DETERMINACIÓN ACETAMINOFÉN EN UN MEDICAMENTO

POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA HPLC

Gutiérrez Acosta, Juan Joséa. 1630287; Mondragón Escobar, Katherynb. 1624213
a. [Link]@[Link], b. [Link]ón@[Link]
Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas
Departamento de Química.
Fecha de realización: 04 de marzo de 2020.
Fecha de entrega: 24 de abril de 2020.
Entregado a: Harold Humberto Díaz.

RESUMEN
En este trabajo se realizó la determinación de acetaminofén en tableta vía oral, fabricado por Genfar®, registro
INVIMA 2015M-006528-R3, mediante un cromatógrafo de líquidos HPLC Hewlett Packard HP 1100. Para ello,
se realizó una curva de calibración con cinco puntos en un rango de 2 mg L-1 – 16 mg L-1 de acetaminofén analítico
con una pureza del 99.99 % con fecha de obtención de 19/03/2019, generando una dependencia lineal con un
coeficiente de correlación de 0.9998 ± 16,387, una pendiente de 195.61 ± 1,43 y un intercepto de 59.535 ± 14,076;
además, se realizó la separación de la muestra por duplicado, teniendo en cuenta que se usó una columna C-18,
observando el pico en tiempo de retención de 2.572 minutos para acetaminofén, por el cual se determinó la
concentración del analito en muestra, con un promedio de 7.6948 ± 0.0811, para una cantidad de 480.2 mg y un
error del 3.97%. Este error se atribuyó principalmente a dos factores como la forma de inyección y el
ensanchamiento extracolumna ya que se puede perturbar la velocidad con la que ocurren los diversos procesos de
transferencia de masa y los ensanchamientos de banda generan diferencias en la velocidad de flujo en las paredes
del tubo.
Palabras clave: Acetaminofén, Cromatografía líquida, estándar externo.

12.00 2419.30
1. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS. 16.00 3190.00
Se llevó a cabo la cuantificación de acetaminofén en Muestra 1 1574.00
una tableta comercial, fabricado por Genfar®, Muestra 2 1555.40
registro INVIMA 2015M-006528-R3, mediante
Cromatografía líquida de alta eficacia, HPLC
Hewlett Packard HP 1100, con una columna Con los resultados de la Tabla 1, se realizó el análisis
Hypersol ODS-C18, una fase móvil Agua-Metanol estadístico que empezó con la obtención de los
1:1 a un flujo de 0.500 mL min-1. Esta tableta resultados de regresión lineal como la media y
presenta un contenido de acetaminofén de 500 mg/ desviación estándar, donde se emplearon las Ec. 1 y
unidad de tableta. Los resultados de la curva de 2, respectivamente.
calibración y determinación de la muestra se ∑𝑛𝑖=1 𝑥𝑖
encuentran en la Tabla 1. Para este análisis se usó 𝑥̅ = (𝟏)
𝑛
como como muestra estándar acetaminofén analítico
de pureza 99.99%. ∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2
𝑠=√ (𝟐)
Tabla 1. Concentración de estándares usados para 𝑛−1
la curva de calibración y señal analítica.
Posterior a esto, se calculó los valores que
Concentración Área del estándar caracterizan una regresión lineal como lo es: el
estándar, mg/L coeficiente de correlación, el intercepto, la pendiente
2.00 464.74 y la desviación estándar de la regresión, mediante las
Ec. 3, 4, 5 y 6,
4.00 834.90
𝑆𝑥𝑦
8.00 1604.30 𝑟= ; (𝟑)
√𝑆𝑥𝑥 𝑆𝑦𝑦
 𝑎 = 𝑦̅ − 𝑏𝑥̅ (𝟒) lineal, puesto que los puntos están repartidos más o
𝑆𝑥𝑦 menos igual arriba y abajo del eje x sin que se vea
𝑏= (𝟓) una tendencia en particular. El comportamiento de
𝑆𝑥𝑥 los residuos es ilustrado en la Fig. 2.
