TRABAJO FIN DE GRADO

Búsqueda de agentes biorremediadores

de hidrocarburos: el género
Rhodococcus

Autora: Inés Castillo Rodríguez Grado en Biotecnología

Tutores: José Joaquín Moreno Casco Facultad de Ciencias Experimentales

Macarena del Mar Jurado Rodríguez Área de Microbiología

Universidad de Almería Departamento de Biología y Geología

Curso 2019/2020

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AGRADECIMIENTOS

“No estoy aceptando las cosas que no puedo cambiar, estoy cambiando las cosas
que no puedo aceptar” – Angela Davis.

Me gustaría comenzar agradeciendo a mi profesor y tutor de 2º de bachillerato, Guillermo, su

recomendación de buscar otras alternativas al Grado que yo quería hacer por aquel entonces, Biología.
De haber sido de otra forma, no estaría aquí escribiendo esto, puesto que así fue como encontré la
existencia del Grado en Biotecnología, algo desconocido casi por completo para mí. Comencé esta
nueva etapa con bastantes dudas, las cuales se multiplicaron cuando se acercaron los primeros
exámenes; me veía incapaz de poder superarlos. Sin embargo, éstos y todos los demás pasaron, y cada
vez que terminaba un cuatrimestre pensaba lo mismo “tampoco fue para tanto”. Y hoy no podría estar
más contenta y agradecida por haber tomado este camino, durante estos 4 años he conocido a
personas maravillosas y he aprendido infinidad de cosas.

Gran parte de lo aprendido durante estos años se lo debo a Joaquín. Desde el primer momento
puso todo su esfuerzo y dedicación en cada uno de nosotros y nosotras y gracias a la pasión y el
entusiasmo con la que comenzaba cada clase, hizo que a mí también me fascinase el mundo de la
microbiología y, durante el último curso, la biotecnología ambiental. Joaquín ha sido como un padre
durante estos años, al que sentía que no podía defraudar de ninguna de las formas. Gracias de corazón
por confiar en mí y recibirme siempre con los brazos abiertos y darme la oportunidad de realizar este
TFG contigo.

Una de las personas a la que más admiro es a Macarena, siempre ha tenido una paciencia
increíble para solucionar todas mis dudas y ha confiado en mí y en mis capacidades, mucho más de lo
que lo he hecho yo. Me ha enseñado que sí que es posible hacer las cosas de otra forma y a reforzar
mi ánimo, a no conformarme con lo que hay. Gracias por tus correcciones, ayuda en el laboratorio y
tus enseñanzas. También agradecer a Paqui y a Juan su ayuda en el laboratorio y su brillante labor
como profesores, junto con Joaquín y Macarena. Sin duda alguna, las prácticas que más me han
entusiasmado han sido las realizadas con vuestro departamento, gracias a la dedicación con la que las
hacíais; han sido indispensables para desarrollar la parte experimental de este TFG. Gracias también a
todo el departamento de Microbiología, por estar ahí ante cualquier duda y crear un ambiente de
trabajo tan acogedor.

Sin el apoyo de mis amigas y amigos, esto tampoco habría sido posible. Cada vez que me
desanimaba, allí estaban para animarme y escucharme y conseguían, casi inexplicablemente, que
recuperase esos ánimos perdidos.

Por último, agradecer el apoyo de mi familia que, aunque todavía no tenga muy claro qué es lo
que estoy haciendo, se interesa por lo que hago y se ilusiona tanto, o incluso más que yo, con todos
mis logros.

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ÍNDICE
RESUMEN ................................................................................................................................................ 1
ABSTRACT................................................................................................................................................ 2
1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................................... 3
1.1. Derivados de petróleo: contaminación e impacto ambiental ......................................... 3

1.2. Métodos de control y eliminación basados en estrategias biotecnológicas ................... 5

1.3. El género Rhodococcus como agente con potencial biorremediador ............................. 9

1.4. Objetivos .......................................................................................................................... 12

2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................. 13

2.1. Diseño experimental ....................................................................................................... 13

2.2. Colección de cepas del género Rhodococcus .................................................................. 14

2.3. Ensayos de toxicidad de los compuestos BTX ................................................................ 15

2.4. Crecimiento de microorganismos en medios líquidos adicionados con BTX ................ 17

2.5. Análisis estadístico .......................................................................................................... 19

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................... 20

3.1. Efecto tóxico de hidrocarburos aromáticos (BTX) sobre cepas pertenecientes al género
Rhodococcus ........................................................................................................................... 20

3.1.1. Estudio de la toxicidad sobre medio sólido ....................................................................... 20

3.1.2. Estudio de la toxicidad sobre compuestos volátiles ......................................................... 22
................................................................................................................................................. 27

3.2. Utilización de compuestos BTX como fuente de carbono y energía en medio líquido. 27

4. CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 33
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................................... 34

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RESUMEN

Desde el origen de la industria petrolera, a principios del siglo XX, se ha venido haciendo una
mala gestión de sus residuos que ha derivado en casos tan graves como el vertido de petróleo de
Deepwater Horizon en el Golfo de México, considerado el más importante de la historia. Es por ello
por lo que será de especial importancia encontrar una solución para biorremediar los ambientes
contaminados con petróleo mientras se desarrollan alternativas más respetuosas con el
medioambiente que vayan sustituyendo el uso masivo que se hace de estos compuestos
contaminantes.

El objetivo de este trabajo fue buscar cepas del género Rhodococcus capaces de degradar
algunos de los principales componentes del petróleo: benceno, tolueno y xileno, comúnmente
conocidos con las siglas BTX. A partir de una colección de 16 cepas se analizó primero la toxicidad de
los hidrocarburos tanto en medio sólido como sobre su condición de compuestos volátiles. Las cepas
que soportaron este ambiente tóxico pasaron a la siguiente etapa en la cual se hizo un análisis
cualitativo y cuantitativo de la capacidad de degradación de las distintas cepas seleccionadas en
medios líquidos adicionados con BTX, para estudiar su metabolismo y cometabolismo. Se elaboraron
curvas de crecimiento a partir de este experimento. Finalmente se comprobó la presencia de genes
relacionados con la degradación de hidrocarburos en base a las identidades de las cepas más
prometedoras.

La colección de Rhodococcus fue, en general, tolerante a los compuestos BTX, sobre todo al
encontrarse éstos incorporados a los medios de cultivo, ya que la volatilidad del benceno sí resultó en
una mayor inhibición del crecimiento microbiano. Las cepas más prometedoras para su selección como
potenciales agentes biodescontaminantes de compuestos derivados del petróleo fueron 578
(Rhodococcus pyridinivorans) y 722 (Rhodococcus indicum) que no sólo soportaron la toxicidad emitida
por los hidrocarburos estudiados (BTX), sino que además fueron capaces de utilizarlos como fuentes
de carbono y energía.

Palabras clave: Biorremediación, benceno, tolueno, xileno, Rhodococcus pyridinivorans, Rhodococcus

indicum.

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ABSTRACT

Since the origin of the oil industry, in the early twentieth century, the mismanagement of its
waste has resulted in serious disasters as the Deepwater Horizon oil spill in the Gulf of Mexico,
considered the most important in history. That is why it will be particularly important to find a solution
to bioremediate oil-contaminated environments while developing more environmentally friendly
alternatives that replace the massive use of these polluting compounds.

The objective of this work was to search for strains of the genus Rhodococcus capable of
degrading some of the main components of petroleum: benzene, toluene and xylene, commonly
known as BTX. From a collection of 16 strains, the toxicity of hydrocarbons was first analysed in both
solid medium and volatile state. The strains that supported these toxic conditions were moved on to
the next stage in which a qualitative and quantitative analysis of the degradation capacity of the
different selected strains in liquid media added with BTX was made, to study their metabolism and
cometabolism. Growth curves were developed from this experiment. Finally, the presence of genes
related to hydrocarbon degradation was found based on the identities of the most promising strains.

The Rhodococcus collection was generally tolerant to BTX compounds, especially as they were
incorporated into the culture media, since the volatility of benzene did result in a greater inhibition of
microbial growth. The most promising strains for selection as potential biodecontaminant agents of
petroleum-derived compounds were 578 (Rhodococcus pyridinivorans) and 722 (Rhodococcus
indicum) which not only supported the toxicity emitted by the hydrocarbons studied (BTX), but were
also able to use them as sources of carbon and energy.

Keywords: Bioremediation, benzene, toluene, xylene, Rhodococcus pyridinivorans, Rhodococcus

indicum.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. Derivados de petróleo: contaminación e impacto ambiental

El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos y otros compuestos orgánicos, incluyendo

algunos constituyentes organometálicos, mayoritariamente complejos de vanadio y níquel (Van
Hamme et al., 2003). Tras el procesado del petróleo crudo, se obtienen diferentes fracciones (gasolina,
queroseno, nafta, gasóleo, fuelóleo, aceites pesados, parafinas y asfaltos, etc.) que tienen una extensa
cobertura de mercado a nivel global. De hecho, en 2018, la demanda de barriles ascendía a 99,3
millones de barriles por día (Sevilla, 2019). Es indudable el impacto de este producto, tanto
indirectamente, derivado de su consumo indiscriminado y debido a la mala gestión de los residuos
generados a partir de él, como directamente, principalmente por vertidos y derrames. En cualquier
caso, el daño que cause el petróleo dependerá del tipo de ecosistema donde sea detectado.

