“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”

NOMBRE Y APELLIDOS:

 Coloma Terrara Carlos Fabian

 Barranzuela Criollo Adiel Carlos

 Rentería Neyra Diego Alonso

BIOLOGO:

 Henry Robles Cueva

CURSO:

 Biología y educación ambiental/petróleo

TEMA:

 Técnicas de laboratorio para la coloración e identificación de cromosomas

CICLO:

 II

PIURA - 2022
 INDICE
.....................................................................................................................................................1
“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”................................................................................1
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................3
I. TECNICAS.........................................................................................................................4
A. TECNICA PARA CULTIVO Y PREPARACION CROMOSOMICA......................4
B. TECNICA DE CULTIVO PARA EXPRESION DEL X FRAGIL.............................5
II. ESTUDIOS CROMOSÓMICOS...................................................................................5
III. ¿Cuál ha sido la evolución de las técnicas citogenéticas?............................................8
A. Citología convencional...................................................................................................8
B. Hibridación in situ con fluorescencia (fish, de sus siglas en inglés)............................8
C. Hibridación genómica comparada (CGH, de sus siglas en inglés)..............................9
D. Nuevos sistemas de análisis basados en array CGH y array de SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms) denominados Whole Genome Array....................................10
IV. CONCLUSIONES..........................................................................................................11
IV. ANEXOS.............................................................................................................................12
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................................13
 INTRODUCCIÓN

Las técnicas usadas o descritas en este informe, la mayoría de estas presentan variaciones con
respecto a las técnicas originarias por a ver sido llevadas a las condiciones particulares del
laboratorio. En estos cultivos las células crecen libres en el medio, sin adherirse a las paredes
del recipiente en que se encuentran. Las condiciones de cultivo varían de acuerdo al tipo de
anomalía sospechada y a las características que se desean observar, Los medios mas apropiados
incluyen: RPMI 1640, Medio Esencial Mínimo y Medio TC 199. Como los linfocitos
normalmente no se multiplican, llegan a necesitar de un estimulo con un agente de acción
mitogénica.
I. TECNICAS

A. TECNICA PARA CULTIVO Y PREPARACION CROMOSOMICA

 SIEMBRA:

- Adicionar 0.5 ml de sangre periférica completa heparinizada a 5ml del medio

cultivo que contenga una solución de antibióticos al 2% de suero fetal bocino y 0.2
ml de fitohemaglutinina.
- Incubar por 69 horas a 37oC+

 COSECHA:

- Aplicar colchicina por 20 minutos a 37oC

- Centrifugar a 1200 rom durante 10 minutos
 - Descartar el sobrenadante
- Adicionar 10 ml de solución hipotónica a 37 oC por 10 minutos
- Centrifugar y descartar el sobrenadante
- Resuspender el botón celular con golpes suaves y adicionar solución fijadora
completando hasta 8 ml
- Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos
- Centrifugar 10 minutos y descargar el sobrenadante
- Cambiar el fijador 3 a 4 veces usando siempre solución fresca y dejando por 5
minutos
- Extender 4 o 5 gotas de la preparación sobre una lámina fría y húmeda, flamear a
distancia.
B. TECNICA DE CULTIVO PARA EXPRESION DEL X FRAGIL

Para la detección del cromosoma X frágil es especialmente importante tener en cuenta

las condiciones especiales del cultivo que incluyen: deficiencias de ácido fólico por
medio, por lo cual se debe usar medio TC 199, ph alto (mayor de 7.3 en el momento de
la siembra) y bajo contenido de suero (5%). La metodología de siembra y cosecha es
idéntica a la descrita anteriormente.
Para mejor visualización del sitio frágil es convenientemente teñir por lo menos una
lámina con la coloración homogénea de Giemsa.

II. ESTUDIOS CROMOSÓMICOS

 Cariotipo. Para poder ver los cromosomas con un microscopio, es necesario teñirlos.
Cuando se los tiñe, los cromosomas parecen tiras con "bandas" claras y oscuras. La
representación gráfica (la fotografía real de una célula) de todos los 46 cromosomas, en
sus respectivos pares, recibe el nombre de "cariotipo" El cariotipo normal de la mujer se
escribe 46, XX, mientras que el cariotipo normal del hombre se escribe 46, XY. El
análisis estándar del material cromosómico evalúa tanto el número como la estructura
de los cromosomas con una gran precisión. Los análisis cromosómicos en general se
realizan a partir de una muestra de sangre (glóbulos blancos), muestras prenatales,
biopsia de piel o alguna otra muestra de tejido. Los cromosomas son analizados por
profesionales de la salud especialmente capacitados que poseen estudios avanzados en
tecnología citogenética y genética. El término "citogenética" se utiliza para describir el
estudio de los cromosomas.