𝑆𝑦𝑦 −𝑏2 𝑆𝑥𝑥
𝑆𝑅 = √ 𝑛−2
(6) 20
15
donde Sxy, Sxx y Syy están dados en las Ec. 7 y 8, 10
respectivamente, además, Sxx y Syy presentan la 5

Residuos
misma estructura. 0
𝑛
-50,00 5,00 10,00 15,00 20,00
𝑆𝑥𝑦 = ∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )(𝑦𝑖 − 𝑦̅) (𝟕) -10
𝑖=1 -15
𝑆𝑥𝑥 = ∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2 (8) -20
-25
Con estos resultados se determinó la desviación Concentración, mg/L
estándar de la pendiente y del intercepto, además de
sus intervalos de confianza, IC, como se muestran en Figura 2. Perfil de los residuos de la regresión.
las Ec. 9, 10 y 11, respectivamente, Una vez obtenido todos esos resultados, se llevó a
𝑆𝑅 cabo las pruebas de significancia para la pendiente,
𝑆𝑏 = (𝟗) el intercepto y el coeficiente de correlación de la
√𝑆𝑥𝑥 regresión como se muestra a continuación:
1 𝑥̅ 2 - Prueba t para la pendiente:
𝑆𝑎 = 𝑆𝑅 √ + (𝟏𝟎)
𝑛 𝑆𝑥𝑥 H0: la pendiente es igual a cero.

𝐼𝐶𝑤 = 𝑤 ± 𝑡𝑆𝑤 (𝟏𝟏) H1: la pendiente NO es igual a cero.

donde t representa los valores tabulados para un El tcal se halla usando la Ec. 13, y es comparado con
análisis de dos colas con n-2 grados de libertad; w es el tcri que es 3.18 para n-2 grados de libertad, dos
una notación para indicar que es aplicable para el colas y a un 95 % de confianza.
intercepto y la pendiente. El perfil de la curva para |𝑏|
los resultados de la calibración se ilustra en la Fig. 1. 𝑡𝑐𝑎𝑙 = (𝟏𝟑)
𝑆𝑏
3500,00 El tcal, 136.76, es mayor que el tcri, por lo que se
3000,00 y = 195,61x + 59,535
rechaza la hipótesis nula y se mantiene la hipótesis
alterna.
Area del estándar

R² = 0,9998
2500,00
- Prueba t para el intercepto:
2000,00

1500,00
H0: el intercepto es igual a cero.
1000,00 H1: el intercepto NO es igual a cero.
500,00 El tcal fue hallado con la Ec. 13, y fue comparado con
el tcri que es igual a 3.18 para n-2 grados de libertad,
0,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 dos colas y a un 95 % de confianza. El tcal, 4.23 es
Concentración de acetaminofén mayor que el tcri, por lo que se rechaza la hipótesis
analítico, mg/L nula y se mantiene la hipótesis alterna.
Figura 1. Perfil de la curva de calibración para la - Prueba t para el coeficiente de correlación:
cuantificación de acetaminofén en una tableta
H0: NO hay correlación entre la concentración de
comercial.
acetaminofén y el área del pico.
Seguido a esto, se realizó el análisis de los residuos
H1: hay correlación entre la concentración de
de la regresión lineal, teniendo en cuenta la ecuación
acetaminofén y el área del pico.
de la recta producida por el intercepto y la pendiente
previamente hallados, de la cual se observa que
efectivamente la relación entre las variables X e Y es
El tcal fue hallado con la Ec. 14, y comparado con el Tabla 2. Resumen de los resultados de la regresión
tcri que es igual a 3.18 para n-2 grados de libertad, dos lineal con una certidumbre del 95 %.
colas y a un 95 % de confianza.