El principal problema asociado a la contaminación por vertidos de petróleo crudo en los

ecosistemas terrestres es el enorme impacto negativo que genera en las primeras fases de la
producción alimentaria. Por un lado, afecta a la germinación y el crecimiento de algunas plantas e
incluso a la fertilidad, aunque esto último dependerá de la cantidad y el tipo de contaminante. Por otro
lado, el petróleo varía parámetros del suelo como el contenido en minerales y en materia orgánica, la
capacidad de intercambio de iones, las propiedades redox y el valor de pH. Éste también crea unas
condiciones anaerobias en el suelo que derivarán en una alta acumulación de aluminio e iones de
magnesio que pueden ser tóxicos para el crecimiento de las plantas y para el desarrollo y la diversidad
de los microorganismos del entorno (Onwurah et al., 2007).

Sin embargo, el ecosistema más vulnerable es el marino. Se estima que, aproximadamente, 3,8
miles de millones de litros de petróleo entran en los océanos cada año por acción antropogénica. Sólo
el 8% se cree que deriva de fuentes naturales como la rotura de trampas petrolíferas (se trata de rocas
impermeables que impiden el ascenso de los hidrocarburos menos densos) y al menos el 22% se libera
debido a cargas operacionales que se realizan de forma rutinaria, el 12% entra por derrames
accidentales de petroleros y el 36% por escorrentía y residuos municipales e industriales (Suchanek,
1993).

Cuando el petróleo crudo se derrama en el mar, éste forma una superficie aceitosa cuyos
componentes pueden seguir diferentes vías. Algunas de estas sustancias pueden llegar a persistir
durante un periodo largo de tiempo en el mar antes de ser degradadas por los microorganismos allí
presentes. Su naturaleza oleosa en agua causa una disminución del oxígeno disuelto debido a la
transformación de los componentes orgánicos en inorgánicos, lo que se traduce en una pérdida de
biodiversidad, principalmente de anfípodos que son sumamente importantes en la cadena trófica y
como bioindicadores de eutrofización (Onwurah et al., 2007).

No se puede olvidar que existe una estrecha relación entre la salud ambiental y la de las
personas. Algunas enfermedades son consecuencia de la contaminación por petróleo, ya sea por el
consumo de agua o alimentos contaminados o por emisiones y vapores de petróleo. Los hidrocarburos
del petróleo pueden afectar a la integridad genética de muchos organismo, resultando en
carcinogénesis, mutagénesis y deterioro de la capacidad reproductiva, sin embargo, éstos no son los

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únicos posibles efectos, destacando también la inhibición de la síntesis de proteínas, daños en la
membrana plasmática, interrupción en el sistema de transporte de membrana, oxidación de lípidos y
proteínas, agravamiento de afecciones respiratorias como el asma, bronquitis y envejecimiento
acelerado de los pulmones, etc. (Onwurah et al., 2007).

Un ejemplo de vertido de petróleo en el ecosistema marino es el que se produjo en Prince

William Sound, Alaska, por el buque petrolero Exxon Valdez. El 24 de marzo de 1989 se derramaron 42
millones de litros de petróleo crudo que contaminaron al menos 1990 km de costa produciendo daños
en el ecosistema cuyas consecuencias hoy en día aún se siguen estudiando (Figura 1). El petróleo
permaneció después de una década en enormes cantidades de formas tóxicas que estaban
suficientemente biodisponibles para inducir exposiciones biológicas crónicas, lo cual tuvo un enorme
impacto sobre la población a largo plazo (Peterson et al., 2003). La conclusión a la que llegaron los
expertos tras estudiar el área afectada fue que las prácticas de actuación utilizadas fueron insuficientes
y que se necesita el desarrollo de nuevas técnicas que permitan una descontaminación más eficaz.
Podría pensarse que se han producido cambios sustanciales desde 1989 para evitar estos desastres,
pero desafortunadamente no ha sido así. El 29 de mayo de este año tuvo lugar un vertido de 20.000
toneladas de combustible diésel al río Ambárnaya, en Norilsk, Rusia (Figura 2). Este vertido trae consigo
consecuencias devastadoras, debido a la gran toxicidad que presenta este derivado del petróleo y,
además, está afectando a una de las zonas de la reserva natural Gran ártico (Sahuquillo, 2020).

Figura 1. Ballena gris muerta encontrada por un pescador local en la costa de la isla de Latouche,
Alaska tras el desastre del petrolero Exxon Valdez. Fotografía tomada por John Gaps III/Associated
Press File (abril, 1989)

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 Figura 2. Vertido de diésel en el río Ambárnaya, en Norilsk, Rusia (mayo, 2020).

Teniendo en cuenta la complejidad de estos productos, sus residuos asociados son muy difíciles
de eliminar de ambientes contaminados. Desde que en la década de 1970 comenzaran a documentarse
los efectos de la contaminación del petróleo, así como sus consecuencias para la salud del planeta en
general, no se ha dejado de avanzar, en primer lugar, en el control de los potenciales vertidos y, en
segundo lugar, una vez fracasado ese punto relativo a las medidas de prevención, en las operaciones
más adecuadas para su limpieza y, por tanto, descontaminación de ambientes contaminados. Hoy en
día, éste continúa siendo un tema preocupante en el mundo entero (Onwurah et al., 2007).

1.2. Métodos de control y eliminación basados en estrategias biotecnológicas

La mayoría de los hidrocarburos de petróleo son biodegradables, pero algunos son recalcitrantes
o tienen una biodegradabilidad media, dependiendo de su estructura química, los derivados
aromáticos clorados y nitrados, por ejemplo, presentan una mayor resistencia a la biodegradación; y
de su estado físico, los compuestos volátiles, por ejemplo, están menos biodisponibles que los
disueltos en agua (Tyagi et al., 2011). Normalmente, la biodegradabilidad de los componentes del
petróleo disminuye en este orden: n-alcanos > alcanos de cadena ramificados > alcanos ramificados >
n-alquilo aromáticos de bajo peso molecular > monoaromáticos > cicloalcanos > aromáticos
polinucleares > asfaltenos (Van Hamme et al., 2003). Esto nos permite comprender la dificultad que
presentan estos compuestos para ser gestionados y la importancia de encontrar métodos eficaces para
su control y eliminación.

Las técnicas tradicionalmente utilizadas para la remediación consistían en desenterrar el suelo

contaminado y llevarlo a un vertedero, o tapar y contener el área contaminada. Sin embargo, estos
métodos tienen inconvenientes. En el primero, existen riesgos en la excavación, manejo y transporte

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del material peligroso, además de que es muy complicado y caro encontrar nuevos vertederos. El
segundo, es sólo una solución provisional ya que la contaminación permanece en el sitio y requiere
monitoreo y mantenimiento de las barreras de aislamiento, con todos los costes asociados y la
responsabilidad que supone (Vidali, 2001).

Otras técnicas utilizadas con mejores resultados han sido la incineración a altas temperaturas y
varios tipos de descomposición química como, por ejemplo, la descloración catalizada por bases o la
oxidación por radiación ultravioleta (UV). Aunque han sido muy eficientes a la hora de reducir ciertos
niveles de contaminantes, presentan varios inconvenientes, principalmente la complejidad
tecnológica, el alto coste de su aplicación a pequeña escala y la falta de aceptación pública,
especialmente debido a que la incineración puede incrementar la exposición de contaminantes a la
población cercana (Vidali, 2001).

Como alternativa, han surgido una batería de métodos basados en biotecnología, por ejemplo,
la biorremediación. Ésta consiste en la aplicación de sistemas biológicos para eliminar tanto
contaminantes orgánicos como inorgánicos, siendo los microorganismos los organismos más
ampliamente utilizados para ello (Gadd, 2010). Este método tiene un coste asumible y utiliza una baja
tecnología, por lo que tiene una alta aceptación pública (Vidali, 2001).

Existen dos estrategias para aplicar las técnicas de biorremediación en función del lugar en el
que se lleven a cabo: ex situ, lo cual exige el traslado del material contaminado; e in situ, cuando el
tratamiento se lleva a cabo en el propio ambiente contaminado. Algunos ejemplos de técnicas de
biorremediación in situ y ex situ son (Boopath, 2000):

• Laboreo de tierra o landfarming. Sistema de tratamiento en fase sólida para eliminar

contaminantes del suelo. Puede realizarse tanto in situ como ex situ.
• Compostaje. Consiste en la mezcla del suelo contaminado con enmiendas orgánicas, ya que la
adecuación del proceso requiere el ajuste de distintos parámetros como la relación
Carbono/Nitrógeno o la densidad aparente, con el objetivo de alcanzar una biodegradación
aeróbica y temperaturas termófilas que contribuyan a la higienización y transformación de la
materia prima compostada. Habitualmente se lleva a cabo ex situ, aunque en determinadas
circunstancias puede realizarse in situ (Martínez-Gallardo et al., 2020).
• Biorreactores. Biodegradación en un contenedor o reactor; pueden usarse para tratar líquidos
o lodos. Se utiliza ex situ.
• Bioventilación o bioventeo. Consiste en la inyección de oxígeno en el suelo para estimular la
actividad microbiana. Se utiliza in situ.
• Biofiltros. Uso de columnas de separación microbianas para tratar las emisiones de aire. Se
utiliza principalmente ex situ.
• Bioaumentación. Adición de cultivos microbianos, adecuadamente caracterizados como
biodegradantes, a un sitio contaminado para favorecer su biodescontaminación. Se utiliza en
sistemas in situ y ex situ.
• Bioestimulación. Estimulación de las poblaciones microbianas autóctonas mediante la
adicción de los nutrientes necesarios. Se utiliza en sistemas in situ y ex situ.

