Cromatografía líquida de

alta eficiencia-HPLC

Presentado por:
Jina Martínez, Qca, MSc
Estudiante de doctorado en ciencias – Química
2021

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 HPLC
High-Performance (o high-pressure) Liquid
Chromatography
 Cromatografía

Según la IUPAC:

Physical method of separation in which the components to be separated are distributed

between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other
(mobile phase) moves in a definite direction.

En relación con cromatografía líquida:

A separation technique in which the mobile phase is a liquid. Liquid chromatography can
be carried out either in a column or on a plane. Present-day liquid chromatograph
generally utilizing very small particles and a relatively high inlet pressure is often
characterized by the term high-performance (or high-pressure) liquid chromatography,
and the acronym HPLC.

[Link] 3
 Inicios: columnas d.i 10-50 mm,
longitudes 50 - 500 cm, partículas de
150 – 200 µm.
Tasas de flujo baja
Tiempos separación largos

Fase móvil: Solvente (líquido)

Fase estacionaria: adsorbente sólido

HPLC

2-10 µm
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 ¿Por qué HPLC?
high-performance (or high-pressure)

Diámetro de partículas pequeñas: 2–20 μm

Presión de entrada: hasta 50 MPa (500 bar).

**UHPLC: Diámetro de las partículas < 2 μm

Presión de entrada >>50 MPa

High-pressure: Partículas pequeñas, altas presiones

High-performance:

N: Número de platos teóricos

L: Longitud de la columna
H: Altura de platos teóricos
2 2
tr tr
N=16 =5.54
Wb Wb

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H= H Difusión + H Difusión +HTransferencia + H Transferencia
de remolino longitudinal de masa FE de masa en FM

B
H=A + + cs +cm u
u
B
H= A + + Cu
u

6
 UHPLC

Nano-LC (proteómica)

Chen, Y.R. 2016. Doi: 10.4155/FSEB2013.14.373 7

¿Qué se puede analizar por HPLC?

HPLC es una técnica de separación muy popular en una amplia gama de industrias
debido a la diversidad de especies que se pueden analizar.

Puede separar analitos en las siguientes categorías:

• Alto peso molecular (> 2000 Da)

• Bajo peso molecular (<2000 Da)
• Polar
• No polar
• Ionizable
• Catiónico
• Aniónico

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Comparando HPLC con GC
GC HPLC

• Las muestras analizadas por GC deben • No tiene problemas de volatilidad, sin

ser volátiles (tener una presión de embargo, el analito debe ser soluble en
vapor significativa por debajo de 250 la fase móvil.
°C).
• HPLC puede analizar muestras en un
• La derivatización para aumentar la amplio rango de polaridad o muestras
volatilidad del analito es posible pero iónicas.
engorrosa e introduce posibles errores
cuantitativos. • HPLC no tiene un límite de peso
molecular superior real y se pueden
• La mayoría de los analitos de GC tienen analizar grandes proteínas de muchos
un peso molecular inferior a 500 Da miles de Da.
por motivos de volatilidad
• Detectores no destructivos
• Detectores destructivos

Si es posible por GC y por HPLC ¿cuál de los dos?

9
Comparando HPLC con GC
HPLC Fase reversa

GC

10
Funcionamiento HPLC

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 FASE MÓVIL
La composición de la fase móvil
debe optimizarse para obtener
una buena separación.

Dependiendo del modo de LC, la fase estacionaria y

el analito, se pueden utilizar agua, mezclas agua:
solventes orgánicos polares, solventes orgánicos,
buffers.

*Filtro en línea (o Filtración y desgasificación out

line): Evitar obstrucciones en columna y frita.

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 Desgasificador
Se utiliza para eliminar el aire de la
fase móvil y reducir el ruido en la
señal cromatográfica.

• Destrucción mecánica de la fase estacionaria

• Degradación de la muestra y fase móvil
(oxígeno)
• Bombeo poco confiable

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 Bombas
Se utiliza para el ingreso de la fase
móvil a contrapresión.

Requisitos usuales:

• Generación de presiones de hasta 6000 psi

(lb/in.) o 414 bares
• Tasas de flujo entre 0.1 a 10mL/min
• Flujo reproducible (0.5%)
• Componentes resistentes a la corrosión debido al
uso de solventes como fases móviles.

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Mezclando solventes

HPLC ISOCRÁTICO HPLC GRADIENTE

La composición de la fase móvil no cambia La composición de la fase móvil se altera

durante un análisis (es decir, la composición durante el análisis, normalmente
es constante), aumentando la cantidad de modificador
orgánico (HPLC fase reversa-columna
apolar).

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Automuestreador
Ingreso automático de las muestras ubicadas
en viales

Inyección manual

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Columnas - Modos de HPLC
Largo: 5 a 25 cm (10 a 15 cm, las más utilizadas)
Diámetro interno: 3 a 5 mm
Tamaños de partícula 2 a 5 µm
Fase estacionaria: Dependiente del modo de cromatografía

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Detectores
Dos tipos básicos:

• Detectores basados en una PROPIEDAD DE LA SOLUCIÓN Sensibles a un

cambio en el índice de refracción, cte dieléctria, densidad provocado por la
presencia de solutos.

