QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

ANÁLISIS INSTRUMENTAL
5° Semestre
M. en C. Rosalba Santiago Reyes

1
Contenido
OBJETIVOS GENERALES ........................................................................................................................ 3
PRÁCTICA No. 1 ........................................................................................................................................ 4
CONTROL DE CALIDAD EN EL TRABAJO DEL LABORATORIO DE QUÍMICA ............................ 4
PRÁCTICA 2: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY ......................... 8
PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD ............... 14
PRÁCTICA 4: “SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR
CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA” ................................................................... 20
PRÁCTICA 5: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCEINA
USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN ............................................................................... 29
PRÁCTICA 6: VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN
ESPECTROFOTÓMETRO ........................................................................................................................ 33
PRÁCTICA 7: ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE
UN MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO ................................................................................................ 43
PRÁCTICA 8: ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE UN SISTEMA MÚLTIPLE .................... 56
PRÁCTICA 9: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
(MÉTODO DE KUNITZ) .......................................................................................................................... 62
PRÁCTICA 10: TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA CAPACIDAD DE INTERCAMBIO DE
UN INTERCAMBIADOR IÓNICO ....................................................................................................... 67
PRÁCTICA 11: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOÁCIDOS POR
CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO ....................................................................... 71
PRÁCTICA 12: SEPARACIÓN DE GRUPOS USANDO CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN
.................................................................................................................................................................... 76
APÉNDICE I: PREPARACIÓN DE REACTIVOS .............................................................................. 82

2
OBJETIVOS GENERALES

El alumno:
1. Comprenderá las bases teóricas y prácticas de los métodos instrumentales de
análisis y de los métodos fisicoquímicos de separación de mezclas, así como
el funcionamiento de los instrumentos empleados en éstos.
2. Conocerá la necesidad y la importancia del análisis instrumental en el
desarrollo tecnológico.
3. Con bases en los conocimientos adquiridos:
 Analizará e interpretará los resultados obtenidos, cualitativa y
cuantitativamente.
 Propondrá modificaciones a los métodos ya existentes y será capaz de
desarrollar otros nuevos.
 Podrá elegir el equipo adecuado a su área de trabajo en función de:
a) El propósito del análisis
b) Existencia en el mercado
c) Costo y tipo del analito, entre otros

3
PRÁCTICA No. 1. CONTROL DE CALIDAD EN EL TRABAJO DEL
LABORATORIO DE QUÍMICA

1. INTRODUCCIÓN
El control de calidad es un conjunto de reglas y procedimientos que se deben
seguir para garantizar la confiabilidad de un proceso, se funda en métodos de
sondeo y en el empleo de la estadística.
Cuando se realiza cualquier medición científica, es necesario considerar que se
pueden cometer diferentes tipos de "error". Este término se utiliza para
referirse a la diferencia numérica entre el valor real y el valor medido.
Los errores pueden clasificarse en: errores de fiabilidad, errores de sesgo o de
exactitud y errores de precisión.
Los errores de sesgo o exactitud se refieren a la diferencia entre un valor
"real" y la media de la distribución del mayor número de medidas realizadas
con el mismo método. Mientras menor sea la diferencia habrá más exactitud en
las medidas.
En el campo de la investigación científica es necesario tener un alto grado de
precisión en las determinaciones experimentales, para poder afirmar que el
fenómeno que se está registrando es el real, y así tener una alta confiabilidad
en los resultados.
Los errores de precisión implican el grado de dispersión de los datos
obtenidos. Si un fenómeno se mide en repetidas ocasiones con el mismo
método, siempre habrá un grado de dispersión de los datos; la magnitud de
esta dispersión se puede expresar de diversas maneras, tales como la
desviación estándar y el coeficiente de variación.
En la gráfica 1, se muestra la curva de una distribución normal de los datos
obtenidos en un experimento. Se puede observar que el valor de la media ()
se encuentra exactamente al centro de la curva, y los valores de la desviación
estándar () se distribuyen a ambos lados de la media, donde f es frecuencia.

Gráfica 1. Distribución normal, área bajo la curva (s =  = desviación estándar,

=  = media).

El coeficiente de variación, designado por CV, es la relación entre la desviación

estándar con respecto a la media, expresada como un porcentaje.
Desviación estándar:

4
Coeficiente de variación:

Donde:
 = desviación estándar
CV = coeficiente de variación
xi = valores de cada muestra
= media
n = número de datos
sumatoria

En el laboratorio se puede llevar a cabo el control de calidad de los resultados

obtenidos en el trabajo experimental, tanto en función del equipo como del
operador, si se utilizan los procedimientos estadísticos antes mencionados.

2. OBJETIVO GENERAL
 Evaluar el trabajo experimental en el laboratorio,
 Determinar las posibles variables que puedan influir en el trabajo
experimental en el laboratorio.

