UT5.

CLONACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

Biología Molecular. SEGUNDO ANATOMÍA PATOLÓGICA.
CLONACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS
El análisis de los ácidos nucleicos requiere utilizar las técnicas de
amplificación para aumentar la cantidad de los mismos con el fin de poder
aplicar las diferentes técnicas de biología molecular.
 EL DNA
RECOMBINANTE

La clonación molecular es un
proceso de amplificación in
vivo de secuencias de ADN
genómico a ADNc basada en
la tecnología del ADN
recombinante.
Esta tecnología nos permite
conseguir numerosas copias
del ADN recombinante con
el fragmento de ácido
nucleico de interés.
Pasos del proceso
de clonación
1. Insertar el fragmento de
ADN que queremos
amplificar en una molécula
portadora llamada vector.
2. Introducción de dicho
vector recombinante en
una célula viva
hospedadora.
3. Multiplicación de las
células que portan el ADN
recombinante.
4. Recuperación del
fragmento amplificado.
VENTAJAS DE LA CLONACIÓN

• Permite obtener infinitas muestras de la

secuencia de interés.
• Permite clonar secuencias de ADN de gran
tamaño que no se pueden obtener mediante
la amplificación con PCR.
• Se puede clonar el genoma entero de un
organismo de una sola vez. Esto permite
crear librerías genómicas así como librerías
de ANDc.
• Permite la expresión de genes o de
secuencias de interés con aplicación
industrial para la producción de proteínas,
hormonas, etc.
 VENTAJAS DE LA CLONACIÓN
FRENTE A LA PCR

CLONACIÓN MOLECULAR PCR

Técnica in vivo Técnica in vitro
Se aprovecha la maquinaria replicativa de la célula para El DNA de interés se replica en un tubo de ensayo en el
amplificar el fragmento de DNA de interés. que se generan las condiciones artificiales adecuadas.

La técnica es manual y dura varios días. La técnica está automatizada y se lleva a cabo en horas.

Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de Las cantidades de secuencias de interés están limitadas
interés. por el número de ciclos de replicación que se realicen (25-
40)
Permite amplificar secuencias de DNA de millones de pb Bajos niveles de amplificación (hasta 3,5 Kb)
con el vector adecuado.
COMPONENTES DE LA CLONACIÓN

• Vectores de clonación para insertar el

DNA de interés.
• Células hospedadoras para utilizar su
maquinaria y que repliquen nuestro
vector.
Los vectores de clonación actúan como
vehículos de clonación, es decir, permiten
que las moléculas de DNA se repliquen de
manera autónoma en la célula huésped.
El fragmento de DNA de interés
introducido en el vector se denomina
inserto.
 ¿Cómo debe ser un
vector de clonación?
• Tener un origen de replicación compatible con la
maquinaria de replicación de la célula huésped.
• Tener un origen de inserción del DNA de interés a
replicar, como mínimo. Normalmente son secuencias
diana de las enzimas de restricción. Los vectores de
última generación presentan múltiples secuencias diana
que se concentran en una secuencia corta del vector
denominado sitio múltiple de restricción o sitio
múltiple de clonación o polylinker.
• Tener marcador de selección que permita distinguir las
células que portan el vector de las que no lo portan.
Normalmente son genes de resistencia a antibióticos o
genes que codifican enzimas que no tiene la célula
huésped de manera natural.
• Contener un marcador de identificación que diferencie
a las células que portan el vector recombinante de las
que no lo portan.
• Ciertos vectores presentan vectores de expresión, es
decir, un promotor que posibilita la transcripción del
inserto y su posterior traducción a proteínas.
 Tipos de vectores
Los vectores se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los
elementos que lo integran y el tamaño del fragmento de ADN extraño que puede
incorporar. Entre los más usados se encuentran:

• Plásmidos. Tienen origen bacteriano con capacidad autónoma

de replicación. Moléculas de ADN bicatenario extracromosómico.
• Bacteriófagos. Son virus que infectan a las bacterias en las cuales
desarrollan un ciclo lítico que culmina con la muerte y lisis
celular. Algunos fagos sólo insertan su material genético en el
cromosoma bacteriano durante un periodo de tiempo. Es lo que
se denomina ciclo lisogénico.
• Cósmidos. Vectores híbridos con: secuencia cos del cromosoma
del fago λ, el origen de replicación de un plásmido bacteriano,
gen de resistencia a antibióticos y un polylinker.
• Flagémidos. Vectores híbridos con un plásmido con el origen de
replicación del fago M13.
• Cromosomas artificiales. Vectores de alta capacidad que
transportan fragmentos de gran tamaño. Usados para la
reconstrucción de genotecas genómicas.
 Células hospedadoras
Son aquellas en las que se introduce el
vector de clonación para su
simplificación mediante replicación.
• La célula hospedadora se multiplica en cultivo
adecuado dando lugar a múltiples células hijas con la
misma carga genética. Es decir, clones.
• Elegiremos a la célula hospedadora según el vector de
clonación empleado así como de la finalidad
perseguida, de manera que, en muchos casos, se habla
de sistema vector/hospedador.
• Los hospedadores pueden ser:
• Células bacterianas. Son fáciles de usar, muy
versátiles y crecen rápidamente, por lo que se
utilizan para clonar plásmidos, fagos y cósmidos.
La más usada es E. coli, la cepa K12.
• Células hospedadoras eucariotas. Levaduras
como Saccharomyces cereviciae, células
vegetales y células animales de insectos o
mamíferos, estos últimos utilizados para la
obtención de organismos transgénicos.
Fases del proceso de clonación
• Fase I. Creación de un vector recombinante. Una ligasa une el DNA que se va a
clonar con el vector recombinante que contiene el DNA extraño, puesto que los extremos de ambas
moléculas son complementarios. El DNA extraño y el vector de clonación se unen en condiciones adecuadas
a través de los extremos complementarios gracias a una DNA ligasa en una reacción llamada ligación.
• Fase II. Introducción del vector recombinante en la célula
hospedadora. Se hace mediante varios métodos:
• Transformación bacteriana para aquellas bacterias competentes.
• Trasfección. Similar a la anterior pero utilizando células eucaiotas.
• Transducción. Se utiliza un virus para insertar el material genético extraño en la célula.
• Electroporación. Se aplican pulsos cortos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores
recombinantes en solución.

