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Inhibición Enzimática

Este documento describe experimentos para determinar el tipo y parámetros cinéticos de inhibición enzimática. Se encontró que un inhibidor actúa de forma competitiva al aumentar Km pero no afectar Vmax. Se calculó que la concentración de inhibidor competitivo era de 4.54 mM. Otro experimento determinó los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina, incluyendo Vmax de 300 μM/min y Km de 15 μM. Un segundo inhibidor actuó de forma competitiva con Ki de 60 μM, reduciendo la actividad enzimática en un 20% a

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Inhibición Enzimática

Este documento describe experimentos para determinar el tipo y parámetros cinéticos de inhibición enzimática. Se encontró que un inhibidor actúa de forma competitiva al aumentar Km pero no afectar Vmax. Se calculó que la concentración de inhibidor competitivo era de 4.54 mM. Otro experimento determinó los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina, incluyendo Vmax de 300 μM/min y Km de 15 μM. Un segundo inhibidor actuó de forma competitiva con Ki de 60 μM, reduciendo la actividad enzimática en un 20% a

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Alfredo Vera Macias Introducción a la biotecnología

215662913 sección D03

Inhibición Enzimática

1. Una reacción enzimática se lleva a cabo con distintas concentraciones de sustrato, en


ausencia y  presencia de un inhibidor. Los datos obtenidos se representan en unos
ejes de coordenadas según  el método de Lineweaver y Burk. Las rectas obtenidas
cortan a los ejes de coordenadas en los  siguientes puntos, en ausencia y presencia
de inhibidor, respectivamente, corte en abscisas (mM  

1
) = -3.7 y -0.2 y corte en ordenadas (μmoles/min) = 0.01 y 0.01.  
-1

a. ¿De qué tipo de inhibición se trata?  


Competitiva, por el corte entre las rectas

b. Calcular la K y V en ausencia y presencia de inhibidor.  


m max

Ausencia:
−1 1
= =−3.7
Km S
1
Km= =0.2703 mM
3.7
1
=0.01
Vmáx
1 μmol
Vmáx= =100
0.01 min

Presencia:
−1 1
= =−0.2
Km S
1
Km= =5 mM
0.2
1
=0.01
Vmáx
1 μmol
Vmáx= =100
0.01 min
c. Determinar la concentración de inhibidor sabiendo que K = 2.6x10 mM. 
i
-1

[I ]
∝=1+
ki
[ I ] =k i ( α −1 )
m´ Km ´ 5 mM
α= = = =18.4980
m Km 0.2703 mM
[ I ] =(2.6 x 10−1 mM ) ( 18.4980−1 )
[ I ] =4.5495 mM
Alfredo Vera Macias Introducción a la biotecnología
215662913 sección D03

2. Al representar por el método de los dobles inversos la cinética de la enzima fosfatasa


alcalina (en  una resuspensión de 8 μg/ml) y en presencia de p-nitrofenil fosfato, se
obtiene una recta que corta  al eje de ordenadas en 1/300 min/μM, y una pendiente de
0.05 min. Calcular: 

a. Vmax:

1 1 min
=
Vmáx 300 μ M
Vmáx=300 μ M /min

b. Km;
Km
m= =0.05 min
Vmáx

Km
0.05 min=
300 μ M∗min−1
Km=( 0.05 min ) ( 300 μ M∗min−1 )=15 μ M
c. Número de recambio si el Pm de esta enzima es de 80000 daltons.  
Vmax
K cat =
[ ET ]
μg
∗1000 ml
ml
∗1 x 10−6 g
1L
∗1 mol
1 μg
∗1 x 106 μmol
80000 g 0.1 μmol
[ ET ]=8 1 mol
=
L
−1 −1
300 μ M∗min ∗L
K cat = =3000 min−1
0.1 μ M
[ L ]
Por otro lado, al ensayar en presencia de 60 μM de glicerol fosfato, y haciendo la
misma  representación gráfica, el punto de corte con el eje de ordenadas es el
mismo, mientras que la  pendiente es de 0.1 min,  
d. ¿De qué tipo de inhibidor se trata?
Competitivo, por el corte de las rectas
e. Calcular Km', Vmax' y Ki;  

1 1 min
=
Vmáx 300 μ M
Vmáx ´=300 μ M /min
Alfredo Vera Macias Introducción a la biotecnología
215662913 sección D03

Km ´
m´ = =0.1 min
Vmáx ´
300 μ M
Km ´ =( 0.1 min ) ( min )
=30 μ M

[I ]
k i=
(α−1)
Km ´ 0.1
α= = =2
Km 0.05

[ 60 μM ]
k i= =60 μM
(2−1)

f. Determinar el grado de inhibición en estas circunstancias si estamos en


presencia de 45  μM de p-nitrofenil fosfato. 

Voi
i %= 1− ( Vo )∗100

Vmax∗[ S ] 300 μ M /min∗[ 45 μM ]


v 0= = =225 μM /min
Km+ [ S ] 15 μ M + [ 45 μM ]
Vmax∗[ S ] 300 μ M /min∗[ 45 μM ]
v 0i = = =180 μM /min
[I] 60 μM
( )
Km∗ 1+
ki (
+ [ S ] 15 μ M 1+
60 μM )+ [ 45 μM ]

180 μM /min
i %= 1− ( 225 μM /min )
∗100=20 %

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