2.1 OBJETIVOS PARTICULARES

 Comprobar que las actividades realizadas en el laboratorio de química
son susceptibles de error.
 Familiarizar al alumno con el uso del material y equipo de laboratorio de
química.
 Aplicar herramientas de estadística para evaluar el trabajo experimental
en el laboratorio.
 Aprender a reconocer los errores que se pueden cometer durante el
trabajo experimental.
 Conocer el uso adecuado de pipetas de vidrio y de pipetas
semiautomáticas para evaluar de que manera es eficiente su
funcionamiento.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
 Material por equipo de tres a siete personas
 1 Matraz aforado de 25 ml (por grupo)
 3 Gradillas
 35 Tubos de ensayo de 16 x 150 mm
 7 Pipetas de 1 ml
 7 Pipetas de 5 ml
 1 Espectrofotómetro y celdas
Reactivos
 H2SO4 concentrado (pureza 98.6%,  = 1.84 g/ml)
 Dicromato de potasio en cristales

5
Soluciones
 Solución de H2SO4 0.8 N. Los alumnos deberán realizar cálculos para
prepararla.
 Solución de dicromato de potasio al 10 % (P/V) en H2SO4 0.8N.
Preparación: Pesar 2.5 g de dicromato de potasio y disolver en un
volumen total de 20 ml de H2SO4 0.8 N. Una vez disuelto, aforar en un
matraz de 25 mL con el mismo H2SO4 0.8N.

3.1 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Parte 1)

EVALUACION DEL USO Y FUNCIONAMIENTO DE SISTEMAS DE MEDICIÓN

A) PESO-VOLUMEN CON PIPETA SEMIAUTOMÁTICA
1. Colocar un recipiente coulter-counter de 20 ml en una balanza analítica y
pesarlo.
2. Con la pipeta semiautomática medir 50 µL de agua y depositarla en el
recipiente.
3. Registrar el peso del volumen y multiplicarlo por 1000 (1 µL = 1 g)
4. Repetir 19 veces los puntos 2 y 3
5. Calcular el CV y el % de error
6. Comparar los resultados del CV y el % de error con otros compañeros que
hayan usado la misma pipeta.

3.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Parte 2)

Cada alumno debe realizar lo siguiente:
1. Preparar de la siguiente manera una dilución de dicromato de potasio
1:50 (volumen inicial: volumen final) en agua: tomar 0.1 ml de la solución
de dicromato de potasio, colocarlo en un tubo de ensayo y agregar 4.9
ml de agua.
2. Agitar el tubo para homogeneizar la solución.
3. Realizar la misma operación (pasos 1 y 2) al menos cinco veces.
4. Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con un blanco de
agua.
5. Leer la absorbancia de cada una de las cinco repeticiones en el
espectrofotómetro, a una longitud de onda de 507 nanómetros.

4. RESULTADOS
Trabajar estadísticamente los resultados obtenidos:
1. Elaborar una tabla que contenga el número de tubos y la absorbancia
correspondiente a cada tubo.
Número de tubo Absorbancia Desviación del Cuadrado de las
xi valor medio desviaciones
xi -
1
2
3
4
5
n =5

6
 2. Calcular la media:

3. Calcular la suma de los cuadrados de las desviaciones:

4. Utilizando las fórmulas de la desviación estándar (s) y del coeficiente de

variación (CV) que se presentan en la introducción, obtener estos
valores para sus resultados.

5. DISCUSIÓN

Considere los siguientes puntos:

 Después de obtener los resultados individuales, comparar el CV
obtenido entre los integrantes del equipo.
 Discuta cuál de los miembros del equipo fue el que trabajó con mayor
precisión, es decir, el que tuvo el CV más bajo. Es importante considerar
que un CV del 10 % o menor es bueno en el trabajo de laboratorio.
 Con base en lo anterior, discuta qué miembro de cada equipo es el
mejor para trabajar en el laboratorio. Por otro lado, analice cuáles fueron
los errores que pueden explicar la obtención de CV más altos.
 Compare la media de cada uno de los equipos con el valor real
proporcionado por el profesor y discutir cuál de los equipos fue el más
exacto.
 Discuta las razones por las que un equipo puede ser más exacto que
otro al trabajar en el laboratorio.

6. CONCLUSIÓN

7. BIBLIOGRAFÍA

1. Castañeda, P. R. 1980. Bioestadística aplicada. Editorial Trillas, México.

2. Daniel, W. W 1991. Bioestadística. Editorial Limusa, México.
3. Day, R. A. y Underwood, A. L. 1989. Química analítica cuantitativa. 5a
ed., Prentice-Hall Hispanoamericana, México.
4. Mather, K. 1971. Análisis estadístico en biología. Editorial Paraninfo,
España.
5. Pagano, M. y Gauvreau, K. 2001. Fundamentos de bioestadítica. 2a ed.,
Thomson Learruing, México.
6. Zav, J. H. 1984. Biostadistical Analysis. 2' ed., Prentice Hall, E.U.A.
[Link] www/proyecto/repidisc/publica/hdt/
[Link]
[Link]