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 Otro método de eliminación de contaminantes es la fitorremediación, que consiste en el uso de
plantas in situ para eliminar contaminantes o hacerlos inofensivos de suelos o sedimentos. Se trata de
una tecnología emergente que promete grandes resultados. La fitorremediación se suele utilizar en
sitios en donde la contaminación es superficial (<5 m de profundidad) y los contaminantes son:
moderadamente hidrofóbicos como los compuestos BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno),
solventes clorados, desechos de municiones de nitrotolueno o excesos de nutrientes (nitrato, amonio
o fosfato). Esta estrategia podría aplicarse en derrames petroquímicos y de combustibles, así como en
áreas de almacenamiento contaminadas. Normalmente, se suele utilizar en combinación con otras
técnicas de biorremediación (Salt et al., 1998; Schnoor et al., 1995).

La mayoría de los constituyentes del petróleo crudo son biodegradables, por lo que se ha
demostrado que la biorremediación es más efectiva y barata que otras técnicas. Posiblemente, la
biodegradación por poblaciones nativas de microorganismos sea la forma más eficaz de eliminar este
tipo de contaminantes del ambiente (Bharathi et al., 2017).

El desastre del vertido de petróleo de Deepwater Horizon en el Golfo de México (Figura 3),
producido el 20 de abril de 2010, alentó a muchos investigadores a estudiar la dinámica de las
comunidades bacterianas in situ en lugares contaminados con hidrocarburos, debido a que los estudios
previos eran escasos. Los trabajos anteriores se centraban en el estudio de los microorganismos
degradadores de hidrocarburos en condiciones de laboratorio o, en todo caso, en la eficiencia de la
bioestimulación de la microbiota presente en dichos lugares perjudicados, añadiendo, por ejemplo,
nutrientes para mejorar la biorremediación. De hecho, muchos de estos estudios se centraron en las
comunidades de bacterioplancton de las profundidades marinas (Kostka et al., 2011).

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 Figura 3. Representación del derrame de Deepwater Horizon y su limpieza (Atlas y Hazten, 2011).

En el estudio realizado por Atlas y Hazen (2011), destacaron la formación de una especie de
nube de petróleo disperso donde la densidad bacteriana era significativamente mayor (hasta 105
células/mL) respecto a fuera de ella (aproximadamente 103 células/mL). Se detectaron 951 subfamilias
de bacterias de 62 filos; las bibliotecas clonales, qPCR, fosfolípidos y arrays de genes funcionales
respaldaron el hallazgo de microorganismos degradadores de petróleo. La comunidad bacteriana
presente fue eminentemente psicrotrófica, ya que la temperatura rondaba los 2-5 °C (Atlas y Hazten,
2011).

En un estudio realizado por Shekhar et al. (2015) se aislaron de cuatro zonas contaminadas con
hidrocarburos veinte microorganismos degradadores de este tipo de compuestos que se clasificaron
como cepas de Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa. De hecho, se encontró que una alta densidad de estas bacterias se había aclimatado a la
degradación de hidrocarburos (concretamente gasolina) en el suelo. Además, estas cepas se cultivaron
en medios suplementados con benceno, tolueno, xileno y ciclohexano a 3 concentraciones diferentes
y en 3 intervalos diferentes de tiempo. Los resultados indicaron que todas poseían la capacidad de
degradar esta variedad de hidrocarburos, pero el microorganismo más eficiente fue Pseudomonas
aeruginosa.

Un claro ejemplo práctico del uso de microorganismos para la eliminación de petróleo de

ambientes contaminados es el uso de Alcanivorax borkumensis. Se trata de una bacteria marina que
utiliza los hidrocarburos del petróleo como fuente exclusiva de carbono y energía. Esta bacteria se
encuentra en bajas concentraciones en ambientes no contaminados, pero rápidamente se convierten

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en el microorganismo predominante cuando estos ambientes se contaminan con petróleo. De hecho,
puede llegar a comprender entre el 80-90% de las comunidades de microorganismos degradadores de
petróleo (Schneiker et al., 2006).

1.3. El género Rhodococcus como agente con potencial biorremediador

El género Rhodococcus está formado por especies aeróbicas, no esporulantes, Gram positivas y
actinobacterias nocardiformes no móviles que contienen ácidos micólicos en su pared celular, por lo
que es considerado parcialmente ácido alcohol resistente. Presenta un metabolismo oxidativo y buen
crecimiento en medios estándar de laboratorio, en cultivo axénico (Finnerty, 1992). Estos
microorganismos han sido aislados de distintos hábitats como suelos y agua marina. Gracias a su
elevado número de actividades enzimáticas, su pared celular única y, en definitiva, a que cuenta con
las propiedades biotecnológicas adecuadas, Rhodococcus puede utilizarse en la industria química y
farmacéutica, además de poder empleare en la remediación ambiental (Martínková et al., 2009).

Rhodococcus es capaz de degradar compuestos naturales hidrofóbicos y xenobióticos,

incluyendo policlorobifenilos (PCBs) (van der Geize y Dijkhuizen, 2004). Puede catabolizar cadenas
cortas y largas de alcanos, ácidos aromáticos (halogenados y nitro-sustituidos) y compuestos
aromáticos heterocíclicos y policíclicos. Además, sus habilidades degradativas se extienden a
compuestos de más difícil biorremediación, por ejemplo, compuestos orgánicos halogenados y
compuestos heterocíclicos como el tiocarbamato o 2-mercaptobenzotiazol (MBT), por ser
recalcitrantes y con una potente toxicidad microbiana (Larkin et al., 2005). Es por esto por lo que este
género es una opción prometedora para limpiar sitios contaminados.

Los rodococos se caracterizan por tener muchos tipos de monooxigenasas y dioxigenasas. Esta
diversidad de reacciones de oxigenación facilita la degradación de un amplio rango de contaminantes.
Una de las más importantes es la enzima citocromo P450, una mono-oxigenasa hemo-dependiente
que se ha demostrado que participa en la degradación de compuestos aromáticos sustituidos,
tiocarbamatos, atrazina y etil ter-butil éter (ETBE) (Larkin et al., 2005).

Un amplio rango de compuestos naturales y xenobióticos son catabolizados aeróbicamente por

bacterias a través de vías superiores o periféricas hasta un número limitado de intermediarios. Dentro
de las rutas periféricas, los compuestos aromáticos son modificados mediante monooxigenasas y
dioxigenasas resultando en la formación de tres intermediarios principales: catecol, protocatecuato y
gentisato (Figura 4).

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 Figura 4. Rutas periféricas de degradación de compuestos aromáticos
asociadas al género Rhodococcus. R=alquilo (Martínková et al., 2009).

Posteriormente, estos intermediarios son degradados en las rutas centrales del catabolismo
hasta proveer finalmente intermediarios del ciclo del citrato (Figura 5). La rotura del anillo del catecol
y el protocatecuato está catalizada por dioxigenasas y puede producirse entre los grupos hidroxilo
(escisión en orto) o adyacente a uno de los grupos hidroxilo (escisión en meta). La escisión en orto de
ambos intermediarios converge en una molécula de 3-oxoadipato, por lo que a esta ruta se le
denomina ruta del 3-oxoadipato (o β-cetoadipato). Las dioxigenasas del catecol, protocatecuato y
gentisato desempeñan los papeles principales en la degradación de compuestos aromáticos porque
catalizan la reacción de escisión del anillo aromático, un paso crítico y muy difícil químicamente
(Martínková et al., 2009).

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 Figura 5. Rutas centrales del catabolismo de compuestos
aromáticos en el género Rhodococcus (Martínková et al., 2009).

Esta capacidad de degradar compuestos recalcitrantes también se debe a ciertos atributos

fisiológicos que permiten a este género tolerarlos. Se ha visto que Rhodococcus puede tolerar tanto
los disolventes miscibles en agua (etanol, butanol y dimetilformamida, hasta 50% v/v), como los
disolventes inmiscibles en agua (dodecaeno, y tolueno, hasta 5% v/v). Las largas cadenas de los ácidos
micólicos presentes en la pared celular de los rodococos, al igual que sucede en los géneros
Mycobacterium, Nocardia y Croynebacterium, facilitan la entrada de sustancias hidrofóbicas a la célula.
Este potencial para metabolizar compuestos hidrofóbicos también está relacionado con la producción
de biosurfactantes, concretamente de moléculas anfipáticas que tienen la capacidad de interaccionar
con compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos a la vez y, por lo tanto, ubicarse en su interfase. La habilidad
de modular la composición de ácidos grasos de la envoltura celular junto con la capacidad de formar
biopelículas permite a estas células resistir y tolerar la presencia de muchos compuestos tóxicos.
Rhodococcus puede soportar condiciones de inanición y, en muchos casos, la degradación de
contaminantes no se ve reprimida por la presencia de otras fuentes de carbono más fácilmente
asimilables (Larkin et al., 2005; Martínková et al., 2009).