• Fase III: Selección e identificación de los clones que portan la

secuencia de interés. Debemos identificar las células transformadas, es decir, los clones
recombinantes que portan el vector específico, de aquéllas no transformadas y las que portan un vector no
recombinante o alguna molécula de ADN no deseada producida durante la ligación.
 • Para seleccionar e identificar los clones
recombinantes que portan el vector
recombinante específico utilizaremos los
marcadores genéticos que porta el
vector:

• Genes de resistencia a antibióticos

como la ampicilina y la tetraciclina.
• Estrategia cromogénica. Combina
bacterias hospedadoras lac –
sensibles al antibiótico que porta el
vector con vectores con un gen de
resistencia al antibiótico y el gen
LacZα con un polylinker en su
interior.
• Proteínas fluorescentes. Utiliza
vectores con un gen de resistencia
y otro gen que codifica una
proteína fluorescente para la
Cómo diferenciar las células identificación que se desactiva con
el inserto.
transformadas de las no • Genes letales. Utiliza vectores con
un gen de resistencia a un
antibiótico y otro gen que codifica
transformadas. una proteína letal para las
bacterias.
 • Las librerías de ADN son colecciones de vectores recombinantes clonados cuyas
secuencias de DNA se han obtenido de un único organismo.
• Pueden ser de tres tipos dependiendo del origen del DNA clonado:
Bibliotecas a) Bibliotecas genómicas. Colecciones de vectores recombinantes clonados que
incluyen el genoma completo de un organismo. Se utilizan vectores de alta
de ADN capacidad en fagos y cósmidos.
b) Bibliotecas cromosómicas. Se fabrican a partir de un único cromosoma
aislado de células que estaban en metafase del ciclo celular.
c) Bibliotecas de ADNc. El DNA complementario se obtiene a partir del ARNm
de una población celular determinada. Cada clon porta un gen completo
pero su secuencia difiere de la secuencia genómica original puesto que no
tiene intrones.
Análisis de una biblioteca de DNA
Cuando acaba la clonación se obtiene una colección que contiene miles de
clones en forma de colonias bacterianas o fagos recombinantes, entre otros,
que deben ser analizados. Para ello utilizamos tres métodos:
• Para la dentificación del clon o clones con una secuencia concreta
utilizaremos las técnicas de hibridación.
• El paseo cromosómico o identificación de clones que porten secuencias
consecutivas. Se utilizan bibliotecas obtenidas mediante digestión parcial
del DNA de partida con una enzima de restricción que produce fragmentos
con regiones solapantes.
• La secuenciación. El análisis de un clon que nos permite descifrar la
secuencia del DNA insertado que porta el vector recombinante.
Aplicaciones de la clonación
molecular
• Nos permite obtener cantidades ilimitadas de cualquier gen
o secuencia de interés.
• Posibilita que esos genes de interés se expresen integrados
en el genoma de un organismo.
En investigación básica nos permite descifrar las secuencia
génicas completas de cualquier organismo para estudios
filogenéticos, por ejemplo.
En investigación aplicada la clonación en vectores de
expresión posibilita la producción a nivel industrial de
proteínas recombinantes por ejemplo la insulina, las vacunas,
microorganismos capaces de metabolizar el petróleo, etc.
También, en la agricultura, la inserción de genes en el genoma
de células animales y vegetales con caracteres de interés
como la resistencia a enfermedades o productos tóxicos.
Aplicaciones de la
clonación en medicina
• Creación de ratones transgénicos. Es decir,
ratones con DNA modificado para el
estudio de enfermedades genéticas ya sea
para comprender el desarrollo de la
enfermedad o para estudiar el tratamiento
de dicha enfermedad.
• La terapia génica. Consiste en transferir
genes normales a células somáticas, es
decir las que no intervienen en la
reproducción (óvulos y espermatozoides),
con el fin de corregir una enfermedad. Con
esto se consigue que las células tratadas
sinteticen el producto necesario para tratar
la enfermedad evitando el tratamiento
farmacológico de por vida.