Concepto Valor
|𝑟|√𝑛 − 2
𝑡𝑐𝑎𝑙 = (𝟏𝟒) Intercepto, a, Área
√1 − 𝑟 2 59.53 ± 14.07
estándar
El tcal, 118.40, es mayor que el tcri, por lo que se IC, a, Área estándar 59.535 ± 44.761
rechaza la hipótesis nula y se mantiene la hipótesis
alterna. Pendiente, b, Área estándar 195.61 ± 1.43
-1
Para hallar la concentración de las muestras IC, b, AP mL mg 195.61 ± 4.55
desconocida a partir de la señal analítica se usó la Ec.
Coeficiente de correlación 0.9998 ± 16,387
15 teniendo en cuenta que se usó un promedio de las
dos lecturas llevadas a cabo, y para determinar la Sxx 131.20
desviación estándar de las muestras se empleó la Ec.
Syy 5020881.20
16.
𝑦0 − 𝑎 Concentración, X0, mg/L 7.695 ± 0.081
𝑥0 = (𝟏𝟓)
𝑏 IC, X0, mg/L 7.695 ± 0.258
𝑆𝑅 1 1 𝑦 − 𝑦̅ 2 1 Cantidad acetaminofén en
𝑆𝑥0 = √ + +( 0 ) (𝟏𝟔) muestra, mg
480.2
𝑏 𝑚 𝑛 𝑏 𝑆𝑥𝑥
mg acetaminofén en
El intervalo de confianza para la muestra fue hallado 500.0
producto
empleando la Ec. 11, con un tcri igual 3.18 para n-2
grados de libertad, dos colas y a un 95 % de % error relativo en
3.97
confianza. La propagación del error fue determinada concentración
para la función dada en la Ec. 17 y aplicando la Ec. Límite de detección
18, para obtener un resultado en miligramos de 0.251
acetaminofén por unidad de tableta. Límite de cuantificación 0.838
𝑥0 𝑉25𝑚𝐿 × 𝑉100 𝑚𝐿 .
𝐶𝐴𝑐𝑒𝑡/𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡 = (𝟏𝟔)
𝑉1𝑚𝐿 2. ANÁLISIS DE RESULTADOS.
𝑆𝐶 2 𝑆𝑥 2 𝑆𝑉 2 𝑆𝑉 2
𝑆𝑉 2 La cromatografía de líquidos es una técnica de
( ) = ( 0 ) + ( 25 ) + ( 100 ) + ( 1 ) (𝟏𝟕)
𝐶𝐴𝑐𝑒𝑡 𝑥0 𝑉25 𝑉100 𝑉1 separación con mayor número de aplicaciones en la
Posteriormente, el resultado obtenido fue comparado actualidad. Esto es debido a su sensibilidad, fáciles
con el valor reportado en la tableta comercial, 500 adaptaciones para determinaciones cuantitativas, su
mg, empleando la Ec. 19 que corresponde al fácil automatización, su capacidad de separación de
porcentaje de error relativo. compuestos no volátiles o termolábiles, entre
muchos otros compuestos útiles en la industria.[1]
|𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑥𝑝𝑒 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑡𝑒𝑜𝑟 |
%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = (𝟏𝟗) Por otra parte, la naturaleza química del compuesto
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑡𝑒𝑜𝑟
determinará el tipo de cromatografía a desempeñar,
Por último, se halló el límite de detección y el límite por ejemplo, si se tiene un compuesto con baja
de cuantificación mediante las Ec. 20 y 21, polaridad y con pesos moleculares inferiores a 10
respectivamente. kDa, se podría aplicar cromatografía en fase reversa,
𝑆𝑅 donde la fase móvil es un líquido con mayor
𝐿𝐷 = 𝑘 , 𝑘 = 3 (𝟐𝟎) polaridad que la fase estacionaria. En el caso de la
𝑏
cuantificación llevada a cabo durante la práctica, se
𝑆𝑅
𝐿𝐶 = 𝑘 , 𝑘 = 10 (𝟐𝟏) tenía como compuesto de interés el N-(4-hidroxi
𝑏 fenil)acetamida, conocido como acetaminofén. Este
compuesto posee propiedades analgésicas y
El resumen de los resultados generados en los antipiréticas similares a la de la aspirina. Conocer la
anteriores cálculos es mostrado en la Tabla 2. concentración de acetaminofén en una tableta o
jarabe es importante pues además de ser un indicador
de control de calidad, da índices de toxicidad y
efectos en la salud, ya que se ha encontrado que en
dosis de 140 mg kg-1 puede ser tóxico para niños. [2]
Este compuesto químico presenta una baja polaridad
a pesar de presentar grupos funcionales polares como
lo es el hidroxilo y el amido. Lo anterior es debido a
que presenta un núcleo aromático dado por el anillo Esquema 2. Reacción para modificación de la
de benceno, además, con la unión de los grupos superficie de silica particulada para una columna C-
funcionales antes nombrados, se genera una 18, usando como material a inmovilizar: A) silano
estructura altamente conjugada, ver Esquema 1, lo monomérico y B) silano trifuncional.
