SEMANA Nº 1 ESPECTROFOTOMETRÍA
I FUNDAMENTO.
La espectrofotometría constituye una de las técnicas analíticas que
aprovecha la propiedad de las sustancias químicas de absorber una
determinada longitud de onda del espectro visible o ultravioleta.
La intensidad de la absorción depende de la concentración de la
sustancia, ya que ésta mantiene relación directa con el número de
moléculas disueltas en el solvente. También depende de la distancia
que debe recorrer el rayo de luz en una determinada solución, debido
a que cuanto mayor es el recorrido que realiza la luz mayor será la
posibilidad de ser absorbida por la molécula química; finalmente
depende del coeficiente de extinción, propiedad que es inherente a la
naturaleza química de la sustancia.
Estas observaciones se expresan de una manera matemática a través
de la ley de Lambert y Beer:
Log Io
=Cxlx ε
Log It
Donde:
C = concentración de la muestra
Log Io = log de la luz incidente.
l = paso de luz en la cubeta (cm)
Log It = log de la luz transmitida.
ε = coeficiente de extinción
La relación log.Io/log.It se denomina densidad óptica; el valor de l es
generalmente igual a 1 debido a que el paso de luz en la cubeta es de 1 cm y ε
es el coeficiente de extinción, que puede tener las dimensiones de molaridad, en
cuyo caso tendremos εM= Coeficiente de extinción molar ò ε1%=Coeficiente de
extinción 1%.
Reemplazando:
DO = C. I. ε
Ya que l es igual a 1, tendremos que: DO = C.ε
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Determinación de la concentración de una muestra problema
La determinación cuantitativa de la concentración de una solución problema
puede realizarse:
1.- Utilizando el factor de calibración.
2.- Usando una curva de calibración.
1.- FACTOR DE CALIBRACIÒN
Con el propósito de realizar determinaciones cuantitativas es necesario
utilizar una sustancia estándar, que debe corresponder a la sustancia
motivo de la cuantificación. Ejemplo: Si deseamos cuantificar glucosa
en suero, es necesario utilizar un estándar de glucosa, para cuya
finalidad podremos establecer la siguiente relación:
DOst = Cst x ε y DOp = cp x ε
Luego:
DOst Cst. ε
=
DOp Cp. ε
Debido a que ε es igual para el St y el problema podemos simplificar,
= Despejando; Cp = DOp
La relación corresponde al “factor de calibración”, por cuyo motivo,
para realizar una determinación cuantitativa solamente deberá
multiplicarse la DOp x factor de calibración y de esta manera
obtendremos la concentración del problema. La expresión de los
resultados dependerá de la manera en que se expresa la concentración
estándar. Si el estándar se expresa como mg/100 mL los resultados se
expresarán de la misma manera, es decir, mg/100 mL, en caso que el
estándar se expresara con g/1000mL el problema se expresara de la
misma manera, es decir, g/1000 mL.
II OBJETIVO
Explicar los fundamentos de la técnica espectrofotométrica y sus aplicaciones.
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III METODOLOGÍA
2.- CURVA DE CALIBRACIÓN
Con este propósito se utiliza una solución estándar de concentración
conocida, luego bajo las mismas condiciones en que se va a realizar la
determinación cuantitativa de la muestra problema se procede con el
estándar. Para elaborar la curva de calibración se preparan varias
concentraciones del estándar (en la Práctica se utilizará como solución
estándar el azul de metileno) cuyas densidades ópticas se leen en un
espectrofotómetro y luego se grafican los resultados obtenidos
conforme se describe posteriormente.
EXPERIMENTO 1: Instrumentación, Espectrofotometría
Tubos Nº
REACTIVOS
1 2 3 4 5
mL de Azul de metileno (10.0 mg/L) 1 2 3 4 5
mL de Agua destilada 4 3 2 1 0
Mezclar apropiadamente los tubos y leer la densidad óptica en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm.
Es necesario calcular las concentraciones del azul de metileno en cada
uno de los tubos.
Graficar los resultados obtenidos en un papel milimetrado. En el eje de
abscisas anotar las concentraciones de azul de metileno de cada tubo
y en el eje de ordenadas la densidad óptica correspondiente. Debe
obtenerse una línea recta que se inicia en el origen.
Ejemplo: En el tubo N° 1 la concentración de azul d e metileno será (AM)
1,000 mL ---------------- 10 mg
1 X 10
1 mL --------------------- X X= X = 0.01 mg
1,000
Es decir, en 5 mL hay 0.01 mg de AM, luego
En 5 mL -------------- 0.01 mg
0.01 x 100
100 mL --------------- X X = X = 0.2 mg/100mL
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