En el género Rhodococcus parecen haberse dado una serie compleja de recombinaciones que
han resultado en microorganismos con un genoma muy grande y redundante. Esto ha derivado en
genes homólogos, los cuales pueden explicar por qué muchas cepas se han adaptado a catabolizar un
gran número de sustratos. Además del cromosoma bacteriano, presenta plásmidos lineales que
almacenan múltiples copias de genes biodegradativos. El agente degradador de PCBs más efectivo,

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Rhodococcus sp. cepa RHA1, contiene 3 plásmidos lineales pRHL1 (1100 kb), pRHL2 (450 kb) y pRHL3
(330 kb) que comprenden genes bph de degradación de bifenilos/PCBs, muchos de los cuales codifican
enzimas dioxigenasa. También hay evidencia de que ciertos genes catabólicos están corregulados en
clústeres de genes separados lo que sugiere múltiples recombinaciones adaptativas (Larkin et al., 2005,
van der Geize y Dijkhuizen, 2004).

En un estudio realizado por van der Geize y Dijkhuizen (2004) se describen ejemplos en donde
se hace uso de la ingeniería genética para optimizar la biodesulfuración por Rhodococcus. Este proceso
es de especial interés para eliminar específicamente el azufre orgánico del carbón y de productos
derivados del petróleo. La hidrodesulfuración de los combustibles fósiles resulta en la formación de
compuestos cíclicos recalcitrantes como el benzotiofeno (BT), el dibenzotiopeno (DBT) y el 4,6
dimetildibenzotiofeno. Una de las cepas de Rhodococcus capaz de desulfurizar estos compuestos es R.
erythropolis KA2-5-1. Esta cepa se recombinó para que contuviera 2 copias del grupo de genes dszABC
(codifica una monooxigenasa, una desulfinasa y otra monooxigenasa, respectivamente) y una del gen
dszD (codifica una flavin reductasa) y mostró una capacidad de desulfuración DBT cuatro veces mayor
que la cepa KA2-5-1. Otros experimentos permitieron que la bacteria recombinante desulfurizara el
DBT incluso en presencia de metionina, cisteína o sulfato inorgánico (inhibidores de la
biodesulfuración) gracias a la adición de la región promotora rrn del gen ARN ribosómico 16S para
impulsar la expresión del gen dszABCD (Matsui et al. 2002).

Un ejemplo que muestra la capacidad biorremediadora de este género se observa en la cepa

Rhodococcus sp. UW1. Este microorganismo se aisló a partir de un suelo contaminado y fue capaz de
utilizar pireno como única fuente de carbono y energía. Consiguió mineralizar el 72% de este
contaminante hasta CO2 en 2 semanas y sólo el 3% del 14C se encontró en la fase orgánica; el 25% del
14
C restante estaba en la fase acuosa que correspondía con metabolitos solubles en agua y residuos
asociados a la célula. Se recuperó un metabolito de la degradación de pireno cuya fórmula molecular
es C16H10O4, lo que indica que es el resultado de la oxidación y la fisión del anillo en meta del pireno.
En este proceso participan dioxigenasas (Walter et al., 1991).

En definitiva, teniendo en cuenta todo lo mencionado anteriormente, parece evidente la

capacidad de las actinobacterias del género Rhodococcus para ser empleadas como agentes
biodescontaminantes, ya que están dotadas genéticamente y adaptadas fisiológicamente para
ejecutar la biorremediación de materiales complejos de diversa índole.

1.4. Objetivos

La historia reciente de los desastres naturales en los que se han visto involucradas las industrias
petrolíferas, así como la generación de residuos derivados del petróleo en otras actividades
comerciales, no siempre con las mejores garantías de ser gestionados y minimizados, han puesto en el
punto de mira las técnicas tradicionalmente empeladas para contener y eliminar a este tipo de
contaminantes. En este contexto, surge la necesidad de buscar alternativas sostenibles
ambientalmente y que no supongan un coste desorbitado para que su aplicación sea real y no se quede
en un mero experimento de laboratorio. En este sentido, las herramientas biotecnológicas tienen la

12
clave. Por ello, el objetivo general de este TFG consistió en la caracterización de cepas del género
Rhodococcus aisladas de un proceso de compostaje de restos lignocelulósicos, para comprobar su
potencial biotecnológico en tareas de biorremediación de hidrocarburos aromáticos (benceno,
tolueno y xileno).

Para conseguir este objetivo principal, se plantearon los siguientes objetivos específicos:

1. Comprobar la posible toxicidad de los compuestos denominado BTX (Benceno, Tolueno y

Xileno) sobre las cepas ensayar.

2. Analizar cualitativamente la capacidad de degradación de la colección de cepas.

3. Analizar cuantitativamente la capacidad de degradación de la colección de cepas.

4. Comprobar la presencia de genes relacionados con la degradación de hidrocarburos.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Diseño experimental

Para poder alcanzar los objetivos propuestos, se desarrolló un diseño experimental que constó
de las siguientes etapas (Figura 6):

Experimento I. Estudio de la posible toxicidad de los hidrocarburos sobre las cepas en cultivo puro.
Para ello se llevaron a cabo dos tipos de ensayos. El primero consistente en una siembra masiva de las
distintas cepas con ayuda de un hisopo en placas de APHA adicionadas con los compuestos Benceno
(B), Tolueno (T) y Xileno (X). En el segundo, se sembraron los microorganismos en aislamiento sobre
placa de APHA y se colocaron en recipientes cerrados junto el compuesto a ensayar, para el estudio de
toxicidad en forma volátil.

Experimento II. Análisis cualitativo y cuantitativo de la capacidad de degradación de la colección de

cepas. Las cepas que mostraron poca o ninguna toxicidad a los hidrocarburos aromáticos a ensayar se
pasaron a la siguiente fase. Para ello, con cada microorganismo se realizaron curvas de crecimiento en
medios líquidos con cada compuesto (B, T y X), para el estudio del metabolismo y cometabolismo de
las mismas.

Experimento III. Comprobación de la presencia de genes relacionados con la degradación de

hidrocarburos utilizando la herramienta bioinformática BLAST del NCBI y las identidades de las cepas.

13
 Estudio de la toxicidad de
los hidrocarburos sobre
los microorganismos Elección de las cepas más
Colección de cepas
prometedoras
• Siembra masiva
• Compuestos volátiles

Análisis de la capacidad
Búsqueda de los genes
de degradación de los
responsables de la degradación
compuestos BTX por las
de los contaminantes mediante
cepas seleccionadas
BLAST
• Curvas de crecimiento

Figura 6. Esquema general del diseño experimental

2.2. Colección de cepas del género Rhodococcus

Las 16 cepas del género Rhodococcus utilizadas, previamente aisladas de un proceso de

compostaje de restos lignocelulósicos, forman parte de una colección de trabajo del grupo de
investigación BIO-175 de la Universidad de Almería y fueron las siguientes:

Tabla 1. Colección de cepas estudiadas, pertenecientes al género Rhodococcus.

Código Identidad % Identidad (BLAST) Número de Acceso (BLAST)

1 410 Rhodococcus rhodochrous 99 AB562467.1
2 487 Rhodococcus rhodochrous 99 JQ040005.1
3 494 Rhodococcus rhodochrous 99 AB562467.1
4 517 Rhodococcus phenolicus 99 AB562489.1
5 578 Rhodococcus pyridinivorans 98 JQ229777.1
6 656 Rhodococcus ruber 99 JX979148.1
7 661 Rhodococcus phenolicus 99 AB562489.1
8 671 Rhodococcus coprophilus 98 KF410348.1
9 702 Rhodococcus indicum 99 JQ889713.1
10 722 Rhodococcus indicum 99 JQ889713.1
11 801 Rhodococcus indicum 99 JQ889713.1
12 1031 Rhodococcus phenolicus 98 AB562489.1
13 2535 Rhodococcus rhodochrous 98 AB562467.1
14 2576 Rhodococcus pyridinivorans 99 KF953541.1
15 2724 Rhodococcus pyridinivorans 99 KF975435.1
16 2794 Rhodococcus gordoniae 98 EU741104.1

14
2.3. Ensayos de toxicidad de los compuestos BTX

Durante el periodo de tiempo en el que se llevaron a cabo los experimentos, la colección de

cepas se conservó en cámara fría en tubos de agar inclinado o agar slant con el medio general APHA
(Panreac). En todos los casos, se utilizaron las colonias aisladas provenientes de un aislamiento en
placa de Petri de las cepas como preinóculo.