• Detección basada en una PROPIEDAD DEL SOLUTO Responden a alguna

de las propiedades del soluto como por ejemplo la absorbancia en el UV, la
fluorescencia que no son inherentes a la fase móvil.

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Detectores UV-VIS

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20
Detectores de índice de refracción: Detector universal

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Detectores evaporativos de dispersión luminosa (light scattering)

El efluente de la columna se mezcla con un gas

inerte (generalmente N2), se calienta, se
evapora, se forman gotículas/partículas que
dispersan la radiación UV

22
Detectores de fluorescencia

*Derivados fluorescentes extracolumna (cloruro de dansilo)-reacciona con aminas primarias,

seundarias, fenoles. Aplicación en aminoácidos.

23
Detectores de masas

24
25
Ionización a presión atmosférica (APcI):
Es un método de ionización análogo a la ionización química (CI), parecido al método
ESI.

En APCI, la solución de analito se introduce en un nebulizador neumático y se

desolvata en un tubo de cuarzo calentado antes de interactuar con la descarga de
corona.

26
La descarga de corona actúa como un filamento que ioniza inicialmente el N2 produciendo iones
primarios (N2+ y N4+), estos iones primarios colisionan con las moléculas de disolvente vaporizado para
formar iones secundarios gaseosos y reactivos H3O+ y (H2O)nH+ .Estos iones reactivos de gas luego
experimentan colisiones repetidas con el analito dando como resultado la formación de iones de
analito.

27
 Ionización por electronebulización (ESI)

Aguja capilar de acero inoxidable 3-5 kV

1μl / min

Electrodo cilíndrico

Gas de secado

La diferencia de potencial tan alta en la aguja refuerza la pulverización y la generación

de gotas cargadas. Las gotas son repelidas desde la aguja hasta el cono de muestreo en
el contraelectrodo. A medida que las gotitas atraviesan el espacio entre la punta de la
aguja y el cono, se produce la evaporación del disolvente.

28
A medida que se produce la evaporación del disolvente, la gota se contrae hasta
alcanzar el punto en que la tensión superficial ya no puede soportar la carga (el
límite de Rayleigh) en cuyo momento se produce una "explosión coulombiana" y la
gota se desgarra. Esto produce gotas más pequeñas que pueden repetir el proceso,
así como moléculas de analito cargadas desnudas.

29
Modos de HPLC

30
Cromatografía de fase reversa (FR)

31
Cromatografía de fase reversa (FR)

Tipo de HPLC ampliamente utilizada

La fase estacionaria es un líquido

inmiscible con la fase líquida móvil.

Fase estacionaria apolar o menos

polar comparada con la fase móvil

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• Para analitos neutros, la fase móvil consiste en agua (el componente más
polar) y un modificador orgánico que se utiliza para variar la retención de
analitos al disminuir la polaridad de la fase móvil.

• Para analitos ionizables (o iónicos ), se pueden agregar otros aditivos tales

como tampones o reactivos de apareamiento iónico a la fase móvil para
controlar la retención y la reproducibilidad.
Retención de analitos en HPLC de fase inversa

Entendieron?
Qué compuesto eluirá
primero? Ordene según
el orden de elución
(relacione el número
con la letra)

A B C D E F G
36
Fases estacionarias de FR

SiO2.xH2O

Monoclorosilano
SILILACIÓN

Modificación con monoclorosilano.

R1 y R2: CH3
37
 Fases estacionarias de FR

Luna C18
**(Fases estacionarias de fase normal)
38
HPLC fase inversa: efecto de la longitud de la cadena

• Cadenas mas largas originan rellenos que muestran una mayor retención.
• Una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra.
El tamaño máximo de muestra para un relleno de C18 es casi el doble que para
uno de C4 en condiciones similares.

39
 2

40
Solventes para HPLC FR
Modificadores
orgánicos

41
Solventes para HPLC FR
La fase móvil generalmente consiste en agua/solución acuosa (tampón
acuoso) y un modificador orgánico.

Mezcla de solventes considerados cromatográficamente como DÉBILES o

FUERTES, teniendo en cuenta su fortaleza de elución que se relaciona con la
polaridad.

Fortaleza de elución
(ε)

42
Observen cómo cambiando las
proporciones del solvente B
(ACETONITRILO) se modifica la
selectividad, los factores de
retención y hasta la resolución.

43
44
Cambiar el modificador orgánico dentro de una fase móvil puede alterar la selectividad
de la separación, así como las características de retención. Adicional a la fuerza de
elución (polaridad) es necesario conocer las siguientes características del solvente:

Debe ser miscible en agua

Baja viscosidad
Estable
Buena solubilidad
Químicamente no reactivo
Elevada pureza
**Detección de baja radiación UV

45
46
Fase inversa- Triangulo de selectividad

Acido

Dipolar Básico

47
• Las columnas de fase inversa tradicionales no son adecuadas para su uso con fases
móviles altamente acuosas (> 95% H2O), debido a un fenómeno conocido como
"colapso de fase" o "autoasociación“, las cadenas de C18 se tratan de juntar unas con
otras.
• Provocando grandes pérdidas de eficiencia.

