UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS
AGROPECUARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS
Practica #3
CRITERIO PARA EL AISLAMIENTO Y PURIFICACION
DE ENZIMAS
Alumno: Diego Ismael Barrientos Ríos
Código: 2018-111043
Profesora: MGR. Soledad Bornás Acosta
TACNA – PERÚ
2021
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I. CUESTIONARIO
1. Se dice que la velocidad de una reacción química, catalizada por una enzima,
disminuye conforme va pasando el tiempo. ¿Indique cuáles serían las
posibles causas?
a) El producto puede inhibir.
b) El grado de saturación de la enzima con sustrato disminuye por el agotamiento
del mismo a medida que progresa la reacción.
c) La reacción inversa se hace más importante al aumentar la concentración del
producto.
d) La enzima (o coenzima) puede inactivarse al pH o temperatura de reacción y
varios de estos factores pueden interactuar simultáneamente.
2. Cuando se estudia el efecto de la concentración del sustrato sobre la
velocidad inicial, llega un momento en que se alcanza la velocidad máxima.
¿por qué?
Cuando llega a la velocidad máxima se dice que la enzima está saturada con
sustrato, transformándose en una cantidad constante.
3. ¿Cuáles son las propiedades y características que se debe tener en cuenta
para investigar o estudiar a una determinada enzima?
a) Propiedades fisicoquímicas: coeficientes de sedimentación y difusión; peso
molecular; forma; punto isoeléctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidación;
reversibilidad de la reacción y constante de equilibrio; calor, energía libre y
entropía de la combinación enzima-sustrato y de su conversión en productos;
medida de las constantes de velocidad de la reacción, efecto de activadores e
inhibidores.
b) Estructura: composición en aminoácidos, secuencia, presencia de grupos
prostéticos, grupos sulfhidrilos, etc.
c) Propiedades enzimáticas: naturaleza de la reacción, coenzimas, especificidad.
d) Propiedades biológicas: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras
enzimas, localización, genética, efectos de su deficiencia, inmunología.
2 evitar para no provocar la inestabilidad de
4. ¿Qué aspectos técnicos se deben
una enzima?
• Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas., trabajar entre
0 y 4 ºC y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.
• Debe evitarse la formación de espuma, desnaturalización proteica.
• Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente;
deben llevarse a cabo a baja temperatura y ésta no debe elevarse hasta que el
solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas.
• Deben tomarse también varias precauciones en lo que se refiere a las condiciones
de la reacción:
a) Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima
b) Llevar a cabo la reacción a temperatura constante.
c) Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH
d) Evitar la introducción de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva).
e) Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas
de la magnitud a medir.
5. ¿Cómo saber si una técnica de aislamiento o de purificación no está
afectando a la enzima? Explique brevemente.
Para saber si una técnica de purificación no esté afectando a la enzima, es
necesario conocer al detalle la enzima en concreto que estamos buscando,
conociéndola al derecho y al revés, podemos conocer que factores pueden hacer
que se desnaturalice. Por ello es preciso escoger muy bien que técnica usaremos
para dicha acción.
6. ¿Cómo se mide la actividad de una enzima?
Se mide con el análisis del efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante.
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7. ¿Por qué es importante saber la fuente y la localización de la enzima en una
determinada muestra?
La actividad de una enzima varía considerablemente en diferentes organismos,
debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima.
. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la
extracción y purificación de la enzima.
8. ¿Qué es el homogenato?
Es la solución que se logra después de la destrucción del celular para tener una
mejor disponibilidad de la enzima.
9. ¿Mencione qué métodos podemos aplicar para extraer la enzima de un
determinado material biológico?
a) Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio,
mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena
o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25 M,
NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en un buffer adecuado
para controlar el pH.
b) Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca
cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se
usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados
tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).
c) Desintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y
repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por
congelación se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la
estructura. Al descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido
a la presencia de agua pura y se libera su contenido.
d) Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como
el etanol, éter de petróleo, isopentanol, etc.
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e) Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas
por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza
acetona en frío.