Para realizar el ensayo inicial, primero se prepararon los medios selectivos. Para ello, en un
matraz de Erlenmeyer de un litro se vertieron 990 mL de APHA y 5 mL de Tween 80 (Panreac), el cual
se utilizó para que el hidrocarburo se dispersara de manera homogénea en el medio. También se
preparó 1 L de APHA para utilizarlo como control. Posteriormente, el contenido se esterilizó en
autoclave mediante un programa de 20 minutos a 121 °C (Paso 1, Figura 8), en todos los casos en los
que se utilizó el autoclave se emplearon estas condiciones. Una vez enfriado el medio lo suficiente, se
procedió a añadir 5 mL de benceno (Merck), xileno (RPL-UCB, Bélgica) o tolueno (Merck) (Figura 7) con
ayuda de un filtro estéril para materiales orgánicos de nitrato de celulosa de 0,22 μm de poro (Sartorius
Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Alemania) y una jeringuilla (Paso 2, Figura 8). Este es el método por
el que se incorporaron los compuestos BTX en todos los ensayos y siempre en condiciones de asepsia,
en el entorno de la llama, pero teniendo cuidado de no acercarlos demasiado porque son inflamables.
Los compuestos BTX, al ser compuestos volátiles y tóxicos, tuvieron que extraerse de su frasco en una
campana de extracción de gases. Es importante comprender que no se pueden incorporar los
compuestos BTX antes de autoclavar el material porque son compuestos volátiles. Finalmente, el
medio se vertió en placas de Petri y se dejó solidificar.

Figura 7. Estructura de los compuestos BTX.

15
 Por otro lado, se preparó caldo nutritivo (CN) (Panreac) en tubos cortos de 5 mL, los cuales se
colocaron en una gradilla, perfectamente cerrados con tapón de algodón hidrófobo, y se autoclavaron
(Paso 3, Figura 8). Enfriados los tubos, se inocularon cada uno con una cepa distinta de la colección y
se mantuvieron en incubación durante 72 h a 30 °C (Paso 4, Figura 8). La razón para dicho tiempo de
incubación, más largo que en el caso de bacterias, es porque los Rhodococcus son actinomicetos (o
actinobacterias) y estos tardan más en crecer. Para realizar la siembra masiva sobre la superficie del
medio en placa, se humedeció el hisopo en el caldo nutritivo (CN) sembrado con el preinóculo y se
hicieron estrías muy juntas sobre la placa. La finalidad de este tipo de siembra es que toda la superficie
de la placa quede cubierta por el microorganismo, por lo que las estrías, además de realizarse muy
juntas, se hicieron en tres direcciones (horizontal, vertical y transversal) (Paso 5, Figura 8). Para cada
cepa se sembraron 4 placas: APHA (control), APHA + benceno, APHA + tolueno y APHA + xileno.
Finalmente, las placas se mantuvieron en incubación durante 72 h a 30 °C. La lectura de las placas se
hizo asignando un número del 0 al 2 según el crecimiento: crecimiento igual o superior que el control
(2), crecimiento menor que en placas control (1) y ausencia de crecimiento (0).

Figura 8. Esquema del ensayo de toxicidad: siembra masiva

16
 Para realizar el segundo ensayo, se llevaron a cabo siembras en estrías en una misma placa de
Petri con APHA 2 cepas distintas, cada una en una mitad de la placa y realizando dos repeticiones de
cada cepa (Paso 1, Figura 9). A su vez, con este diseño se hicieron dos réplicas en dos placas de APHA
distintas, una se utilizó como control, manteniéndose fuera del ambiente tóxico, y la otro se introdujo
en un recipiente estéril para ensayos de compuestos volátiles junto con 10 mL del compuesto a ensayar
(B, X o T) en un vaso de precipitado (Paso 2, Figura 9). Ambos conjuntos de placas se mantuvieron en
incubación durante 72 h a 30 °C (Paso 3, Figura 9). Igual que en el ensayo anterior, la lectura se hizo
asignando un número del 0 al 2 según el crecimiento.

Figura 9. Esquema del ensayo de toxicidad: compuestos volátiles.

2.4. Crecimiento de microorganismos en medios líquidos adicionados con BTX

Para el ensayo de las curvas de crecimiento en medios líquidos selectivos primero se prepararon
dos frascos ISO de 250 mL en los que se añadieron 1,25 mL de Tween 80, y 172,5 mL de agua destilada.
A uno de ellos, además, se le incorporó 2,5 g de glucosa. Por otro lado, se prepararon 200 mL de caldo
nutritivo (CN) el cual sirvió como control. Una vez ambos frascos ISO estuvieron listos, al igual que el
matraz con el caldo nutritivo, se procedió a su autoclavado (Paso 1, Figura 10). Cuando se enfriaron,
se procedió a incorporar 1,25 mL del hidrocarburo correspondiente (B, T o X) con ayuda de un filtro y
una jeringuilla y 25 mL de cada una de las sales de Jankshekar (JA, JB y JC) (Janshekar et al., 1982)
(Tabla 2), todo en condiciones de esterilidad. Las sales se incorporaron en el frasco ISO con una probeta
de 25 mL previamente esterilizada en autoclave (Paso 2, Figura 10).

17
 Tabla 2. Preparación de los medios de cultivo para el análisis cuantitativo y cualitativo de la
capacidad de degradación de los compuestos BTX por las bacterias de la colección.

Componentes Cantidad
Compuesto a ensayar (BTX) 1,25 mL
Tween 80 1,25 mL
Glucosa 2,5 g
Sales de Janshekar (JA, JB, JC) 25 mL de cada una
Agua destilada 172,5 mL

A la vez que se prepararon los medios líquidos, se esterilizaron 12 frascos ISO de 100 mL (3 para
cada bacteria) y se prepararon placas de Petri con medio sólido general (APHA). También se preparó
solución salina estéril (NaCl al 0,9% p/v) en tubos eppendorfs de 1,5 mL, para poder realizar las
diluciones decimales seriadas.

Finalmente, se obtuvieron tres medios líquidos distintos: caldo nutritivo (CN), medio sólo con el
hidrocarburo (B, T o X) y medio con el hidrocarburo más la glucosa (B, T o X + G). Se vertieron 25 mL
de cada medio en los frascos ISO de 100 mL esterilizados anteriormente para tener 4 réplicas por
medio, uno para cada una de las bacterias a ensayar.

Cada ensayo de metabolismo y cometabolismo tuvo una duración de 5 días. El primer día se
llevó a cabo la inoculación de los frascos ISO con las cepas (Paso 3, Figura 10) y las diluciones decimales
seriadas para conocer el número de bacterias viables con las que se comenzó el experimento (Paso 4,
Figura 10). Los tubos eppendorf se llenaron previamente con 0,9 mL de la solución salina estéril (NaCl
al 0,9% p/v) y con ayuda de una micropipeta se añadió en uno de ellos 0,1 mL de uno de los frascos
ISO para obtener la primera dilución (10-1) y así sucesivamente, tomando volumen del anterior al
siguiente, para obtener diluciones hasta 10-6. De la dilución 10-3 hasta 10-6 con ayuda de bolitas de
vidrio estériles se sembraron alícuotas de 0,1 mL en placas de Petri con medio APHA (Paso 5, Figura
10). Finalmente, se guardaron las placas durante 72 h a 30 °C y los 12 frascos ISO se mantuvieron en
agitación a 30 °C hasta el día siguiente (Paso 6, Figura 10). Esto se realizó durante 5 días consecutivos.

Una vez crecidas las colonias, se procedió a su recuento y los resultados se expresaron en
unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL), según la siguiente fórmula:

𝑈𝐹𝐶 𝑛º 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∙ 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑎

=
𝑚𝐿 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜

18
 Figura 10. Esquema del diseño experimental para determinar la capacidad de degradación de los
compuestos BTX por las 4 cepas seleccionadas de la colección.

2.5. Análisis estadístico

Todos los datos y los resultados fueron procesados y obtenidos mediante el programa Microsoft
Office Excel 2010 para Windows. También se hizo uso del programa Statgraphics Centurion 18 para
realizar un Análisis Factorial de Varianza (ANOVA) y comprobar las diferencias significativas entre las
medias mediante el Test de Mínima Diferencia de Fisher (LSD), utilizando un intervalo de confianza del
95% (p<0,05). Asimismo, se usó dicho programa para el graficado de un análisis de factores y otro de
conglomerados a partir de los parámetros estudiados en el apartado 3.1., y un análisis de componentes
principales con los parámetros relativos al apartado 3.2.

19
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Efecto tóxico de hidrocarburos aromáticos (BTX) sobre cepas pertenecientes al género
Rhodococcus

Antes de realizar los ensayos pertinentes para comprobar la capacidad de las cepas de la
colección para degradar alguno (sino todos) los compuestos BTX, fue necesario estudiar la posible
toxicidad de dichos compuestos sobre las actinobacterias. Si alguno de estos hidrocarburos resulta
tóxico para las bacterias, será prácticamente imposible que tengan la capacidad de utilizarlos como
fuentes de carbono y energía. Por lo tanto, lo primero que se realizó fue un estudio de toxicidad, el
cual se evaluó de dos formas distintas, la primera mediante la adición de estos compuestos en un
medio sólido general (APHA) y la segunda, sometiendo a las diferentes cepas a un ambiente
contaminado con estas sustancias. En todos los casos se estudió el comportamiento de los
microorganismos respecto a cada compuesto de manera independiente, sin mezclarlos, con el objetivo
de caracterizar las cepas en función de cada contaminante individualmente. A continuación, se
muestran los resultados obtenidos a partir de estos experimentos.