que genera que los pares libres del oxígeno y del La modificación llevada a cabo por silanos
nitrógeno no estén disponibles para formar enlaces trifuncionales puede generar un mayor aislamiento
de hidrógeno con solventes altamente polares. entre el analito y la superficie de silica porosa polar,
siendo una interacción indeseada. Esta interacción se
presenta debido a que no todos los grupos silanol
presentes en la silica son modificados por diversas
causas, entre la más conocida está por impedimentos
estéricos proporcionados por grupos previamente
inmovilizados que no permiten el anclaje de uno
nuevo. Adicionalmente, al momento de generar
recubrimientos hidrofóbicos para cromatografía en
fase reversa, se prefieren cadenas laterales largas en
los grupos silanol, debido a que cadenas más largas
generan rellenos con una mayor retención; lo que
conlleva a poder introducir una mezcla con mayor
número de componentes.1
Esquema 1. Estructura química del acetaminofén y
sus estructuras resonantes. Con respecto a la fase móvil, se debe tener bastante
cuidado con el pH la mezcla de solventes, evitando
Por la característica del compuesto, se aplicó valores de pH mayores a 7.5, debido a que los grupos
cromatografía en fase reversa, empleando una silanol son susceptibles a hidrólisis, generando la
columna C-18 como fase estacionaria enlazada y una degradación del relleno. Además, a valores de pH
mezcla Agua-Metanol 1:1, como fase móvil. Las altos se forman especies de silicato solubles, lo que
columnas C-18 pueden ser sintetizadas de dos formas provoca la dilución de la fase estacionaria. Con la
principales, ya sea empleando un silano monomérico fase móvil usada, Agua-Metanol 1:1, los analitos con
o un silano trifuncional. Ambos contienen en su menor polaridad tendrán una mayor distribución y
estructura un hidrocarburo de 18 carbonos como afinidad hacia la fase estacionaria, lo que implica
cadena lateral, generalmente es el n-octildecilo, lo mayores tiempos de retención para estos que para las
que le confiere una baja polaridad a la superficie de especies con mayor polaridad. Las especies con baja
silica porosa una vez ha sido inmovilizado el polaridad como lo es nuestro analito, presenta
reactivo. [1] Una representación esquemática de la fuerzas de interacción con la fase estacionaria del
inmovilización se puede observar en el Esquema 2. tipo dispersivas o fuerzas de London,
principalmente, dipolo inducido-dipolo inducido.
El cromatógrafo utilizado es un instrumento en el
cual la inyección de la muestra se da de forma
manual, y el volumen introducido en la columna es
controlado mediante un sistema loop (válvulas
inyectoras de volumen constante) que permite que el
volumen inyectado sea el mismo, en este caso 50 µL.
