Universidad de Carabobo

Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología

Departamento de Química
Unidad Académica de Química Orgánica
Laboratorio de Bioquímica

Profesor: Arnaldo Armado Elaborado por: Dulce Trejo. C.I.: 25.971.439.

Práctica Especial – Propuesta: Análisis del perfil de carbohidratos en miel de abejas.

INTRODUCCIÓN.
Los carbohidratos son biomoléculas con función energética y estructural ampliamente presentes en
el mundo de los seres vivos. Se expresan como una variedad de moléculas con distintas funciones:
almidones (reserva energética), celulosa (estructural), azúcares (energía de metabolismo rápido),
gomas (desecho), entre otras [1]. Los carbohidratos están comprendidos por una gran variedad de
moléculas y se clasifican según su estructura en: mono y disacáridos (compuestos de 1 sacárido, o 2
unidos mediante enlace glucosídico), oligosacáridos (de 3 a 10 monosacáridos) y polisacáridos (más
de 10 monosacáridos) [2].

Químicamente, los carbohidratos son polialcoholes con un grupo aldehído (-CHO) o cetona (=CO)
[3]. Todos los monosacáridos tienen este grupo libre, mientras que sólo algunos disacáridos (como
la maltosa y la lactosa) presentan el carbono anomérico libre; los polisacáridos, como el almidón y
la celulosa, son polímeros de monosacáridos unidos con enlaces glucosídicos que involucran su
carbono anomérico [4]. Todos los azúcares reductores presentan un grupo -OH anomérico libre, es
decir, que no forma parte del enlace glucosídico [3]. Las propiedades químicas de los sacáridos
varían dependiendo del número de grupos -OH y la ausencia o presencia de grupos aldehídos o
cetonas libres, y son estas variaciones las que permiten identificarlos y cuantificarlos usando
métodos colorimétricos, especialmente gracias a la capacidad reductora ya mencionada. Algunos de
los ensayos espectrofotométricos más usados involucran ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) o
métodos con ácido sulfúrico y compuestos fenólicos pues son muy específicos, pero tienen la
desventaja de ser ser costosos y altamente contaminantes; un nuevo método espectrofotométrico
basado en la reacción de Benedict, propuesto por Hernández-López y colaboradores [5], puede
emplearse para evadir estos problemas.

La miel de abejas es una mezcla compleja de azúcares producidos naturalmente por abejas. La
composición de azúcares de la miel varía según la fuente floral, pero la fructosa y glucosa son sus
carbohidratos principales (comprenden entre 85–95% de los carbohidratos totales), mientras que el
resto son mezclas complejas de disacáridos y oligosacáridos [6]. La miel ha sido consumida por
humanos desde la antigüedad, mayoritariamente en su estado sin procesar (líquido), y sus usos
varían desde medicinales, alimenticios o como aditivo endulzante para comidas y bebidas [7]. Al
ser un producto natural de precio elevado, la miel siempre ha sido susceptible a ser adulterada [8],
con adición de sustancias como glucosa líquida, sacarosa, agua, o jarabes de azúcares [9].
Comprobar su autenticidad resulta de gran importancia tanto por motivos comerciales como de
salud [8], y la determinación individual del contenido de glucosa, fructosa y sacarosa, así como
también la relación fructosa/glucosa son los principales parámetros que permiten distinguir la miel
de siropes adulterados [9].

En esta práctica se propone analizar el perfil de carbohidratos en miel usando el método

colorimétrico con reactivo de resorcinol para medir la cantidad de fructosa [4,10], y el método de
Benedict modificado [5] para encontrar los azúcares reductores totales y el contenido de sacarosa.
Una vez encontradas las cantidades, se pueden comparar con la bibliografía [9] para evaluar la
autenticidad de la muestra.
 OBJETIVOS
General:
Analizar el perfil de carbohidratos (fructosa, glucosa y sacarosa) en miel de abejas.
Específicos:
✔ Medir el contenido total de azúcares reductores y sacarosa en un material biológico
empleando el método de Benedict modificado [5].
✔ Determinar el contenido de fructosa en la muestra usando el método de resorcinol.
✔ Evaluar la autenticidad de la miel analizada con los resultados obtenidos.

