puesto que

debe resistir altas presiones, tener un volumen pequeño y sus
cavidades deben ser bien barridas por la fase móvil.

Para el ingreso de las muestras se emplean Bucles, válvulas

inyectoras o válvulas de loop, estos incrementan la
reproducibilidad de la medición de la muestra
Válvulas Inyectoras, válvulas de loop o bucles
Autosampler
Instrumentación para HPLC
 Columnas y Fases Estacionarias

 La columna consiste en un segmento de tubo de algún

material inerte, de diámetro uniforme y capaz de resistir altas
presiones.

 Existen de vidrio de paredes resistentes (presiones menores a

600 psi) y de acero inoxidable (mas utilizado)

 De diferentes tamaños y rellenos

 Columnas para HPLC

Diámetro interno: 2,1 a 10 mm

Longitudes: 3 a 30 cm
Diámetro partículas: 3 a 10 µm

Columna más utilizada: 15 o 25 cm de largo, 4,6 mm de diámetro interno y relleno con

diámetro de partícula de 5 µm. Se logran obtener entre 40000 y 60000 platos /metro.

Actualmente, se están elaborando columnas mas pequeñas, de 3 a 7,5cm de largo,

con diámetros internos de 1 a 4,6 mm y con rellenos con diámetro de partícula
menores a 2 µm, logrando obtener del orden de 100000 platos /metro
Precolumnas o columnas de resguardo

• Son de relleno similar al de

la columna analítica
• Tamaño de partícula mayor
La separación en cromatografía líquida, se lleva a cabo mediante
interacciones entre la muestra y la fase estacionaria.

Representación microscópica del proceso de partición de moléculas A y B de analito

en la fase estacionaria enlazada a un soporte sólido esférico.

Las fases estacionarias difieren en su composición química, estructura y tamaño de

partícula, dando lugar a los diferentes tipos de cromatografía líquida
 Tipos de relleno
 Pelicular, bolas de vidrio o polímero no porosas y
esféricas, con diámetro de 30 a 40 µm
En la superficie de las bolas se deposita una capa delgada y porosa
de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de
una resina de intercambio iónico. Estos rellenos se suelen utilizar en
las precolumnas

 Partícula porosa, micropartículas porosas con diámetros

de 3 a 10 µm muy homogéneas
Las partículas también son de sílice, alúmina, resina sintética
(poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico,
siendo la sílice la mas común en HPLC
Instrumentación para HPLC
 DETECTOR IDEAL

 Adecuada sensibilidad
 Estabilidad y Reproducibilidad
 Respuesta lineal en un rango amplio
 Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal
 Respuesta semejante para todos los solutos e
idealmente selectiva
 Volumen interno mínimo
 No destructivo
 Detectores
 Basados en propiedad del soluto
Absorbancia Ultravioleta
Fluorescencia
Electroquímico

 Basados en propiedad de la disolución (fase móvil)

Índice de refracción
Conductividad
Dispersión de Luz
Detectores de Absorbancia

P0 P

A = log P0 / P
A = abC
 Detectores de Absorbancia
Existen los con Filtros y los con Monocromadores

Filtros, aisla una línea intensa por medio de filtros: 254,

250, 313,334 y 365 nm

Monocromadores, se puede hacer un barrido de

longitudes de onda (detectores de arreglo de diodos)
Esquema de una celda de flujo en forma de Z
 Detectores de Fluorescencia
Fundamentos

La fluorescencia tiene lugar cuando los compuestos que poseen

determinados grupos funcionales específicos, se excitan con
energía de ciertas longitudes de onda y emiten radiación de
mayores longitudes.
 Detectores de Fluorescencia

P0 P

F=KC
Sólo es lineal a concentraciones bajas µg/L
 Detectores Electroquímicos
Se basan en la oxidación o reducción de los compuestos
eluidos frente a un electrodo y la señal corresponde a la
corriente resultante.