3.1.1. Estudio de la toxicidad sobre medio sólido

Para cada cepa, de un total de 16, se obtuvieron 4 resultados: uno para APHA, otro para APHA
+ Tolueno, otro para APHA + Xileno y finalmente otro para APHA + Benceno. Estos resultados se
recogen en la Tabla 3. Se asignaron números del 0 al 2 para cuantificar el crecimiento de las cepas: 2
si el crecimiento es igual o mayor que el control, 1 si éste es menor que el control y 0 si hay ausencia
de crecimiento. También se hizo uso de valores intermedios, 1,5 (el crecimiento era considerable, pero
algo menor que en APHA) y 0,5 (había crecimiento, pero era muy escaso), para designar algunos de los
resultados.

Tabla 3. Datos obtenidos del análisis de la toxicidad de los compuestos BTX en medios sólidos sobre
las cepas de Rhodococcus.

Id General APHA A+T A+X A+B

410 2 1 1,5 2
487 2 2 2 1
494 2 1 2 2
517 2 2 2 2
578 2 2 2 2
656 2 1 0,5 1
661 2 0 0 0
671 2 0 0 0,5
702 2 2 2 2
722 2 2 2 2

20
 801 2 1 1 2
1031 2 1 1,5 2
2535 2 1,5 2 2
2576 2 1,5 1 2
2724 2 1 2 2
2794 2 2 1 2

Para poder visualizar más claramente las diferencias entre los datos obtenidos, éstos se
representaron mediante una gráfica de barras (Figura 11) en la que se representó la suma de todos los
valores, excepto el obtenido en la placa control (APHA), para cada cepa. Por lo tanto, aquellas cepas
que crecieron igual que en el control en los tres escenarios estudiados presentaron como máximo un
valor de 6, mientras que aquellas que no consiguieron crecer en ninguno de los medios adicionados
con los compuestos tóxicos presentaron valores cercanos a 0.

7
6 6 6 6
6 5,5
5 5 5 5
5 4,5 4,5 4,5
4
Valores

3 2,5

1 0,5
0
0
410 487 494 517 578 656 661 671 702 722 801 1031 2535 2576 2724 2794
Cepas

Figura 11. Gráfica de barras en la que se representan los valores de crecimiento de cada cepa en
medio sólido adicionado con los compuestos BTX.

De las 16 cepas, 4 pudieron crecer en las 3 situaciones con el mismo vigor que en las placas
control, éstas fueron las cepas 517, 578, 702 y 722. Sólo una fue incapaz de crecer en todos los medios
adicionados con los distintos hidrocarburos (661). En general, el resto de cepas de la colección
mostraron resistencia a la toxicidad emitida por los hidrocarburos, con valores que rondaron entre el
5,5 y el 4. De hecho, además de la cepa 661 que no pudo crecer en ninguna condición, sólo dos cepas
mostraron valores que se desviaron de esta tendencia, es el caso de la cepa 656, con un valor de
crecimiento de 2,5, y la 671, que sólo creció en el medio adicionado con benceno y de un modo
bastante pobre, por lo que se le asignó un valor de 0,5.

En general, podría decirse que el crecimiento de la mayoría de las cepas fue aceptable en todos
los medios probados, con un promedio de 4,375. Al comparar las medias de los 3 ensayos se pudo

21
observar que todas fueron muy parecidas, de menor a mayor: APHA + Tolueno (1,313), APHA + Xileno
(1,406) y APHA + Benceno (1,656). Mediante el Análisis Factorial de Varianza (ANOVA), se comprobó
que, efectivamente, no existieron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de las 3
variables con un nivel del 5% de significación, puesto que el valor-P (0,3543) de la razón-F (1,06) fue
mayor que 0,05. En definitiva, las cepas de Rhodococcus estudiadas presentaron una tolerancia similar
antes la toxicidad de los tres compuestos (B, T y X).

3.1.2. Estudio de la toxicidad sobre compuestos volátiles

Para estudiar la toxicidad que presentan estos hidrocarburos aromáticos sobre la colección de
cepas de Rhodococcus como compuestos volátiles se llevó a cabo el mismo análisis cualitativo que en
el apartado 3.1.1. Se asignaron valores de 0 a 2 según el crecimiento de cada cepa con respecto al
control, placas de Petri crecidas en APHA sin ambiente tóxico (Tabla 4, Figura 12).

Tabla 4. Datos obtenidos del análisis de toxicidad de los compuestos BTX sobres las cepas de
Rhodococcus en compuestos volátiles

ID APHA A+T A+X A+B

410 2 0,5 2 0
487 2 1 1,5 0,5
494 2 1 1 0
517 2 1 1 0,5
578 2 1 2 0,5
656 2 1 1,5 0
661 2 1,5 1 0,5
671 2 1 0,5 0
702 2 1 1 0,5
722 2 1 1,5 0,5
801 2 2 2 0,5
1031 2 1 1,5 0
2535 2 1,5 1,5 0
2576 2 2 2 0
2724 2 2 1,5 0
2794 2 0,5 2 0,5

22
 7

5 4,5
4
Valores

4 3,5 3,5
3 3 3 3 3
3 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
2
2 1,5

0
410 487 494 517 578 656 661 671 702 722 801 1031 2535 2576 2724 2794
Cepas

Figura 12. Gráfica de barras en la que se representan los valores de crecimiento de cada cepa
cuando están sometidas a un ambiente tóxico debido a la presencia de los compuestos BTX.

En comparación con los datos obtenidos en los ensayos de toxicidad en medio sólido, en los
ensayos de volátiles el crecimiento fue considerablemente menor, pasando de un promedio de 4,375
a uno de 2,906. El valor mínimo de crecimiento obtenido fue 1,5 para la cepa 671 y el máximo fue de
4,5 para la cepa 801. La mayoría de los valores de crecimiento quedaron comprendidos entre 3 y 2,5,
excepto la cepa 2576, que alcanzó un valor de 4, las cepas 578 y 2724, ambas con un valor de 3,5, y la
cepa 494, con un valor sumatorio de crecimiento de 2.

Al comparar el promedio de crecimiento entre los 3 ensayos se observaron diferencias

significativas, ya que en el ambiente tóxico con Benceno el promedio de crecimiento fue mucho menor
(0,25) que en el ambiente tóxico con Tolueno (1,188) y con Xileno (1,469). Mediante ANOVA se pudo
corroborar este hecho, ya que se observó que al comparar las 3 variables el valor-P fue menor de 0,05.
De hecho, al terminar el experimento, las placas de Petri habían sido degradadas por el benceno
adquiriendo el material plástico una coloración blanca, quedando el vaso de precipitado que contenía
el benceno completamente vacío, debido a la total volatilización de éste, algo que no había ocurrido
ni con el Tolueno ni con el Xileno. Posiblemente, la cantidad de Benceno volátil fue demasiado alta
para que cualquiera de las cepas de la colección pudiese tolerarlo adecuadamente.

A continuación, se muestra un análisis de componentes principales elaborado teniendo en

cuenta tanto los valores de tolerancia a la toxicidad emitida por los compuestos BTX estando
incorporados en el medio sobre el que se hicieron crecer las actinobacterias como en su forma volátil
(Figura 13).

23
 Gráfica de Pesos del Componente
0,8
A+T (v)
0,5
A+X (v) A+B (s )
Componente 2

0,2
A+X (s )

-0,1
A+T (s )

-0,4

A+B (v)
-0,7
-0,1 0,1 0,3 0,5 0,7
Componente 1

Figura 13. Gráfica de pesos del componente, elaborada a partir del Análisis de Componentes
Principales a partir de las 6 variables de toxicidad estudiadas para los compuestos BTX, teniendo
en cuenta todas las cepas de la colección de Rhodococcus. Abreviaturas: A+T (APHA + Tolueno),
A+B (APHA + Benceno), A+X (APHA + Xileno); s (medio sólido con compuesto incorporado) y v
(ensayo de volátiles).

En la Figura 13 se corrobora lo observado anteriormente, los ensayos de toxicidad en ambiente

(volátiles) permitieron una clasificación muy diferente de las cepas de la colección, al contrario que los
medios sólidos empleados que influyeron, en los tres casos (A+T, A+B y A+X), de un modo similar sobre
las distintas cepas. Aunque, cabe destacar el mayor carácter tóxico del tolueno en este caso. Respecto
al ensayo de compuestos en su forma volátil, se pudo comprobar la actuación diferenciada del
benceno, mucho más tóxico en estas circunstancias, y del tolueno, todo lo contrario, mostrando una
menor volatilidad que para el resto de hidrocarburos ensayados y, por tanto, resultando menos
limitante para el crecimiento de las actinobacterias.