En un cariotipo, es posible que los cromosomas se vean doblados o torcidos. Esto es

común y se debe a la posición que hayan tenido en el portaobjetos en el momento en
que se tomó la fotografía. Los cromosomas son estructuras flexibles que se condensan y
se alargan durante las diferentes etapas de la división celular. Si se descifrara todo el
ADN que conforma los 46 cromosomas, se encontraría más de 7 pies de ADN en una
sola célula.
 Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su longitud
relativa y a la posición del centrómero, que define su morfología. De esta manera, el
cariotipo humano queda formado así:
 Grupo A: Se encuentran los pares cromosómicos 1, 2 y 3. Se caracterizan por
ser cromosomas muy grandes, casi metacéntricos. En concreto, 1 y 3
metacéntricos; 2 submetacéntrico.
 Grupo B: Se encuentran los pares cromosómicos 4 y 5. Se trata de cromosomas
grandes y submetacéntricos (con dos brazos muy diferentes en tamaño).
 Grupo C: Se encuentran los pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Son
cromosomas medianos submetacéntricos.
 Grupo D: Se encuentran los pares cromosómicos 13, 14 y 15. Se caracterizan
por ser cromosomas medianos acrocéntricos con satélites.
 Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18. Son cromosomas
pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17 y 18.
 Grupo F: Se encuentran los pares cromosómicos 19 y 20. Se trata de
cromosomas pequeños y metacéntricos.
 Grupo G: Se encuentran los pares cromosómicos 21, 22. Se caracterizan por
ser cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con satélites).
Mediante el cariotipo se pueden analizar anomalías numéricas y estructurales, cosa que
sería muy difícil de observar mediante genética mendeliana.

 Estudios cromosómicos de bandeo extendido. Los estudios de bandeo extendido o de

"alta resolución" comprenden el estudio de los cromosomas con una resolución más alta
que la del análisis cromosómico estándar mencionado anteriormente Los cromosomas
están dispuestos de manera tal que se alargan un poco, por lo que se pueden ver más
bandas. Esto permite observar partes más reducidas del cromosoma e identificar, de este
modo, anomalías cromosómicas estructurales más pequeñas que no pueden ser vistas en
un análisis de rutina.

 Hibridación fluorescente in situ (su sigla en inglés es FISH). La hibridación

fluorescente in situ es una técnica de laboratorio que determina cuántas copias de un
segmento específico de ADN existen en una célula. También se utiliza para identificar
cromosomas con estructuras anómalas. En el laboratorio, se modifica químicamente un
segmento de ADN y se lo marca de manera que pueda ser visto fluorescente (muy
brillante) utilizando un microscopio especial. Este ADN se conoce como "sonda".
Cuando se las coloca en las células bajo ciertas condiciones, las sondas pueden detectar
segmentos homólogos de ADN.

Por ejemplo, si se sospecha que un bebé padece del síndrome de Down de trisomía 21 y
se realiza una amniocentesis durante la gestación, las células detectadas en el líquido
amniótico pueden estudiarse a través de una hibridación fluorescente in situ. Una sonda
 hecha para el cromosoma 21 puede determinar la cantidad de copias del cromosoma 21
que el bebé posee. Con un microscopio especial, se vería que las células del bebé con
trisomía 21 contienen tres "marcas" o tres áreas brillantes, en donde la sonda detectó los
tres cromosomas #21. El estudio de hibridación fluorescente in situ no reemplaza un
estudio cromosómico estándar, sino que lo complementa según el defecto congénito del
que se trate.

La hibridación fluorescente in situ se puede utilizar para detectar anomalías

cromosómicas estructurales (como las deleciones submicroscópicas) que se encuentran
más allá de la resolución de los estudios cromosómicos de bandeo extendido.

"Telómero" es un término que se utiliza para describir los extremos de los cromosomas.
Cuando se utiliza la hibridación fluorescente in situ específicamente para buscar
anomalías cromosómicas en esta zona, se la denomina “examen subtelomérico FISH”.