El detector electroquímico o polarográfico, presenta una

alta sensibilidad y selectividad.
Grupos funcionales orgánicos detectables potencialmente por medidas amperométricas
 Detector de Índice de Refracción
Es el detector de uso más universal, responde a casi todos los
solutos

El índice de refracción de un compuesto es función de su

densidad molecular.

Al variar la densidad se producen cambios en el índice de

refracción, por lo que es sensible a los cambios en la
concentración de la muestra o del disolvente, generando un
cromatograma.

Son sensibles a los cambios de presión y temperatura, ya que

ambos producen cambios en la densidad.

Son fiables y no dependen del caudal

 Detectores de Conductividad

Se mide continuamente la conductividad específica del eluyente,

por lo tanto la presencia de muestra provoca un cambio en la
conductividad de la fase móvil.

Con este detector sólo se puede trabajar en sistema isocrático.

La temperatura se debe mantener rigurosamente constante.

 Detector de Dispersión de Luz (ELS)

La detección de la dispersión de la luz (ELS), se lleva a cabo por

evaporación, nebulizando el flujo de eluyente que provienen de un
sistema de cromatografía liquida y transportando las gotas
resultantes mediante una corriente de gas.

A continuación se produce la evaporación de la fase móvil de las

gotas.

Cuando un analito es menos volátil que la fase móvil este se

mantiene en el caudal de gas como una partícula de soluto “seco” y
fluye hacia el detector ELS
Las partículas del analito se introducen en la zona de detección,
donde una fuente luminosa incide sobre ellas

Esto hace que la luz se disperse y se concentre en un tubo

fotomultiplicador, donde se mide su intensidad

Cuando mayor sea la dispersión más intensa es la señal en el

cromatograma

APLICACIONES
El detector responde a todos los compuestos que sean
suficientemente no volátiles respecto a su fase móvil en las
condiciones del análisis
En general compuestos que no muestran respuesta al UV-Vis o
fluorescencia
 Limitaciones de la detección por dispersión de Luz

Carece de linealidad en un amplio rango de concentraciones

 Es una técnica destructiva

 Cualquier partícula puede interferir con la señal de la muestra, ya

que el detector responde por igual a todas ellas, esta falta de
selectividad puede producir un ruido de fondo problemático
DETECTORES APLICACIÓN

Absorbancia Cromóforos, compuestos que absorben luz

Fluorescencia Selectivo para compuestos Fluoróforos

Electroquímico Selectivo para compuestos electroactivos

Índice de Refracción Universal, mide cambios en el IR

Conductividad Específico para iones

Dispersión de Luz Para compuestos menos volátiles que la fase

móvil
DETECTORES HPLC LÍMITES DE DETECCIÓN

Absorbancia 10 pg
Fluorescencia 10 fg
Electroquímico 100 pg
Índice de Refracción 1 ng

conductividad 100 Pg - 1 ng
Tipos de cromatografía HPLC
Esquema de las bases de la separación en cromatografía de:
(a) adsorción, (b) partición, (c) Intercambio iónico y (d) Exclusión por tamaño
 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
El líquido de la fase estacionaria está adsorbido sobre un
soporte sólido. Los líquidos que componen ambas fases
deben ser inmiscibles

• Cromatografía líquido – líquido

(adsorción física de la fase estacionaria sobre el soporte)
Desventaja: Pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase
móvil, no permite trabajar en gradiente

• Cromatografía de fase unida químicamente o enlazada

(unión química de la fase estacionaria sobre el soporte)
 Fase Estacionaria

Sílice hidrolizada

R es un grupo alquilo o alquilo sustituido , le confiere carácter polar o apolar:

Polares: Fase Normal Apolares: Fase Reversa
ciano ((–C2H4CN) cadena hidrocarbonada
diol (–C3H6OCH2CHOHCH2OH) n-octyl (C8)
amino (–C3H6NH2) n-octyldecyl (C18)
 Fases estacionarias polares