7
 PRÁCTICA 2: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE
LOWRY

INTRODUCCIÓN
La determinación de proteínas por el método de Lowry se basa en el
desarrollo de color, mediante una reacción que se efectúa en dos etapas. La
primera consiste en la formación de un complejo colorido entre, al menos, 4
enlaces peptídicos de la proteína y el cobre cúprico en medio alcalino(reacción del
Biuret). El segundo paso es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácido
fosfomolíbdico-fosfotúngstico) por el complejo cobre- proteína, dando finalmente
un heteropolimolibdeno color azul, de intensidad proporcional a la concentración
de proteína, que se lee a 590 nm. La totalidad del color producido depende del
contenido de tirosina y triptofano en la proteína.

OBJETIVOS:
 Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas
empleando un método fotométrico
 Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y
la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry para analizar las
ventajas y desventajas con respecto a otros métodos para la cuantificación
de proteínas
 Analizar el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color
para identificar el mecanismo mediante el cual interfieren en la reacción.

MATERIAL Y APARATOS
1. Una gradilla
2. 27 tubos de ensaye 18 X 150 mm
3. 8 pipetas de 5 ml (graduadas en centésimas)
4. 2 pipetas de 5 ml (graduadas en décimas)
5. 1 probeta de 50 ml
6. 1 probeta de 500 ml
7. Espectrofotómetro para la región visible
8. Cubetas para el espectrofotómetro

8
 9. 1 vaso de precipitados de 100 ml
10. Rollo de plástico auto adherente
11. Potenciómetro

PROCEDIMIENTO

1. CURVA DE CALIBRACIÓN
Para hacer la curva de calibración, se deberán agregar los reactivos como se
indica en la tabla 1, teniendo cuidado de agitar perfectamente después de agregar
a la proteína, el reactivo A y el reactivo C. Dejar en reposo 10 minutos a
temperatura ambiente, enseguida agregar el reactivo D, agitando cada tubo
inmediatamente después de la adición de éste. Se deja desarrollar el color durante
30 min a temperatura ambiente y entonces se lee en el espectrofotómetro a 590
nm. El color permanece estable por dos horas. Ajustar el espectrofotómetro al 100
%T.

NOTA: Por ser inestable, el reactivo C se prepara al momento de usarse,mezclando 1 ml

de reactivo B con 50 ml de reactivo A.

Tabla 1. Preparación de la curva tipo para determinación de proteínas

Método de Lowry
Tubo Solución de Reactivo A Reactivo C Mezclar y Reactivo D Agitar con fuerza cada
No. proteína (0.25 (ml) (ml) dejar (ml) uno de los tubos.
mg/ml) en reposo a Inmediatamente
1y 1’ 0.1 0.4 5 temperatutra 0.5 después de agregar el
2y2’ 0.2 0.3 5 ambiente por 0.5 reactivo.
3y3’ 0.3 0.2 5 10 min. 0.5
4y4’ 0.4 0.1 5 0.5
5y5’ 0.5 0.0 5 0.5
6y6’ 0.0 0.5 5 0.5

Tapar los tubos con el plástico auto adherente y agitar por inversión, después de
los tiempos establecidos.
2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para realizar el análisis estadístico prepara 10 tubos en las mismas condiciones
que el tubo No.3 de la curva de calibración y leer de la misma forma que la curva

9
de calibración.

3. INTERFERENCIAS QUÍMICAS DEL MÉTODO

Para la determinación del efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de
color por el método de Lowry, prepara 5 tubos que contengan 0.3 ml de solución
tipo de proteína, 0.1 ml de sustancia interferente y 0.1 ml de reactivo A, continuar
con el desarrollo del método y leer a 590 nm. El tubo No.6 de la curva de
calibración será el blanco para ajustar a 100 %T.

Tabla 2. Sustancias que pueden interferir en el Método de Lowry

Tubo No. Sustancias

1 Tris 1M, pH 7.0
2 Glicerol al 1 % (v/v)
3 Detergente comercial al 1 %
4 Dodecil sulfato de sodio al 1 %
5 Ácido tricloroacético al 5 %
6 Fenol al 1 %
7 Mercaptoetanol al 0.1 %
8 Tris 1M, pH 10.0
9 Urea al 5 %
10 (NH4)2SO4 al 3 %

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

1. Elaboración de la curva de calibración
Complete el siguiente cuadro y con los datos obtenidos por duplicado, haga un
gráfico en el que se muestren los puntos experimentales y la recta ajustada por
regresión lineal, colocando en el eje de las ordenadas la absorbencia a 595 nm y
en el de las abscisas la cantidad de proteína en µg.