 Análisis de microarreglo cromosómico (CMA, por sus siglas en inglés). El CMA es

un nuevo análisis que se utiliza para detectar desequilibrios cromosómicos a una
resolución mayor que las técnicas cromosómicas estándar actuales o las técnicas FISH.

Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN para control se
disponen en un orden (arreglo) particular sobre un portaobjetos de vidrio. A las
muestras de ADN se añade colorante fluorescentes. Luego se colocan los portaobjetos
en un lector especial que mide el brillo de cada área fluorescente.

Este proceso busca identificar un cambio en el número de copias de ADN. Los cambios
en los números de copias de ADN pueden representar cambios observados en la
población general, los cuales no causan enfermedades genéticas. Sin embargo, algunos
cambios en los números de copias pueden indicar una anomalía cromosómica, como un
desequilibrio cromosómico, pérdida o ganancia. Los tipos de anomalías cromosómicas
pueden incluir pequeñas reordenaciones cromosómicas, pequeñas duplicaciones de
material cromosómico (trisomia), o pequeñas supresiones de material cromosómico
(monosomia).
III. ¿Cuál ha sido la evolución de las técnicas citogenéticas?

A. Citología convencional

Hasta el año 1970, los cromosomas se teñían de forma uniforme, por lo que las parejas de los
diferentes cromosomas se ordenaban por su tamaño y parecido morfológico. Más adelante, en al
año 1971, se desarrollaron técnicas que tenían los cromosomas en bandas claras y oscuras (o
fluorescentes y no fluorescentes). Esas bandas seguían distintos patrones que eran iguales solo
en cada pareja de cromosomas paterno y materno. En conjunto se establecieron cinco tipos de
análisis de los patrones de bandas citogenéticas:

1. Bandas Q, que aparecen como bandas fluorescentes y brillantes en contraste con otras
no fluorescentes. Estas bandas, aunque fáciles de obtener, presentan problemas
metodológicos y de análisis (se ven solo con luz ultravioleta, la fluorescencia dura poco
tiempo…).
2. Bandas C, que tiñen específicamente la heterocromatina de las regiones centroméricas.
3. Bandas G, llamadas así porque se tiñen con giemsa en forma de bandas transversales
claras y obscuras.
4. Bandas R, que en realidad constituyen la representación del patrón reverso de las bandas
G. Así las G oscuras, son claras en la tinción R y viceversa.
5. Bandas Ag-NOR, que muestran las regiones organizadoras nucleolares de los
cromosomas acrocéntricos (pares 13, 14, 15, 21 y 22).

En general, la técnica más utilizada para el diagnóstico citogenético es la tinción de bandas G,

quedando las C y las Ag-NOR, reservadas para el diagnóstico y/o confirmación de ciertos tipos
de alteraciones cromosómicas. No obstante, a lo largo del tiempo, la técnica de bandas G ha ido
modificándose, pasando a utilizar cromosomas menos metafásicos, incluso prometafásicos.
Estos últimos, al estar menos condensados (durante la profase los cromosomas se condensan y
acortan hasta su máximo nivel para formar la placa metafásica de la mitosis) son más largos, de
tal manera que la mayoría de las bandas observadas en el cromosoma metafásico se separan en
varias bandas claras y oscuras en el prometafásico. En la , se muestra un cariotipo a un nivel de
resolución de bandas convencional y que se corresponde con la identificación de alrededor de
400 bandas en el conjunto de los 46 cromosomas. En la, se muestran dos cariotipos con la
resolución incrementada, uno de 550 bandas y el otro de 850 bandas o de alta resolución.

B. Hibridación in situ con fluorescencia (fish, de sus siglas en inglés)

La FISH es una técnica basada en la estructura de doble cadena del ADN, concretamente en el
hecho de que las bases nitrogenadas del ADN son complementarias: la adenina se une
preferentemente con la timina y la citosina con la guanina (ver capítulo 3 de este curso). La
técnica de FISH consiste en diseñar un fragmento de ADN, denominado sonda, que es
complementario a una región candidata en el genoma objeto de estudio. Esta sonda se marca
con una sustancia fluorescente (un fluorocromo) y se añade a la preparación de células que se
quieren analizar. Mediante calor el ADN se desnaturaliza, separándose las dos cadenas, y la
secuencia génica en el ADN en estudio que es complementaria a la de la sonda fluorescente se
une (hibrida) con esta y queda marcada con una señal fluorescente que puede visualizarse en un
microscopio de fluorescencia. La resolución de las técnicas de citogenética molecular se define
como el tamaño mínimo que debe tener una alteración para ser detectada y se mide en
nucleótidos o pares de bases.