METODOLOGÍA
I. Preparación de la muestra.
Pesar 1,6 g de miel y diluirla en 100 mL de agua destilada. Filtrar por gravedad o al vacío
para eliminar los posibles sólidos presentes.

II. Determinación cuantitativa de fructosa.

Principio: El hidroximetil furfural formado por la fructosa en medio ácido reacciona con resorcinol
para dar un producto de color rojo [4].
Soluciones a emplear:
✔ Reactivo de resorcinol: Disuelva 0,1 g de resorcinol 100 mL de etanol absoluto para
preparar una solución de concentración 0,1% m/v. Almacenar en frasco ámbar.
✔ Solución de HCl: Concentrada al 30% m/v.
✔ Solución estándar de fructosa: Disuelva 50 mg de fructosa en 50 mL de agua destilada.
Diluya 5 mL de esta solución a 50 mL para usar en la preparación de los estándares para la
curva de calibración. (Concentración de 0,1 mg fructosa/ml)
✔ Muestra: Diluir 0,1 mL de la solución de miel en 10,0 mL

Procedimiento:
Se efectuará el protocolo reportado por Davis & Grander [10], adaptado para las siguientes
cantidades:

Tomar 1,0 mL de la solución de muestra diluida en un tubo de ensayo y añadirle 1,0 mL de reactivo
de resorcinol (hacer por duplicado). Añadir 6,0 mL de solución de HCl concentrado a cada tubo. En
4 tubos de ensayo limpios, agregar las cantidades de reactivos mostradas en la Tabla 1. Añadir
también 1,0 mL de reactivo de resorcinol y 6,0 mL de HCl, al igual que a la muestra, y preparar un
blanco siguiendo el mismo procedimiento. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 77°C por 8
minutos. Retirar los tubos y enfriarlos sumergiéndolos en un agua a temperatura ambiente por 2
minutos, y luego baño de hielo (0°C) por 5 minutos. Medir la absorbancia de los tubos a 520 nm
cuando alcancen temperatura ambiente.

Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para determinar fructosa

Tubo Volumen de solución Volumen de agua Cantidad de Absorbancia a
patrón (mL) destilada (mL) fructosa (mg) 520 nm
B 0 1,0 0
1 0,2 0,8 0,02
2 0,5 0,5 0,05
3 0,7 0,3 0,07
4 1,0 0 0,1
 III. Determinación de azúcares reductores totales y sacarosa con el método de Benedict.

Principio: La reacción de Benedict se basa en a capacidad reductora del grupo carbonilo libre en
monosacáridos como la glucosa, el cual es capaz de recudir múltiples iones metálicos, incluido el
Cu2+. En medio alcalino, el cobre se reduce a Cu+ y precipita como Cu2O, por lo que disminuye la
concentración de iones Cu2+ en el medio de manera proporcional a la cantidad de azúcar reductor
presente. El reactivo de Benedict permite detección rápida usando agentes alcalinos no corrosivos.

Soluciones a emplear:
✔ Reactivo de Benedict: Disuelva 17,3 g de citrato de sodio y 10 g de carbonato de sodio en 50
mL de agua destilada. Calentar hasta disolver las sales y filtrar de ser necesario. Disolver 2,7
g de CuSO4.5H2O en 10 mL y añadir con agitación a la solución anterior. Aforar a 100,0 mL
con agua. Concentración de cobre en esta solución: 217 mM o 54 mg/mL
✔ Solución patrón de glucosa: Preparar 5 mL de solución de glucosa al 0,15% m/v.
✔ Solución de muestra: (1,6 g de miel/100 ml)
✔ Solución de HCl diluido (concentración 1 M)

Procedimiento:
a. Azúcares reductores totales.
Se empleará el método de Benedict modificado, propuesto por Hernández-López y col. [5].