La fase móvil es adicionada mediante un sistema de
bombeo que contiene unos pistones, donde el
movimiento de estos succiona a alta presión,
aproximadamente 180.44 bar, la fase móvil que pasa
por un mezclador, donde el agua y el metanol son cantidad de muestra que se está inyectando, es decir,
mezclados en las proporciones descritas [1] para así se inyectan volúmenes fijos. Caso contrario a cuando
llegar a la columna. Cuando la muestra es inyectada, las cuantificaciones se llevan a cabo en
la fase móvil la arrastra y la hace pasar por la fase cromatografía de gases, GC, porque el sistema de
estacionaria donde ocurre la separación. El inyección se encuentra con una presión y temperatura
mecanismo de separación no está bien definido, sin diferente al medio exterior del cromatógrafo, lo que
embargo, se cree que hay un proceso de adsorción de puede generar variaciones en la cantidad de muestra
las moléculas sobre la superficie, después de una inyectada. Por lo anterior, para GC se requiere de un
competencia entre especies de la fase móvil y el patrón interno que sufra las mismas condiciones de
analito. análisis que el analito y así compense fluctuaciones
Una vez la muestra atraviesa la columna, se dirige durante la inyección de muestra.
hacia el detector ultravioleta (UV), que contiene una
Se encontró una concentración promedio de 480.2
lámpara de deuterio emitiendo radiación a 243 nm,
mg de acetaminofén por pastilla, en comparación con
energía a la cual se logra la excitación de los
lo reportado por la compañía farmacéutica, 500 mg
electrones de los orbitales π→π* de los enlaces
por pastilla, se generó un error relativo de 3.9 %. Esta
dobles conjugados del anillo aromático del
discrepancia puede ser dada por dos factores: forma
acetaminofén.[3] La absorción de radiación de esta
de inyección y ensanchamiento extracolumna. La
molécula es medida cuando los componentes
forma de inyección debe ser rápida y continua, de lo
ingresan a una celda de cuarzo del tamaño de una
contrario, se puede perturbar la velocidad con la que
moneda y la señal es leída por el detector,
ocurren los diversos procesos de transferencia de
convirtiendo en una corriente eléctrica que
masa durante la migración del analito a lo largo de la
posteriormente será codificada para mostrar el
columna; además en el momento de inyectar se tuvo
cromatograma, donde se relaciona el tiempo de
especial cuidado con las burbujas pues estas generan
retención del analito con la absorbancia de la
dispersiones de banda y alteran el funcionamiento
muestra.
del detector. Por otra parte, los ensanchamientos de
Se debe tener cuidado con las columnas banda se dan por variaciones en el diámetro de los
cromatográficas pues estas se degradan con facilidad canales que transportan al analito durante la
por el polvo, o las partículas de la muestra, por este separación, generando diferencias en la velocidad de
motivo antes de realizar la inyección, se filtró los flujo en las paredes de los tubos en comparación a las
estándares, muestras y solventes para minimizar del centro, teniendo que esta última se mueva con
problemas de obstrucción de la columna y posible una mayor velocidad.
deterioro.
Con respecto al límite de cuantificación y de
Con base a los resultados obtenidos, Tabla 1, es detección, Tabla 2, se logra observar que hay una
posible afirmar que existe buena correlación entre la relación señal-ruido relativamente alta, además, la
señal analítica y las concentraciones de los muestra se encontró aproximadamente en la mitad de
estándares, que generaron un coeficiente de la curva de calibración, centroide, y está bastante
correlación de 0.9998. Para cromatografía se prefiere alejada del límite de cuantificación, lo que reduce el
realizar la cuantificación empleando el área del pico error en la cuantificación por interpolación.
en lugar de su altura, debido a que la altura es más
susceptible a cambios por diferentes factores como la 3. CONCLUSIONES.