Las posibilidades que ofrece la metodología de FISH han dado lugar al desarrollo de técnicas
con diferente resolución y objetivos diagnósticos. Entre ellas, podemos destacar.
a) Pintado de cromosomas completos.
b) Localización de centrómeros.
c) Marcado de regiones teloméricas y de regiones subteloméricas
d)Identificación de regiones de ADN específicas de pequeño tamaño
(microdeleciones)
e) Cariotipo multicolor o espectral (multi-FISH o SKY-FISH), que tiñe cada
cromosoma con una combinación de fluorocromos diferente . En la actualidad, este
tipo de tinción solo es aplicable en investigación.

C. Hibridación genómica comparada (CGH, de sus siglas en inglés)

Utilizando como punto de partida los fundamentos de la FISH, a principio de los años 90 se
desarrolló una nueva tecnología denominada hibridación genómica comparada (CGH de sus
siglas en inglés). La CGH se basa en marcar el ADN del propositus con un fluorocromo verde y
el de un individuo normal o de referencia con un fluorocromo rojo y mezclarlos, realizando una
hibridación in situ sobre cromosomas normales. En esta situación, ambos ADN (propositus y
referencia) compiten por hibridar en los mismos lugares cromosómicos. Si el ADN del
propositus no tiene alteraciones, el resultado va a mostrar los cromosomas con una tinción
fluorescente amarilla y homogénea resultante de la mezcla, porque la cantidad de ADN rojo y
verde es igual (esto es en proporción 1:1). Sin embargo, si el ADN del propositus tiene una
deleción (pérdida de ADN), o una ganancia (duplicación) en una región cromosómica
determinada, el patrón de fluorescencia mostrará en esa zona incremento de la señal roja en caso
de deleción (ya que habrá más cantidad de ADN normal), o de la señal verde en caso de
ganancia (porque habrá más ADN en el propositus).
Una limitación de la CGH es que no detecta translocaciones balanceadas, en las cuales
únicamente existe un cambio en la localización de las secuencias afectadas por la translocación,
pero la cantidad de ADN no varía.
La alta especificidad y sensibilidad de las técnicas de FISH las han convertido en herramientas
de análisis casi rutinario en los laboratorios de citogenética y, junto con la CGH, han sido
incluidas dentro de un nuevo concepto denominado «citogenética molecular». No obstante, es
importante destacar que, a diferencia del cariotipo de alta resolución, la aplicación de estas
técnicas moleculares no es útil para realizar screening. Las técnicas moleculares (de cualquier
tipo) precisan de mayor información clínica previa a su utilización, pero no sustituyen, ni
excluyen al cariotipo de alta resolución, sino que lo complementan. Por ello, las técnicas de
FISH son de gran utilidad en los casos en los que el cariotipo de alta resolución es normal, pero
la clínica del niño hace sospechar que podría presentar alguna de las microdeleciones conocidas.
También son útiles cuando los cultivos para realizar el cariotipo no son buenos y se obtienen
pocas metafases o son de baja calidad.