1. Para la curva de calibración con azúcares reductores, mezclar los reactivos de la tabla 3 con 1,0
mL de reactivo de Benedict:

Tabla 3. Preparación de la curva de calibración para medir azúcares reductores totales:

Tubo Volumen de solución Volumen de agua Cantidad de Absorbancia a
patrón de glucosa (mL) destilada (mL) glucosa (mg) 740 nm
B 0 0,5 0
1 0,05 0,45 7,5
2 0,1 0,4 15
3 0,3 0,2 45
4 0,5 0 75

2. En un tubo de ensayo, tomar 1,0 mL de reactivo de Benedict y añadir 0,5 mL de muestra (hacer
por duplicado). Sumergir todos los tubos en un baño de agua hirviente durante 5 minutos. Dejar
enfriar y centrifugar a 4000xg por 2 min.

3. Recuperar todo el sobrenadante, y hacer una dilución 1:5 (completar hasta un volumen de 7,5
mL) para todas las soluciones. Medir las absorbancias a 740 nm.

b. Azúcares reductores totales tras hidrolizar la sacarosa

Tomar 5,0 mL de solución de miel y añadir 4 gotas de solución de HCl concentrado. Calentar en un
baño hirviente por 15 minutos. Tras finalizar, añadir 4 gotas de solución de NaOH concentrado.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y repetir los pasos 2 y 3 para medir la reducción del cobre.

RESULTADOS A REPORTAR Y DISCUSIONES.

• Calcule el contenido de fructosa (g) por cada 100 g de muestra.
• Construya una recta de regresión lineal graficando las absorbancias de cobre a 740 nm vs.
concentración de azúcar reductor (glucosa), y encuentre la cantidad total de azúcares
reductores en las muestras (antes y después de hidrolizar la sacarosa).
 • Calcular los carbohidratos reductores totales, y encontrar por diferencia la cantidad de
sacarosa y glucosa presente en la muestra. Calcular los porcentajes de cada una y encontrar
la relación fructosa/glucosa.

CÁLCULOS

La concentración de analito (producto coloreado de la reacción y color de la solución Cu 2+) exhibe una
relación lineal con la absorbancia, expresada por la ley de Beer.
A=abc (1)

Donde A es la absorbancia, a es la absortividad molar (M-1cm-1), b es la longitud del camino óptico (1 cm)
y c es la concentración de analito (M). La concentración puede expresarse también en otras unidades,
como mg/mL o según sea conveniente.

Se calculan las rectas de regresión lineal por ajuste de mínimos cuadrados en Excel, usando las
absorbancias y las concentraciones de patrones preparados. Se obtendrá una ecuación de la forma:
A=ac+ b (2)

Donde A, a y c significan lo mismo que en la ecuación 1, y b es el intercepto de la recta con el eje Y.

Despejando c de la ecuación 2, se obtiene:
A−b
c= (3)
a

Como en todas las mediciones se realizan diluciones, también es necesario considerar estos pasos para
calcular las concentraciones de azúcares en las muestras. La ecuación 4 contempla este proceso:
V 1 C 1=V 2 C2 ( 4)

Combinando las ecuaciones 3 y 4 y usando los valores de a y b de la primera curva de calibración, junto
con la absorbancia A de la muestra, se calcula el porcentaje de fructosa en la muestra con:
A−b 8 ml ensayo 10 ml dilucion 100 ml sol . miel
% fructosa= ⋅( )⋅( )⋅( )⋅100 (5)
a 1 ml alicuota 0,1ml alicuota 1,6 g miel