10. ¿Con qué finalidad se utiliza el método de centrifugación para la purificación
de una enzima? Explique y ponga un dibujo.
El homogenato es centrifugado repetidas veces a velocidades crecientes
sedimentándolo progresivamente y realizando un fraccionamiento diferencial de
sus componentes.
11. ¿En qué consiste el método de 5electroforesis? Explique y ponga un dibujo.
es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por
tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
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12. ¿Cuándo se aplica el método de cromatografía?
Cuando se desea separar sustancias, a través de un pape, las sustancias más
solubles subirán más rápido.
13. ¿Cuáles son los criterios de homogeneidad, para saber si la enzima se
ha logrado purificar?
Utilizarse métodos cromatográficos, electroforesis, ultra centrifugación,
focalización isoeléctrica. La obtención de un único pico proteico es indicativa de
homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios métodos.
14¿Qué importancia tiene el estudio de las enzimas?
Ayudan mucho para poder reducir el tiempo de algunas reacciones químicas de
estudio, como auxiliar de aceleración de tal, logrando el ahorro de tiempo de la
investigación y sin alterar la reacción
.
15. ¿Qué microorganismos son ideales para extraer enzimas, por qué?
Están las bacterias y hongos, porque estos microorganismos tienen su propio
metabolismo, y con ello sus propias enzimas, las cuales, mediante procesos no
tan complejos, podemos extraer incluso a nivel industrial. Además, de que son de
fácil acceso y son cultivables en laboratorio lo cual permite una mejor producción.
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16. ¿En qué consiste la técnica de salting out? Explique y ponga un dibujo.
Básicamente consiste en aplicar soluciones de sales, en su mayoría sulfato de
amonio, para así precipitar la proteína, todo ello gracias a la solvatación de la sal,
lo cual hace que se exponga la parte hidrofóbica de la proteína, uniéndose entre
ellas mismas y precipitando por su mayor densidad a comparación de la sal.
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17. ¿Cuál es la finalidad de la inmovilización de enzimas, durante la purificación?
Se inmovilizan las enzimas para incrementar su estabilidad frente a reactivos
químicos, en términos simples, es una forma de protegerlas frente a los reactivos
y procesos que se llevarán a cabo durante la purificación, todo ello a coste de una
ligera disminución de su actividad enzimática, en la mayoría de casos, puesto que
a veces, puede perder toda su actividad, dependiendo del método de
inmovilización que escojamos.
18. ¿Qué métodos se utilizan para la cuantificación de proteínas? Explique.
i. Método de Bradford: Es un método muy sensible para cuantificar proteínas,
el cual consiste en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250, a las
proteínas, dicho colorante cuando está en una solución ácida, nos da dos
colores, anaranjado y azul, el color azul se unen a la proteína para dar un
complejo, proteína-colorante.
ii. Método Biuret: Es un método de baja sensibilidad, por lo cual se
recomienda solo para altas concentraciones de proteínas. Este método
también usa coloración, pero en este caso usa el Cu +2, el cual se une a
los grupos amino de lo enlaces peptídicos de las proteínas, por ello, a
mayor cantidad de enlaces peptídicos, mayor será la coloración. Cabe
mencionar que esta reacción es bastante específica, por lo cual se verá
mínimamente afectada por otras sustancias.
iii. Método de BCA: El ácido bicinconínico, es un compuesto capaz de formar
un complejo Cu+1 color púrpura intenso en un medio alcalino.
Puede servir como base para el método de biuret, ya que permite
monitorizar al ión Cu+2 producido por la reacción con las proteínas. Es un
método sencillo y estable.
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CONCLUSIONES
Puedo concluir que la enzima es muy necesaria para la una aceleración de las
reacciones, evitando las alteraciones de tal, y para logra obtener la enzima se debe
escoger una célula rica en enzima asi se lograra poder identificarla y separarla de forma
más sencilla.
BIBLIOGRAFIA
[Link]. (2004). mecanismos de acción de las enzimas. En
bioquimica(1631). argentina: panamericana.
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Purificación proteínas [Link]
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