48
En cromatografía de fase inversa se utilizan solventes de elevada
polaridad, mezclas de agua con metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano, lo que puede aportar acidez o basicidad a la fase
movil.

Tradicionalmente se trabaja co fases móviles con pH entre 2,5 y 7,5

Qué le pasaría a la fase estacionaria (incluyendo el soporte) si se trabaja

a pH>7,5 o pH<2,5 ?

Hay columnas que soporten estos extremos?

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50
Moléculas que se ionizan….

• Cuando se tienen analitos ionizables, se puede utilizar el pH de la fase móvil para modificar la
forma iónica en la que se encontrará el compuesto y por tanto, esto permite modificar los
tiempos de elución, factores de retención y selectividad..

• Los analitos iónicos son mucho menos hidrófobos (más hidrófilos) cuando están en su forma
ionizada y, como resultado, su retención, k , disminuirá.

• Los analitos en su forma ionizada también mostrarán interacciones secundarias con la columna
(grupos de silanol libre) y con el sistema, lo que puede dar como resultado formas de pico
cromatográficas perjudiciales; principalmente colas máximas.

51
Análisis de analitos ionizables – Supresión de ionización por pH

Menos polar
Más hidrófobos
Más polar
Menos hidrófobos

Se puede utilizar el pH de la fase móvil para modificar la forma iónica en la que se

encontrará el compuesto y por tanto, esto permite modificar los tiempos de elución,
factores de retención y selectividad. Se utilizan soluciones tampón en la fase móvil:
Citratos, carbonato, fosfato.

52
Algunos buffer utilizados en HPLC

53
 A diferencia de los ácidos disociados (ionizados) que cuando se cargan negativamente
eluyen rápidamente de la columna, algunas veces, las bases protonadas a menudo
tienen tiempos de retención largos y una forma de pico deficiente, esto ocurre debido a
que se pueden dar interacciones con especies residuales de silanol libre en la superficie
de sílice.

Bases de sacrificio

Es posible mejorar la forma máxima de los analitos básicos utilizando una base de sacrificio
54
Observar el efecto de la adición de la
Trietilamina en el factor de coleo de la
anfetamina.

55
Cuando se tiene compuestos anfóteros- o mezclas

Supresión por pH puede que no funcione adecuadamente

56
Cromatografía de par iónico - HPLC FR

Un grupo ionizable se suprime con pH fase móvil, y el otro se

acopla a un par iónico.

A. Trifluoroacético A. Heptafluorobutírico

A. Hexasulfónico

Trietilamina
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58
Cromatografía de exclusión por tamaño
En la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la separación no se basa en
interacciones entre el analito y la superficie de la columna; la separación se basa
en el grado de inclusión o exclusión de un analito en los poros de la fase
estacionaria, cuya accesibilidad dependerá de su volumen hidrodinámico.

Columnas: geles de poliestireno y estireno-

divinilbenceno, sílice
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Curvas de calibración de cromatografía de exclusión de tamaño

Para evaluar el tamaño de los analitos a medida que eluyen de la columna SEC, se
requiere una curva de calibración. Las curvas de calibración de SEC se basan en medir el
volumen de elución (V R ) de marcadores con pesos moleculares conocidos y comparar el
volumen de elución de los analitos con este.

60
61
Cromatografía de intercambio iónico
Está dominada por mecanismos de intercambio iónico, interacciones electrostáticas entre
fases estacionarias con grupos funcionales cargados y analitos ácidos/básicos o iones
inorgánicos cargados.

62
Falsificacion de Cloroquina

Análisis de muestras incautadas en cuatro de Yaundé y Douala en Camerún, una de

Kinshasa en la República Democrática del Congo y tres de Niamey en Nígeria.

Raman, HPLC-UV, HPLC-MS

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Columna C-18
Fase móvil: A: 100% agua Milli-Q y
solvent B:70%:30% MeOH:ACN.
Método de ionización ESI
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1- Corrida cromatográfica de estándares puros (determinación de tiempos de
retención y relaciones m/z del MS si se utiliza como detector) – Optimización
condiciones del equipo

2- Preparación curvas de calibración en solvente

2- Verificación del método extractivo, inyección de matriz con estándar – Verificación

corrida

3- Determinación del efecto matriz – Si lo hay se recurre a un método de

compensación

4- Validación del método extractivo e instrumental.

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 BioResolve RP mAb Polyphenyl, 2.7 μm,
450 Å, 2.1 x 50 mm

Mobile phase A: 0.1% DFA or FA in

water
Mobile phase B: 0.1% DFA or FA in
acetonitrile

Proteína que facilita la

infección con el huésped

66
Muchas gracias!

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68
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71
72