10
 Tabla 3. Curva de calibración de albúmina o hemoglobina.
Método de Lowry

Cantidad de A 595 Serie ajustada por

Tubo No. proteína (µg) Serie a Serie b regresión lineal
1
2
3
4
5

a. Calcule y escriba los valores de:

Pendiente:___________________
Ordenada al origen:________________
Coeficiente de correlación:____________________
Diga cómo se interpretan para la curva de
calibración:________________________________________________________
b. ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? ____________________________
¿Entre qué límites de cantidad de proteína?____________________________
c. A partir de la ecuación de la recta ajustada por regresión lineal, calcule el factor
de calibración de la curva. _____________________ ¿Cuál es la importancia de
éste y para qué se utiliza? ____________________________________________
__________________________________________________________________
2. Análisis estadístico
Utilizando el factor de la recta experimentalmente, calcule la cantidad de proteína,
en µg, de cada uno de los 10 tubos preparados para el análisis estadístico, con
estos datos llene la siguiente tabla y calcule la media o promedio (x), la desviación
estándar (S), la varianza (S2), el coeficiente de variación (CV) y los limites de
confianza de la media (µ), con una confiabilidad del 95 %. Utilizando los datos de
la determinación de proteínas por los métodos de Lowry y de Bradford, determine
por la prueba de t de Student; y si existe diferencia significativa entre estos
métodos.

11
 Tabla 4. Réplicas para el análisis estadístico
Absorbencia590 Cantidad de proteína
Tubo No. Ab Hb (µg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

[Link] de algunas sustancias que interfieren en el desarrollo de color

Complete el siguiente cuadro con los resultados del efecto de las interferencias

Tabla 5. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Lowry

Absorbencia590 Cantidad de proteína
Tubo No. Sustancia (µg)
Al Hb
1
2
3
4
5
Referencia Tubo 3 de la
curva tipo

Interprete sus resultados

1. Compare este método con los métodos más usuales para la

12
 determinación de proteínas (Biuret, Bradford, absorbencia a 280 nm,
etc.) señale ventajas y desventajas de ellos.
MÉTODO VENTAJA DESVENTAJA
Lowry
Bradford
Biuret
A a 280 nm

DISCUSIÓN:_______________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
CONCLUSIONES:___________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lowry, O. H.; N. J. Rosebrough; A.L Farr and R. J. Randall. 1951. Protein
Measurement with the Folin-Phlenol Reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.
2. Clark, J. M. 1966. Bioquímica Experimental. Editorial Acribira, Zaragoza,
España, pp. 95-103
3. Harris, E. And S. Angal. 1989. Protein Purification Methods. A PRÁCTICAl
approach. IRL Press, Oxford, England, 317 pp.
4. Dryer, R.L. and G.F. Lata. 1989. Experimental Biochemistry. Oxford
university Press, New. York, pp. 342-345.

13
 PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE
BRADFORD
INTRODUCCIÓN
El método de Bradford para la determinación de proteínas implica la
reacción del azul Brillante de Coomassie G-250 con las proteínas, originando un
complejo colorido que se lee a 595 nm. Esta reacción es independiente de la
composición de a.a de las proteínas.
El enlace entre el colorante y la proteína es muy rápido, aproximadamente
2 minutos a temperatura ambiente. El color desarrollado es estable por 1 hora.

OBJETIVOS
 Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas
empleando un método fotométrico.
 Determinará si hay diferencia estadística significativa en la precisión y
exactitud respecto al método de Lowry para analizar las ventajas y
desventajas con respecto a otros métodos en la cuantificación de proteínas.
 Analizar el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color
para identificar el mecanismo mediante el cual interfieren en la reacción.

MATERIAL Y APARATOS (POR EQUIPO)

1. Una gradilla
2. 27 tubos de ensaye de 18 X 150 mm
3. 6 pipetas de 1 ml (graduadas en centésimas)
4. Una pipeta de 5 ml (graduada en décimas)
5. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
6. Espectrofotómetro para la región visible
7. Cubetas para el espectrofotómetro
8. Vasos de precipitados de 100 ml
9. Rollo de plástico auto adherente
10. Potenciómetro

PROCEDIMIENTO
1. CURVA DE CALIBRACIÓN
Para construir la curva tipo, prepara la siguiente serie de tubos:

14
 Tabla 1. Preparación de la curva tipo para determinación de proteínas
Método de Bradford
Tubo No. Solución de proteína Agua destilada Reactivo de Bradford
(0.25 mg/ml) (ml) (ml)
(ml)
1 y 1’ 0.1 2.9 3.0
2 y2’ 0.2 2.8 3.0
3 y 3’ 0.3 2.7 3.0
4 y 4’ 0.4 2.6 3.0
5 y 5’ 0.5 2.5 3.0
6 y 6’ 0.0 3.0 3.0

Cubrir los tubos con plástico autoadherente y agitar perfectamente por inversión,
después de 10 min leer la absorbencia de cada tubo a 595 nm, usando como
blanco, para ajustar el espectrofotómetro al 100 %T, el tubo 6 de cada serie.