deformación de los picos por deterioro de la - El mecanismo de inyección con sistema bucle
columna, picos con cola o con frente. Por otra parte, en HPLC permite tener una mayor certidumbre
el límite de detección indica que la señal de las sobre la cantidad de muestra que se está
muestras es más de diez veces de su valor, lo que inyectando, por tanto, se usa una calibración con
implica una buena diferenciación entre el ruido y la patrón externo, pues se garantiza que el patrón
señal. Además, el límite de cuantificación demuestra sufra las mismas condiciones de análisis que el
que está alrededor de un orden de magnitud por analito.
debajo de la señal de la muestra, por lo que esta es
- Las columnas HPLC requieren de mucho
cuantificada con una mayor certidumbre.
cuidado puesto que se degrada con mucha
Para la curva de calibración se realizó mediante facilidad y por ello se debe filtrar todas las
patrón externo, debido a que el sistema Loop del muestras y solventes para minimizar problemas
HPLC permite tener una mayor certidumbre sobre la de obstrucción de la columna.
- La naturaleza química del compuesto determinó entonces, la inyección se realiza a mano y no cuenta
el tipo de cromatografía a desempeñar, puesto con un sistema de bucle como el HPLC, por lo tanto
que el acetaminofén presenta un núcleo con patrón externo no presentará las mismas
aromático dado por el anillo de benceno con la características, mientras que con el patrón interno,
unión de los grupos funcionales amido e se garantiza que el este sufra las mismas condiciones
hidroxilo, lo que genera una estructura que el analito a determinar. [4]
altamente conjugada y, por tanto, presenta una
baja polaridad, siendo de preferencia la
cromatografía en fase reversa. 5. BIBLIOGRAFÍA.
- Con base a los resultados obtenidos, se pudo [1]. Skoog, D.; Holler, F.; Crouch, S. Principios de
afirmar que existe buena correlación entre la análisis instrumental. 6 ed. Cengage Learning,
señal analítica y las concentraciones de los México D.F., 2007. PP 816-817, 830.
estándares que generaron un coeficiente de [2]. Universidad de Belgrano, Paracetamol. Disponible
correlación de 0.9998, además del límite de en: [Link]
detección indicó que la señal de las muestras es cias/Vol8Numero5/[Link]. Revisado : 11/03/
más de diez veces de su valor, es decir, una 2020.
buena diferenciación entre el ruido y la señal. [3]. Zuluaga, F; Insuasty, B. Análisis Orgánico Clásico y
Espectral; Editorial Universidad del Valle: Cal, pp
- El error obtenido en la determinación de
76-80.
acetaminofén se atribuyó a dos factores como la
forma de inyección y el ensanchamiento [4]. Plou, F.; Salas, P. Técnicas análisis baja sin ind
extracolumna ya que se puede perturbar la analítico. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica
velocidad con la que ocurren los diversos (CSIC). Pp. 789.
procesos de transferencia de masa y los
ensanchamientos de banda generan diferencias
en la velocidad de flujo en las paredes del tubo.

4. SOLUCIÓN AL CUESTIONARIO.
- ¿Cuál es la composición de la columna C-18
usada en la práctica?. Explique.
R\\ Discutida en análisis de resultados.
- ¿Por qué la cuantificación en HPLC con curva
de calibración de patrón externo es precisa
mientras que en cromatografía gaseosa es
recomendable usar una curva de calibración con
patrón interno?.
R\\ En la cuantificación de HPLC se usa calibración
con patrón externo debido a que se tiene un sistema
de llenado con bucle, el cual, es un dispositivo
hermético que se encuentra situado a la salida de la
bomba y que permite, mediante el empleo de
válvulas, incorporar la muestra a la fase móvil antes
de la columna, sin pérdidas de presión que alteren el
flujo constante proporcionado por la bomba y un
volumen exacto, lo que permite que se adicione la
misma cantidad de patrón que la muestra, es decir
que sufra las mismas condiciones y tenga las mismas
características que el analito, mientras que en
cromatografía de gases, debido a que se realiza con
fines didácticos no se emplea el automuestreador,