Varios contaminantes ambientales, como el tolueno, al ser altamente hidrofóbicos, son tóxicos
para los microorganismos al acumularse en las membranas celulares. Cuando esto sucede, se altera la
integridad de la membrana y, por consiguiente, su función como barrera, matriz de enzimas y
transductor de energía. Esta inactivación de las células puede llegar a observarse incluso en
microorganismos capaces de biodegradar estos disolventes orgánicos (Isken y de Bont, 1998). Estos
estudios demuestran tanto la excepcionalidad que tiene el género Rhodococcus, junto con otros como
Pseudomonas, de tolerar estos compuestos como de que, aunque sean capaces de degradar estos
contaminantes, pueden llegar a resultarles tóxicos.

24
 En bibliografía se han descrito diferentes mecanismos por los cuales Rhodococcus es capaz de
tolerar la presencia de hidrocarburos. Así, por ejemplo, en un estudio llevado a cabo por Aizawa et al.
(2005) se aisló una cepa de Rhodococcus que podía tolerar y degradar eficientemente varias
concentraciones de benceno gracias a la producción de un polisacárido extracelular. Esto se pudo
comprobar comparando la tolerancia al benceno de esta cepa con su mutante que no producía dicho
exopolisacárido.

Una de las cosas más llamativas que se observó en el experimento de los compuestos volátiles
llevado a cabo en este trabajo, fue la pérdida de la pigmentación roja/anaranjada característica de
algunas cepas de Rhodococcus (“coco de color rojo”). Cuando se somete a estos microorganismos a
condiciones de estrés debido a un ambiente tóxico, las colonias se vuelven blancas (Figura 14). Esto
ocurrió tanto en los ensayos de Tolueno y Xileno (en Benceno no se puedo comprobar debido al poco
crecimiento que hubo) en las cepas 487, 494, 578, 656, 702 (sólo en xileno), 801, 2535, 2576 y 2724.
Esto no sucedió ni en los ensayos de toxicidad en medio sólido ni en el crecimiento de las bacterias en
medio líquido para obtener las curvas de crecimiento. Esto podría deberse a que la exposición a los
compuestos volátiles supone una situación estresante para la bacteria y se inhibe la ruta de biosíntesis
de estos carotenoides. Este cambio de color ha sido descrito previamente en la cepa R. erythropolis
tras ser sometida a solventes inmiscibles en agua, pasado de un morfotipo típicamente rosa a una
coloración de las colonias blancas/amarilla (de Carvalho et al., 2004).

Figura 14. Ensayo de compuestos volátiles. A la izquierda se observa el crecimiento de la cepa 2724
(arriba) y la cepa 671 (abajo) en APHA (control) y a la derecha el crecimiento de dichas cepas en un
ambiente tóxico con xileno. También se observa la pérdida de pigmentación en ambas cepas.

Para poder decidir finalmente qué cepas iban a pasar al siguiente experimento, consistente en
el estudio mediante curvas de crecimiento de la capacidad de degradar los compuestos BTX, se realizó
la gráfica de la Figura 15. En ella lo primero que se hizo fue normalizar los datos a partir de los
resultados obtenidos en el control (APHA). Para ello se restó al valor del control, 2 en todos los casos,
25
los valores obtenidos para cada compuesto a ensayar, benceno, xileno o tolueno. Esto se hizo tanto
para los datos obtenidos en medio líquido como sobre compuestos volátiles. Finalmente se sumaron
todos los valores y se representaron en dicha gráfica. Si una cepa hubiese crecido en todos los casos
igual que el control el valor obtenido para dicha cepa sería 0 y, por el contrario, si su valor fuese 12,
significaría que no ha crecido en ninguno de los ambientes tóxicos.

12
10
10 9

8 7
Valores

6 * 5 5 5
4 4
3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
4 3
2,5
2

0
578 722 517 702 801 2535 2576 2724 487 2794 410 494 1031 656 661 671
Cepas

Figura 15. Gráfico que representa la suma de los datos normalizados con respecto al control de
los ensayos de toxicidad tanto sobre medio sólido como compuestos volátiles.

Además, con todas esas variables estudiadas, se llevó a cabo un análisis de conglomerados que
permitió observar la clasificación de las cepas en función de su afinidad respecto a la tolerancia a la
toxicidad de los compuestos BTX (Figura 16).

26
 Dendogra ma
Método del Veci no Má s Cerca no,Eucl i dea na Cua dra da

6
Distancia

2
*

0
410
494

656
801
487
517
702
722
578

661
671
1031
2535
2724
2576

2794
Figura 16. Dendograma resultante del análisis de conglomerados con respecto a los ensayos de
toxicidad, tanto sobre medio sólido como compuestos volátiles, a los que fue sometida la
colección de cepas de Rhodococcus.

Teniendo en cuenta los resultados mostrados en la Figura 15, las cepas con valores más bajos
en el ensayo de volátiles y, por ende, con mayor tolerancia a la toxicidad, fueron 578, que muestra el
valor más bajo (2,5), 722 (3), y las cepas 517 y 702 (3,5). Además, 6 de las cepas presentaron el mismo
valor, 3,5. Finalmente, para llevar a cabo un cribado y selección de un número asumible de cepas, se
tuvo en cuenta el análisis de conglomerados (Figura 15) que situó a las cepas 517, 702, 722 y 578
agrupadas en el mismo clúster y, por tanto, teniendo en cuenta los valores observados en las Figuras
11 y 12, éste fue considerado el grupo más prometedor en relación a su capacidad para tolerar la
toxicidad de los hidrocarburos estudiados y potencialmente poder biodegradarlos.

3.2. Utilización de compuestos BTX como fuente de carbono y energía en medio líquido

En este apartado se muestran los resultados obtenidos a partir de las curvas de crecimiento
llevadas a cabo en medio líquido para el estudio del metabolismo y cometabolismo de los compuestos
BTX de las 4 cepas de Rhodococcus anteriormente seleccionadas. Debido a la situación de la COVID-
19, no pudieron obtenerse datos de la biodegradación del Xileno, pero sí del Benceno y Tolueno. No
obstante, la respuesta ante sendos compuestos resulta a priori más interesante en el transcurso de
este trabajo teniendo en cuenta el comportamiento de las cepas de la colección frente a ellos en los
medios estudiados previamente (Figura 13).

27
 A continuación, se muestran una serie de gráficas en las que se representa el log de las UFC/mL
en función del tiempo (durante los 5 días que duró el experimento). Para cada cepa se representaron
en una misma gráfica los resultados del crecimiento en caldo nutritivo (CN) (control), en un medio
mínimo de sales sólo con el compuesto a ensayar (benceno o tolueno) (B o T), y en un medio mínimo
de sales con el compuesto y, además, glucosa (B + G o T + G). La finalidad de estudiar también el
cometabolismo es que, en ocasiones, una fuente de carbono adicional puede estimular el crecimiento
de los microorganismos degradadores, pero, para ello, esta fuente de carbono adicional debe inducir
la expresión de los genes de degradación y no puede ser tóxica (Arbeli, 2009).

En la Figura 17 se muestran los resultados concernientes a la cepa 517.

Cepa 517

7,5
LOG UFC/ML

5,5

3,5
1 2 3 4 5
DÍAS

B B+G CN

Figura 17. Curva de crecimiento de la cepa 517 sólo para Benceno.

La cepa 517 mostró un crecimiento parecido cuando se cultivó en benceno y glucosa y cuando
se cultivó sólo en benceno (Figura 17). Sin embargo, el crecimiento exponencial en benceno y glucosa
es bastante mayor del primer al segundo día que sólo en benceno, y del cuarto al quinto día hay
crecimiento en benceno y glucosa y decrecimiento en benceno. En el tercer día ambas curvas de
crecimiento sufren un ligero decaimiento, aunque es mayor en el cometabolismo con glucosa. A partir
de estos datos se podría deducir que esta cepa es capaz de crecer sin necesidad de suministrar una
fuente fácilmente disponible de carbono que active su crecimiento, siendo capaz de utilizar el benceno
como única fuente de carbono. Por su parte, a pesar de que el tolueno no resultó tóxico en un medio
rico en otros nutrientes (APHA + Tolueno), esta actinobacteria no fue capaz de utilizar ese compuesto
en condiciones limitantes de nutrientes como las existentes en los medios líquidos empleados en este
experimento.

En la Figura 18 se muestran los resultados concernientes a la cepa 578.

28
 Cepa 578 Cepa 578
9 9

LOG UFC/ML
LOG UFC/ML

6 6
3 3
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
DÍAS DÍAS

B B+G CN T T+G CN

Figura 18. Curvas de crecimiento de la cepa 578 para Benceno y Tolueno.

En la cepa 578 apenas se apreció evolución del crecimiento en ninguna de las dos situaciones
estudiadas para benceno, el cultivo permanece viable sin mostrar un rápido crecimiento, pero sin ser
afectado negativamente, tanto en ausencia como en presencia de glucosa. Respecto al tolueno,
durante los primeros 3 días se observó un decrecimiento en ambas situaciones (con o sin fuente de
carbono fácilmente asimilable), sin embargo, a partir de ese momento se detectó un repunte en el
crecimiento de esta cepa en el medio sólo con tolueno, siendo capaz de utilizarlo como única fuente
de carbono y energía, mientras que en presencia de glucosa ocurrió algún tipo de inhibición.
Precisamente, esta posibilidad fue señala anteriormente para el caso del tolueno, es decir, se considera
que puede llegar a resultar tóxico para microorganismos incluso caracterizados previamente en base
a su capacidad para biodegradarlo (Pieper y Reineke, 2000). De hecho, la inhibición del crecimiento
microbiano durante el cometabolismo aeróbico de compuestos orgánicos, entre los que se incluyen
hidrocarburos, y fuentes asimilables de carbono como la glucosa, ha sido señalada por otros autores
(Jesus et al., 2016).