NOTA: Si mientras realiza las lecturas, observa un color azul en las celdas, lávelas con
una solución de alcohol ácido y enjuáguelas exhaustivamente con agua destilada. NO
USE ESCOBILLÓN.

2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico, prepara 10 tubos en las mismas condiciones que el
tubo 3 de la curva de calibración, dejar reposar 10 min y leer la absorbencia a 595
nm, usando como blanco el tubo 6 de la curva de calibración.

3. INTERFERENCIAS QUÍMICAS DEL MÉTODO

Para la determinación del efecto de interferencias del método, preparar 5 tubos
con la misma cantidad de proteína que el tubo 3 de la curva tipo, agregar 0.1 ml
de 5 de las sustancias indicadas en el siguiente cuadro, 2.6 ml de agua destilada y
3.0ml del reactivo de Bradford. Agitar y leer la absorbencia a 595 nm después de
10 min de reposo. Para ajustar al 100 %T, utilizar el tubo 6 de la curva tipo.

15
 Tabla 2. Sustancias que pueden interferir en el método de Bradford
Tubo No. Sustancias
1 Tris 1 M, pH 7.0
2 Glicerol al 1 % (v/v)
3 Detergente comercial al 1 %
4 Dodecil sulfato de sodio al 1 %
5 Ácido tricloroacético al 5 %
6 Fenol al 1 %
7 Mercaptoetanol al 0.1 %
8 Tris 1 M, pH 10.0
9 Urea al 5 %
10 (NH4)2SO4 al 3 %

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

1. Elaboración de la curva de calibración
Complete el siguiente cuadro y con los datos obtenidos por duplicado, haga un
gráfico en el que se muestren los puntos experimentales y la recta ajustada por
regresión lineal, colocando en el eje de las ordenadas la absorbencia a 595 nm y
en las abscisas la cantidad de proteína en µg.
Tabla 3. Curva de calibración de albúmina o hemoglobina.
Método de Bradford
Tubo No. Cantidad de A 590 Serie ajustada por
proteína (µg) Serie a Serie b regresión lineal
1
2
3
4
5

a. Calcule y escriba los valores de:

Pendiente:___________________
Ordenada al origen:________________

16
 Coeficiente de correlación:____________________
Diga cómo se interpretan para lacurva de calibración:__________________
____________________________________________________________
b. ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? ____________________________
¿Entre qué límites de cantidad de proteína?____________________________
c. A partir de la ecuación de la recta ajustada por regresión lineal, calcule el factor
de calibración de la curva. ____________________¿Cuál es la condición
fundamental para usar este factor en determinación de la
concentración?_____________________________________________________
2. Análisis estadístico.
Utilizando el factor de la recta experimentalmente, calcule la cantidad de proteína,
en µg, de cada uno de los 10 tubos preparados para el análisis estadístico, con
estos datos llene la siguiente tabla y calcule la media o promedio (x), la desviación
estándar (S), la varianza (S2), el coeficiente de variación (CV) y los limites de
confianza de la media (µ), con una confiabilidad del 95 %. Utilizando los datos de
la determinación de proteínas por los métodos de Lowry y de Bradford, determine
por la prueba de t de Student, si existe diferencia significativa entre estos
métodos.
Tabla 4. Réplicas para el análisis estadístico
Tubo No. A 590 Cantidad de proteína
(µg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

17
3. Efecto de algunas sustancias que interfieren en el desarrollo de color.
Complete el siguiente cuadro con los resultados del efecto de las interferencias.
Tabla 5. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el
método de Bradford
Sustancia A 590 Cantidad de proteína
Tubo No. (µg)
1
2
3
4
5
Referencia Tubo 3 de la curva
tipo

Interprete sus resultados

4. Compare este método con los métodos más usuales para la determinación de
proteínas (Biuret, Lowry, absorbencia a 280 nm, etc). Señale ventajas y
desventajas de ellos.
MÉTODO VENTAJA DESVENTAJA
Bradford
Lowry
Biuret
A a 280 nm

DISCUSIÓN:_______________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

CONCLUSIONES:___________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

18
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Bradford, M. M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantiation of
Microgram Quantities of protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.
Anal. Biochem. 72: 248-254.
2. Dryer, R.L. and G.F. Lata 1989. Experimental Biochemistry. Oxford university
Press, New. York, pp. 346-347.
3. Read, M. And H. Northcote. 1981. Minimization of variaton in the Response to
Diffrerent proteins of Coomassie Blue G Dye-Binding Assay for protein. Anal
Biochem. 116: 53-64.