D. Nuevos sistemas de análisis basados en array CGH y array de SNP (Single

Nucleotide Polymorphisms) denominados Whole Genome Array

La CGH ha evolucionado a sistemas más sofisticados y resolutivos en los cuales las metafases
han sido sustituidas por una superficie de sílice con pequeños fragmentos de ADN a la que se ha
denominado «chip». El «chip» puede contener cientos de miles de pequeños fragmentos de
ADN genómico de localización conocida (denominados sondas), que cubren la práctica
totalidad del genoma. La técnica de hibridación comparada sobre chips se denomina CGH array
y mantiene los mismos principios técnicos.
Un paso más en la tecnología de los «chips» ha sido la aparición de los arrays basados en single
nucleotide polymorphisms (SNP), que son secuencias de ADN que presentan variantes en la
base de un único nucleótido. Los SNP se encuentran bien caracterizados y se distribuyen a lo
largo de todo el genoma humano, lo que permite diseñar sondas de muy pequeño tamaño y gran
especificidad. A cada array diseñado con una distribución de sondas concreta se le denomina
plataforma. Si el diseño de la plataforma incluye SNP localizados a lo largo de todos y cada uno
de los cromosomas humanos, se denominan comercialmente whole genome array (WGA)
El WGA no utiliza ADN de referencia. Un escáner de alta resolución obtiene una imagen de la
fluorescencia relativa en cada punto y un software con parámetros estadísticos concretos
determina la intensidad y la posición de cada SNP hibridado. El resultado obtenido es igual al
que se muestra en la: una nube de puntos (las sondas) cuya fluorescencia relativa se representa
sobre una escala de intensidad de fluorescencia, que se ve reducida en caso de pérdida o
aumentada en caso de ganancia de número de copias en una localización concreta del genoma.
La resolución de los chips de ADN depende del número de sondas que cubren cada región
génica concreta y a qué distancia se sitúan entre ellas (densidad). Estas sondas detectan
alteraciones de muy reducido tamaño, que en los diseños más recientes llegan a ser de solo
cientos de pares de bases. Como comparativa, en la CGH convencional o la citogenética de alta
resolución, los tamaños de las alteraciones detectadas son del orden de varias megabases.
La aplicación de los arrays al diagnóstico de defectos congénitos, aunque aporta algunas luces,
presenta aún muchas sombras. Las limitaciones radican, principalmente, en la gran variabilidad
estructural del genoma humano, que ha mostrado una alta frecuencia de cambios en el número
de copias. Desde hace poco más de cinco años, al estudiar series de muestras de ADN de la
población general, se ha constatado que en sus genomas existe una gran cantidad de pérdidas,
ganancias y secuencias repetitivas. La mayor parte de estos cambios poseen grandes diferencias
en su estructura y frecuencia entre los individuos estudiados4 pero no han podido relacionarse
con patología alguna. A estas variaciones se les denominan copy number variation (CNV) y se
consideran polimorfismos. A pesar de que algunas de esas variaciones afectan a genes que se
han relacionado con ciertas patologías, estas no se manifiestan en los individuos estudiados de
la población general. No obstante, ya se han descrito casos de pacientes tanto con síndromes
mendelianos como con susceptibilidad a diferentes enfermedades, que son consecuencia de
modificaciones producidas por ciertas CNV que pueden alterar la expresión de genes, entre
otros mecanismos, por lo que se denomina efecto de posición.

IV. CONCLUSIONES

 Como conclusión, cuando aplicamos técnicas de array en un paciente con defectos

congénitos es probable encontrar distintas CNV, pero su significado, en muchos casos,
aún no resulta de fácil interpretación.
 Gracias a la obtención del cariotipo de una persona nos va a permitir saber si ese
individuo tiene toda la información genética propia de la especie humana o bien posee
algún exceso o defecto. También nos permite conocer si esta ordenada, ósea que cada
cromosoma mantiene su estructura.
 Que el establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para los estudios
de mapeo genómico, los cuales pueden llegar a ser utilizados en análisis taxonómicos,
ya que, dado, que cada especie posee un cariotipo distintivo, en términos de número y
morfología de los cromosomas.
 Nos damos cuenta que la citogenética convencional llega a ser una herramienta de
mucha importancia que permite realizar el diagnóstico cromosómico de pacientes con
indicación clínica de cromosomopatía, lo cual les va a permitir asesorar a las familias
respecto de dicha enfermedad, su pronóstico y riesgo de recurrencia.
  IV. ANEXOS

(Tipos de tinciones de los cromosomas)

(Comparación entre cromosomas de una resolución media (alrededor de 550 bandas) con
cromosomas de alta resolución (850 bandas))

(Las posibilidades que ofrece la metodología de FISH han dado lugar al desarrollo de técnicas
con diferente resolución y objetivos diagnósticos)

(Evolución de las técnicas de citogenética molecular)

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 https://www.stanfordchildrens.org/es/topic/default?
id=medicalgeneticschromosomestudies-90-P05224

 https://www.elsevier.es/es-revista-medicina-familia-semergen-40-articulo-resumen-
evolucion-tecnicas-citogenetica-genetica-S1138359310003199

 https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/IA/INS/citogenetica-
humana.pdf
‌