En la Figura 19 se muestran los resultados concernientes a la cepa 702.

Cepa 702
9
LOG UFC/ML

5
1 2 3 4 5
DÍAS

B B+G CN

Figura 19. Curva de crecimiento de la cepa 702 sólo para Benceno.

29
 La cepa 702 mostró un comportamiento similar a la cepa 517, esto es, incapacidad para crecer
sobre tolueno y un crecimiento parecido cuando se cultivó en benceno y glucosa y cuando se cultivó
sólo en benceno (Figura 19), aunque en este último caso se intuye que, al disponer sólo de benceno
como fuente de carbono y energía, el agotamiento de los recursos ocurrió antes de que llegara para el
medio adicionado con glucosa, de ahí la caída en el recuento registrado el quinto día.

En la Figura 20 se muestran los resultados correspondientes a la última cepa estudiada, 722.

Cepa 722 Cepa 722

10 10
LOG UFC/ML

LOG UFC/ML
8 8

6 6

4 4
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
DÍAS DÍAS

B B+G CN T T+G CN

Figura 20. Curvas de crecimiento de la cepa 722 para Benceno y Tolueno.

La cepa 722 mostró un gran crecimiento tanto en el medio adicionado sólo con benceno, como
en el medio de benceno y glucosa (Figura 20). En ambas curvas hay una primera fase de adaptación,
que en la curva de sólo benceno es algo más amplia, y luego el crecimiento es exponencial hasta llegar
al cuarto día para benceno sin glucosa y al quinto, para benceno y glucosa. Estos datos confirman que
esta cepa es capaz de utilizar el benceno como única fuente de carbono. Respecto al tolueno, la cepa
mostró una fuerte caída del crecimiento en el medio adicionado con glucosa al segundo día, pero luego
el crecimiento aumentó hasta el quinto día (Figura 20). En cuanto a la curva de crecimiento a partir del
medio sólo con tolueno, se observó al segundo día un ligero descenso, pero luego aumentó la carga
bacteriana, también hasta el quinto día. Estos resultados confirman que esta cepa también puede
utilizar el tolueno como única fuente de carbono.

En un estudio realizado por Kundu et al. (2013) consiguieron aislar una cepa capaz de degradar
4-nitrotolueno (4-NT) de un efluente contaminado con pesticidas. Fue identificada como Rhodococcus
pyridinivorans NT2 en base a propiedades bioquímicas y a su secuencia de ADNr 16S, la cual tiene un
98% de identidad con una de las cepas de nuestra colección con número de identificación general 578.
Esta cepa de Rhodococcus pudo crecer utilizando 4-nitrotolueno (100-400 mg L-1) como única fuente
de carbono y nitrógeno en un medio mínimo. La ruta propuesta por estos investigadores para la
degradación de 4-NT por R. pyridinivorans es la que se muestra en la Figura 21, donde se observa que
uno de los intermediarios es el protocatecuato, uno de los 3 compuestos en los que puede comenzar
la ruta del β-cetoadipato, como se vio en el apartado 1.3 en las Figuras 4 y 5. Debido a que el 4-NT es

30
más recalcitrante que los compuestos BTX, podría deducirse que esta cepa también sería capaz de
degradar dichos compuestos Otro estudio llevado a cabo por Jung y Park (2004) demostraron la
capacidad de R. pyridinovorans PYJ-1 para degradar benceno, tolueno y m-xileno tanto por separado
como en mezcla. Estos estudios apoyarían los resultados obtenidos para el benceno y el tolueno y
podría pensarse que los resultados para el xileno serían también satisfactorios.

Figura 21. Ruta de degradación del 4-NT por R. pyridinivorans NT2.

En un estudio realizado por Na et al., (2005) aislaron de un suelo contaminado con gasolina 22
bacterias oxidantes de benceno y entre ellas, la cepa B-4 fue una de las más tolerantes a disolventes
orgánicos. Tras un análisis del ARNr 16S, fue identificada como Rhodococcus opacus. Esta cepa es capaz
de utilizar un amplio espectro de hidrocarburos aromáticos y alifáticos incluyendo benceno, tolueno,
o-, m-, y p-xileno, etilbenceno, propilbenceno, estireno, n-octano y n-decano como fuente de carbono
y energía. Estos compuestos fueron suministrados en un sistema de dos fases donde estaban presentes
al 10% (v/v). Dos pequeños plásmidos llamados pKNR01 (4,4 kb) y pKNR02 (2,8 kb) son los que
permiten a esta bacteria utilizar dicho espectro de hidrocarburos. Debido a que el ADN secuenciado
de nuestras 4 cepas de bacterias en BLAST es una secuencia parcial del ARNr 16S, no se pudo
comprobar mediante alineamiento si contenía alguno de estos plásmidos. Sin embargo, sí se pudo
comparar la secuencia parcial del ARNr 16S de R. opacus B-4, con número de acceso AB192962.1, y la
secuencia parcial de las 4 cepas de Rhodococcus estudiadas utilizando los números de acceso de la
Tabla 1 del apartado 2.2. R. phenolicus tenía un 96,57% de identidad con R. opacus B-4, R.
pyridinivorans un 96,06% y R. indicum, un 94,96%. Con estos datos es posible que alguna de estas
cepas tenga alguno de estos plásmidos y sean los encargados de la biodegradación de los compuestos
BTX.

31
 En la Figura 22 se muestra un análisis de componentes principales en el que se recoge la
distribución seguida por las 4 cepas preseleccionadas para el ensayo de metabolismo y cometabolismo
en función de los 4 parámetros estudiados (2 compuestos, tolueno y benceno, en 2 condiciones
distintas, con y sin glucosa). En conjunto, estas 4 variables explicaron el 100% de la variabilidad de los
datos.

Figura 22. Análisis de componentes principales llevado a cabo con los valores de recuento (Log
UFC/mL) obtenidos para las 4 cepas preseleccionadas durante el ensayo de metabolismo y
cometabolismo en función de los 4 parámetros estudiados: B (l)- Medio líquido mínimo de sales
con benceno; B + G (l)- Medio líquido mínimo de sales con benceno más glucosa; T (l)- Medio líquido
mínimo de sales con tolueno; y T + G (l)- Medio líquido mínimo de sales con tolueno más glucosa.

Teniendo en cuenta los datos de las curvas de crecimiento para las 4 cepas (Figuras 17, 18, 19 y
20), así como el resultado del análisis estadístico de dichos resultados (Figura 22), se deduce que las
cepas 578 (Rhodococcus pyridinivorans) y 722 (Rhodococcus indicum) son las más prometedoras para
su selección como potenciales agentes biorremediadores de hidrocarburos. Además, cabe destacar el
distinto comportamiento de cada una de ellas en función del medio empleado, 578 evolucionó mejor
en general en ausencia de fuente de carbono extra, mientras que 722 presentó una mejor evolución
en condiciones de cometabolismo, es decir, con fuente extra de carbono, lo cual corrobora que no
deben ser descartadas ninguna de las dos, antes al contrario, un siguiente experimento para un estudio

32
enfocado en la optimización de su funcionalidad en condiciones a escala real, debería pasar por el
empleo de ambas en forma de consorcio, puesto que podrían complementar las ligeras carencias que
presentan cada una sobre la condición preferente de la otra.

4. CONCLUSIONES

A continuación, se describen las conclusiones obtenidas tras la ejecución de este Trabajo Fin de
Grado:

1. El género Rhodococcus posee una buena tolerancia frente a compuestos derivados del
petróleo como el benceno, el tolueno y el xileno (BTX), cuando dichos componentes se encuentran
directamente adicionados en el medio de crecimiento de las actinobacterias.

2. Los compuestos BTX en forma volátil resultaron ser más restrictivos para el crecimiento
microbiano, especialmente en el caso del benceno, que logró inhibir el crecimiento de las cepas de
Rhodococcus ante su presencia.

3. Las cepas 517-Rhodococcus phenolicus, 578- Rhodococcus pyridinivorans, 702- Rhodococcus

indicum, y 722- Rhodococcus indicum, presentan un amplio espectro de actuación in vitro sobre
diferentes medios selectivos adicionados con los compuestos ensayados, lo cual posiciona a estas
cuatro cepas como potenciales candidatas para su uso en tareas de biorremediación.

4. La cepa 578- Rhodococcus pyridinivorans exhibe los mejores resultados de metabolismo y

cometabolismo, especialmente en presencia exclusivamente de los hidrocarburos contaminantes.

5. La cepa 722- Rhodococcus indicum exhibe los mejores resultados de metabolismo y

cometabolismo, especialmente en estrategias de bioestimulación, es decir, en presencia de una fuente
de carbono adicional fácilmente asimilable, junto al hidrocarburo contaminante.

33
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