19
 PRÁCTICA 4: “SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS
POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA”

INTRODUCCIÓN
La separación de compuestos por cromatografía unidimensional es útil
cuando la mezcla tiene unos cuantos componentes. Sin embargo, generalmente
las mezclas problema contienen muchos componentes y es raro el caso en que
una sola fase móvil de desarrollo pueda efectuar una separación de todos ellos,
de tal forma que en un cromatograma unidimensional lo que se observa como una
mancha, puede contener en realidad dos o más componentes de la mezcla. Una
manera para resolver este problema es desarrollar varios cromatogramas
unidimensionales en diferentes fases móviles; pero para realIzar una mejor
separación se puede desarrollar un cromatograma bidimensional.
En el método de cromatografía bidimensional, la mezcla a separar se
coloca en un ángulo del cromatofolio (cuadrado o rectangular) y se desarrolla con
un disolvente en una determinada dirección. Después de secar el cromatofolio, los
componentes de la mezcla separados parcialmente, se encuentran formando una
línea, que sirve como la línea de aplicación para el corrimiento con la 2a fase. El
cromatofolio se gira entonces en ángulo recto, de tal manera que la línea de
aplicación queda paralela a la superficie de la cubeta que contiene la 2a fase móvil
en que se desarrollará el cromatograma. Como este segundo disolvente tiene
propiedades químicas diferentes al primero, aquellos compuestos que habían
corrido juntos previamente, se distribuirán de manera diferentes y se separan
dependiendo de la afinidad que tengan por la segunda fase móvil.
Después de efectuar la separación con las dos fases móviles, los
componentes del mismo tipo se revelan con una solución que reaccione con todos
ellos y posteriormente se identifican por comparación de sus valores de Rf. Una
vez que se han identificado los aminoácidos, se pueden cuantificar por alguno de
los métodos cuantitativos existentes.
OBJETIVOS
 Separar los aminoácidos presentes en jugo de frutos por cromatografía
bidimensional en capa fina para identificarlos por comparación de sus
valores de Rf con los de soluciones tipo.
 Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional, con el
de la unidimensional para señalar sus ventajas y desventajas.

20
MATERIAL Y EQUIPO
1. Cromatofolios
2. Cámara de cromatografía
3. Secadora
4. Probetas de 100 y 500 ml
5. Atomizador
6. Tijeras y regla
7. Guantes de látex
8. Pinzas de plástico para ropa
9. Horno de secado para cromatografía
10. Micropipeta
11. Puntas para micropipeta
PROCEDIMIENTO
NOTA: Saturar previamente las cámaras cromatográficas durante 20 minutos, con
los disolventes que constituyen las fases móviles por separado en frascos de
vidrio o cajas de petri (ver apéndice 1)

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA

Pesar 20 g del fruto (por ejemplo: limón, naranja, piña, etc) obfener el jugo,
filtrar a través de gasa, medir el volumen obtenido y centrifugar a 2000 rpm
por min.
2. PREPARACIÓN DEL CROMATOFOLIO
ES INDISPENSABLE MANEJAR EL CROMATOFOLIO USANDO GUANTES
Tomar tres cromatofolios y cortar de la siguiente manera.
* Una de ellas, en dos mitades de 12.5 cm x 20 cm, para los cromatogramas
unidimensionales (I y II)
* Las otras dos, en cuadrados de 20 cm2 para los cromatogramas bidimensionales
(Ill y IV)
Marcar cada una de los cromatofolios de la manera siguiente: a partir de uno de
los extremos del cromatofolio, trazar con un lápiz la línea de aplicación a 1.0 cm.
Esta operación se realiza en los cuatro cromatofolios. En los dos cromatofolios
para cromatrograma unidimensional, sobre la línea de aplicación, señalar 11
puntos equidistantes para la aplicación de las soluciones tipo de aminoácidos y del
problema, indicando en cada punto el nombre del aminoácido, Figura 1.

21
 Problema *
Valina *
Ac. Glutámico *
Prolina *
Alanina *
Tirosina. *
Figura 1. Preparación del cromatograma unidimensional
En los cromatofolios completos serán los cromatogramas bidimensionales, se gira
la hoja a 90° y se traza la línea perpendicular a las misma distancia que la
anterior, como se indica en la figura 2, el cruce de las líneas a 1.0 cm será el
punto de aplicación.

2ª fase móvil

Punto de aplicación

1ª. fase móvil

Figura 2. Preparación del cromatograma bidimensional. Nota: este
diagrama aplica para cromatografia en papel, en los cromatofolios se traza
solo una línea