Fases móviles apolares o medianamente apolares

Mezcla de solventes orgánicos: dietileter, diclorometano,
cloroformo con n-hexano para regular la fuerza del eluyente
 Fases estacionarias apolares
Octadecil: Si-O-Si -------------CH3
Octil: Si-O-Si--------CH3
Dimetil: Si-O-Si - CH3
CH3

Fases móviles polares

Mezcla de solventes orgánicos: acetonitrilo, metanol,
tetrahidrofurano con agua para regular la fuerza del eluyente
 Rellenos de Fase Normal y Fase Inversa

Fase Normal Fase Inversa

F estacionaria: polar F estacionaria: apolar
F móvil: apolar F móvil: polar
Fase Normal y Fase Inversa
 Efecto largo de cadena en fase inversa

Partículas de 5 µm, fase móvil 50/50 : metanol/agua, caudal 1,0 mL/min

 Elección del Método Cromatográfico
Debe existir un adecuado equilibrio entre las fuerzas
intermoleculares del soluto, fase móvil y fase
estacionaria

 Soluto muy afín con fase móvil, tiempo de elución muy bajo,
pobre separación

 Soluto muy afín con fase estacionaria, tiempo de elución

excesivamente largo

Polaridad grupos funcionales:

Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas <
aminas < alcoholes
Acetaminofen, cafeína, ácido benzoico y ácido salicílico
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
 Derivatización

• Reducir la polaridad de los analitos, poder usar cromatografía

de reparto
• Aumentar la respuesta del detector (sensibilidad)
• Aumentar la selectividad del detector
CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS (ICP)

Permite la determinación de especies iónicas por cromatografía

de reparto en fase inversa, a través de dos posibles mecanismos:

• Formación de pares iónicos del contraión con la muestra

ionizada, para formar la especie neutra que luego va a
interactuar con la fase estacionaria.
• La cadena alquílica del contraión se reparte en la fase
estacionaria dejándola cargada, esto convierte la columna de
fase inversa en una columna iónica.
CROMATOGRAFÍA CON FASES ESTACIONARIAS
QUIRALES
Es una metodología que permite la separación de isómeros
ópticamente activos (enantiómeros)
Se recubre el soporte con un polímero al cual se le enlaza un
isómero ópticamente activo
 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Cromatografía líquido- sólido

Fase estacionaria: altamente polar (Sílice o alúmina)

Fase móvil: relativamente no polar

Es adecuada para compuestos no polares, solubles en

disolventes no polares, de masas moleculares inferiores
a 5000
 SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

La cromatografía de adsorción separa mezclas de solutos en

dos clases de compuestos, separados por la polaridad de sus
grupos funcionales, debido a que algunos compuestos
presentan alta afinidad con la fase estacionaria, mientras que
otros presentan una afinidad débil.

El equilibrio existente se ve fuertemente afectado por la

competencia con la fase móvil.
En la cromatografía de adsorción hay dos procesos
competitivos involucrados:
•Reacciones entre el grupo funcional del soluto y los sitios de
enlace de la fase estacionaria.
•Competencia entre la fase móvil y las moléculas del soluto
por los sitios de enlace de la fase estacionaria

• Para optimizar las separaciones sólo se puede

modificar la composición de la fase móvil
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
(cromatografía en geles o filtración en geles)

La cromatografía de exclusión por tamaño, consiste en una fase

estacionaria de geles con tamaño de poro controlado.
Los componentes de la muestra se separan de acuerdo al tamaño
de sus moléculas
 Rellenos de columna

Pequeñas partículas poliméricas o de sílice (5 a 10 um de tamaño),

con una red de poros uniformes en los que pueden difundir las
moléculas de soluto y el disolvente
Rellenos de columna
Separación por cromatografía de exclusión por tamaño

La curva de calibración se realiza con estándares.

Aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño
Filtración sobre gel: para muestras hidrosolubles, utilizan
disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos.
Penetrabilidad sobre gel : para muestras menos polares, emplean
disolventes orgánicos no polares y los rellenos son hidrofóbicos.
 Cromatografía de intercambio iónica
o cromatografía iónica (IC)

Separación y determinación de iones utilizando resinas de

intercambio iónico.

Utiliza como fase estacionaria una resina y como fase móvil un

disolvente
Los intercambiadores catiónicos contienen ácido sulfónico o
carboxílico.
Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino
cuaternarios –N(CH3)3+OH- o grupos amina primaria -NH3+OH- los
primeros son base fuerte y los segundos base débil.
Intercambiadores catiónicos:

xRSO3- H+ + M X+ <---> (RSO3-)x MX+ + xH+

sólido disol. sólido disol.

RSO3- H+ : grupos de Ac. sulfónico unidos a una gran molécula polimérica.

El analito eluye con un ácido, para desplazar el equilibrio (HCl)

Intercambiador aniónico:
RN(CH3)+ OH- + A X- <----> RH (CH3-) A x- + xOH-
sólido disol sólido disol
RN(CH3)+ OH-: grupos de amina cuaternaria o primaria, unidos a una gran
molécula polimérica.
El analito eluye con una base, para desplazar el equilibrio (NaHCO3)
 Rellenos de Intercambio Iónico

Partículas esféricas porosas producidas por la polimerización de

estireno con divinilbenceno
 Rellenos de Intercambio Iónico

Resinas de intercambio catiónico:

ácido sulfónico (-SO3-H+, ácido fuerte)
ácido carboxílico (-COO-H+, ácido débil)

Resinas de intercambio aniónico:

grupos amino cuaternarios (–N(CH3)3+ OH- , base fuerte)
grupos amina primaria ( -NH3+ OH- ,base débil)
 Fase móvil en cromatografía de intercambio iónico

Características:
Debe solubilizar la muestra
Tener una fuerza disolvente que conduzca a tiempos de retención
razonables
Debe interactuar con los solutos de tal forma que favorezca la
selectividad

La fase móvil suele ser acuosa, con cantidades moderadas de

disolventes orgánicos miscibles con agua y alguna solución tampón.

En general, los iones de la fase móvil compiten con los iones del
analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico
 Detectores

Los mas utilizados han sido los de conductividad

Universales a especies cargadas
Elevada sensibilidad
Responden bien a cambios de concentración
Simples, baratos, durables

Limitaciones:

Requieren concentración elevada de electrolito para eluir la mayoría

de los iones de analito en un tiempo razonable.

La conductividad de los componentes de la fase móvil tiende a

enmascarar la de los analitos, lo que reduce considerablemente la
sensibilidad del detector.
Métodos de intercambio iónico

Sin columna supresora

Con columna supresora
Cromatografía iónica con columna supresora
 Cromatografía iónica con columnas supresoras

También contienen una resina de intercambio iónico, que transforma los iones
del disolvente en especies moleculares poco ionizadas, sin afectar a los iones
del analito

Para la separación de cationes:

H +(ac) + Cl- (ac) + Resina + OH – (s) ---> Resina + Cl –(s) + H2O

Para la separación de aniones:

Na +(ac) + HCO 3-(ac) + Resina – H +
(s) -----> Resina- Na + (s) + H 2 CO3 (ac)

Las columnas supresoras se deben regenerar cada 8 a 10 horas de uso

Las membranas supresoras: se regeneran en forma constante durante su uso
Cationes y metales de transición
Aplicaciones
 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)
ultra high performance liquid chromatograph (UHPLC)

De acuerdo a la ecuación de van Deemter, cuando el tamaño de partícula

decrece a menos que 2 µm, hay una significativa ganancia en la eficiencia (H), la
cual no se ve afectada por el incremento de la velocidad lineal del flujo