De igual manera el porcentaje de azúcares reductores totales (A.R. T), usando los datos de la curva de
calibración correspondiente totales se calcula como:
A−b 7,5 ml ensayo 100 ml sol. miel
% A . R .= ⋅( )⋅( )⋅100(6)
a 0,5 ml alicuota sol . miel 1,6 g miel

La misma ecuación se aplica para determinar el porcentaje de azúcares reductores totales tras hidrolizar la
sacarosa (A.R.2), y el porcentaje de sacarosa se determina por diferencia:
%Sacarosa=%A.R.2−%A.R.1 (7)

Como la mayoría de los azúcares reductores en miel corresponden a glucosa y fructosa, El contenido de
glucosa se determina por diferencia con los resultados de la ecuaciones 5 y 6:
% Glucosa=% A . R .T −%fructosa(8)

Finalmente, la relación de fructosa y glucosa se calcula con la ecuación:

%fructosa
Relación Fru/Glu= (9)
%glucosa

RESULTADOS ESPERADOS
Los valores normales para la composición química y física de la miel se reportan en la tabla 4. La
curva de calibración para fructosa debe ser ascendiente, mientras que la de azúcares reductores debe
ser descendiente. Además, se espera que tras hidrolizar la sacarosa en la muestra, aumente
levemente la absorbancia de esta en el método de Benedict gracias a la fructosa y glucosa que se
libera. Si la muestra aumenta mucho su absorbancia, es probable que se trate de una miel
adulterada, pero deben realizarse los cálculos correspondientes y comparar con la bibliografía [9]
para comprobarlo.

Tabla 4. Composición física y química de la miel [9].

Composición de la miel Especificaciones
Hidroxilmetilfurfural (HMF) No mayor a 60 mg/kg
Azúcares reductores totales No menor a 60%
Fructosa 27–44.3%
Glucosa 22–40.7%
Sacarosa No mayor a 5%
Relación Fructosa/Glucosa No menor a 0.95%
Metales pesados y otros aditivos (arsénico, plomo, Ausente o sin exceder los valores
mercurio, pesticidas, etc) máximos permitidos.
pH 3.24–6.1
Granos de polen Presentes

Referencias Bibliográficas.
[1] Lehninger, A.L., Cox, M.M. Nelson, D.L. (2008). Lehninger Principles Of Biochemistry. New
York : W.H. Freeman.

[2] Herrero, m., Cifuentes, A., Ibáñez, E., Castillo, M. (2013). Advanced analysis of carbohydrates
in foods. Department of Food Analysis, Institute of Industrial Fermentations (CSIC). Madrid, Spain.

[3] Roca, P. Oliver, J. Rodriguez, A. (2003). Bioquímica. Técnicas y Métodos. Editorial Hélice.
España.

[4] Sadasivam, S., Manickam, A. (2005) Biochemical Methods. 2nd ed. New Age International (P)
Limited, Pulishers. India.

[5] Hernández-López, A., Sánchez, F., Zuñiga, Z., García, I, Dinkova, T. & Avila-Alejandre, A.
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2020, 5, 50, 32403–32410.

[6] Nyuk Ling Chin & Kandhasamy Sowndhararajan. A Review on Analytical Methods for Honey
Classification, Identification and Authentication. Open Acces Peer-reviewed Chapter. doi:
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[7] Amabye TG. Phytochemical and biochemical compostion of wild honey a case study in Estern
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[8] Bogdanov S., Martin P. Honey authenticity: a review. Mitt. Lebensm. Hyg. 2002;93:232–254.

[9] Aljohar, H. I., Maher, H. M., Albaqami, J., Al-Mehaizie, M., Orfali, R., Orfali, R., & Alrubia, S.
(2018). Physical and chemical screening of honey samples available in the Saudi market: An
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[10] Davis, J. S., & Gander, J. E. (1967). A reevaluation of the Roe procedure for the determination
of fructose. Analytical Biochemistry, 19(1), 72–79. doi:10.1016/0003-2697(67)90135-2