22
 3. APLICACIÓN DE LA MUESTRA
Cromatogramas unidimensionales I y II. En el punto de aplicación
correspondiente a cada aminoácido y solución problema colocar 5 µl de muestra.
En todos los casos, el diámetro de la aplicación no debe exceder a los 5 mm.
Cromatogramas bidimensionales, marcar uno de ellos como cromatograma tipo
(Ill) y el otro como problema (IV). En el punto de intersección, a los 3 cm, aplicar 5
µI de cada solución tipo de aminoácidos, secando inmediatamente después de la
aplicación de cada aminoácido.
En el cromatograma IV hacer un mínimo de 10 aplicaciones, de 5 µL cada una, del
jugo del fruto elegido, secando después de cada aplicación.
4. NEUTRALIZACIÓN CON VAPORES DE AMONIACO (HIDRÓXIDO DE
AMONIO)
Después de terminadas las aplicaciones de las muestras, exponerlas a los
vapores de amoniaco durante 15 segundos. Realizar esta operación en la
campana de extracción. La neutralización es necesaria.
5. SATURACIÓN CON LA PRIMERA FASE MÓVIL: BUTANOL- AC.
ACÉTICO-AGUA
Colocar los cromatogramas I, III y IV en la cámara previamente saturada con los
disolventes de la fase móvil y saturarlos por un mínimo de 10 minutos.
6. DESARROLLO CON LA PRIMERA FASE MÓVIL
Una vez saturados los cromatogramas agregar a la cubeta 120 ml de la mezcla de
disolventes, que constituyen la primera fase móvil (ver apéndice I. Preparación de
reactivos) y desarrollarlos. Cuando el frente del disolvente haya alcanzado las 3/4
partes del largo del cromatofolio (cuidar que el disolvente no se salga del mismo),
sacar los cromatogramas, utilizando guantes, y marcar con lápiz el frente del
disolvente.
7. ELIMINACIÓN DE LA PRIMERA FASE MÓVIL
Eliminar la primera fase móvil por secado con calor en un horno para
cromatografía. El indicador de temperatura debe marcar 50 °C. Se dice que la
evaporación de la fase móvil es total, cuando no se percibe el olor de los
disolventes en las cromatogramas. Es importante encender el horno 15 min
antes de colocar los cromatogramas.
NOTA: guardar el cromatograma unidimensional (I), corrido en esta primera fase
móvil.

23
 8. SATURACIÓN CON LA SEGUNDA FASE MÓVIL: METANOL- ETANOL-
UREA-AGUA
Girar 90º los dos cromatogramas didimensionales III y IV y colocarlos en la
cámara de cromatografía; colocar también el cromatograma unidimensional II, que
se desarrollará únicamente en este sistema de disolventes. La saturación de los
cromatogramas en la segunda fase móvil, se lleva acabo en un mínimo de 10
minutos.

9. DESARROLLO CON LA SEGUNDA FASE MÓVIL

Adicionar a la cubeta 150 ml de la segunda fase móvil (ver apéndice I.
Preparación de reactivos), dejar desarrollar a lo largo del cromatofolio hasta 3/4
partes del mismo. Sacar los cromatogramas de la cámara, usando guantes y
marcar con lápiz el frente del disolvente.
10. ELIMINACIÓN DE LA SEGUNDA FASE MÓVIL
Repetir el paso 7 para eliminación de la segunda fase móvil.
11. REVELADO POR ASPERSIÓN
Colgar los cromatogramas en la campana de extracción rociarlos de manera
uniforme con una solución de ninhidrina al 0.2 % en el etanol al 96 %, desde la
línea de aplicación hasta el frente del disolvente. Dejar en la oscuridad al menos, 1
hora antes de obtener los valores de Rf.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
1. Representación esquemática de los cromatogramas
Realice los dibujos (a escala), de los cromatogramas unidimensionales I y II y
biodimensionales III y IV, ya revelados; utilice una escala 1 cm = 3 mm.
2. Cálculo de los valores de Rf.

Frente o distancia del soluto

Rf =
Frente o distancia del disolvente
a) Determinar los valores de Rf de cada aminoácido en los cromatogramas
unidimensionales y enlistarlos en orden creciente de Rf en la primera fase móvil
como se indica en la tabla 1.
NOTA : La lista en la 2a fase móvil no debe ir, en orden creciente de Rf.

24
 Tabla 1.- Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2
fases móviles
1a Fase móvil 2a fase móvil

Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf

Aminoácido Disolvente Soluto Disolvente Soluto
Glutámico
Prolina
Histidina
Alanina
Lisina
Triptofano
Valina
Arginina
Tirosina
Metionina

b) Determine los valores del Rf de las manchas del cromatograma bidimensional

tipo y acomodarlos en orden creciente de Rf en la primera fase móvil, como se
indica en la tabla 2, e identificar por comparación con los valores de Rf de los
cromatogramas unidimensionales a que aminoácido corresponde cada mancha.

Tabla 2.- Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases

móviles
1ª. Fase móvil 2ª. Fase móvil Aminoácido
No. De Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf correspondiente
mancha disolvente soluto disolvente soluto
1 Glutámico
2 Prolina
3 Histidina

25
4 Alanina
5 Lisina
6 Triptofano
7 Valina
8 Arginina
9 Tirosina
10 Metionina

c) determinar los Rf de las manchas del cromatograma bidimensional problema,

acomodar en orden creciente de Rf en la primera fase móvil como se indica en la
tabla 3, comparar con los Rf del cromatograma bidimensional tipo e identificar los
aminoácidos que contiene la muestra problema.

Tabla 3 : Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2

fases móviles
No. de 1a Fase móvil 2a fase móvil
mancha Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf
disolvente soluto disolvente soluto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

d) Compare los resultados de la tabla 3 con los de la tabla 2 construir la tabla 4,

numerando las manchas en orden creciente de su Rf en la primera fase móvil.
Indique cual fue su muestra y qué aminoácido contiene.

26
 Tabla 4.- Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2
fases móviles
No. de Rf creciente en la Rf creciente en Aminoácido
mancha 1a Fase móvil la 2a fase móvil correspondiente

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

PRENGUNTAS ADICIONALES
1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como
problema.
Jugo Problema:__________
Aminoácido reportado en literatura Aminoácido encontrado

2. Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un

aminoácido.
3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

27
4. Mencione 3 aplicaciones de la cromatografía en capa fina, diferentes al
utilizado, explique uno.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
5.-Indique las posibles fuentes de error de esta técnica.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
6. Explique como se podria cuantificar el analito y cuales serían las ventajas y
desventajas de utilizar una curva de calibración o un estándar de concentración.
Método Ventajas Desventajas
Curva de calibración
Estándar de concentración

DISCUSIÓN:_______________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
CONCLUSIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1) Smith, I. And Feinberg. 1965. Paper and Thin Layer Chromatography and
Electrophresis. Ed. Logimen; London, pp. 59-63.
2) Braitwaite, L. and F. J. Smith. 1985. Chromatographic Methods. 43 ed.,
Chapman and Hall. N.Y., pp: 98-101

28
 PRÁCTICA 5: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y
FLUORESCEINA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN

INTRODUCCIÓN

El fenómeno de adsorción es la base de la separación en las cromatografías gas-

sólido (CGS) y lÍquido-sólido (CLS). En la cromatografía líquido-sólido, la
adsorción puede ser bastante específica, de modo que, de una mezcla, un soluto
puede ser adsorbido selectivamente. La separación de componentes de una
mezcla por esta técnica depende de la diferencia en el grado de adsorción de los
solutos en la fase estacionaria (adsorbente) y de su solubilidad en el disolvente
empleado para la elución (fase móvil.) Estas interacciones dependen de tres
factores:
a) La estructura molecular de los componentes involucrados en el proceso
cromatográfico.
b) La competencia entre los solutos de la mezcla a separar por los sitios
activos o de adsorción- de la superficie de la fase estacionaria y
c) La afinidad de los mismos por la fase móvil. La CLS puede tener como
soporte una columna o una placa de vidrio.
OBJETIVOS:
 Aplicar la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos
colorantes.
 Comprobará la separación con base en el perfil de elución para señalar las
ventajas y desventajas del método.
MATERIAL Y APARATOS
1. Columna de cromatografía (15 X 2 cm)
2. Una pipeta de 1 ml (graduada en centésimas)
3. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
4. Una gradilla metálica
5. Treinta tubos de ensaye de 13 X 100 mm
6. Lana de vidrio
7. Tubería de látex
8. Dos vasos de precipitados de 100 ml
9. Soporte universal
10. Pinzas para bureta
11. Bulbo de hule

29
12. Embudo de vidrio
13. Pipeta Pasteur
14. Espectofotómetro para la región visible
15. Cubetas para el espectrofotómetro
16. Ponteciómetro
PROCEDIMIENTO
Llenar con agua destilada aproximadamente tres cuartas partes de la
columna de vidrio, introducir un disco de lana de vidrio previamente humedecido
para formar un soporte en la base de la columna. Pesar 15 g de alúmina alcalina y
adicionarlos a la columna usando un embudo de vidrio, la llave de la columna
debe de estar abierta para que se desaloje el agua necesaria, la columna de
alúmina no debe secarse durante la separación. La adición se hace lenta, pero
constante, para que el adsorbente se empaque de manera homogénea y no se
formen estratos, ni burbujas de aire.
Una vez sedimentada la alúmina, se ajusta la velocidad de elución, que
deberá ser entre 15 y 20 gotas por minuto. Cuando el menisco del agua está 3
mm por encima de la columna de alúmina, aplicar 0.1 ml de la mezcla de
colorantes en la parte central de la superficie del adsorbente (tener cuidado de no
impregnar las paredes de la columna con la muestra), en este momento comenzar
a colectar fracciones de 3.0 ml en tubos de ensaye previamente aforados;
adicionar aproximadamente 1 ml de agua con pipeta Pasteur, resbalando por las
paredes de la columna para introducir toda la mezcla de colorantes a la alúmina.
Esta operación se repite unas tres veces, hasta que ya no haya colorantes
en la superficie de la fase estacionaria. Adicionar agua destilada hasta el extremo
superior de la columna de vidrio. Después de que el primer colorante haya eluido,
sustituir el agua por el etanol ácido y continuar la colección de fracciones
obtenidas a 493 y 590 nm, Ajustar a 100 % T a 493 nm con agua y con alcohol
ácido a 590 nm.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

1. Elaborar la siguiente tabla:

30
Tabla 1. Valores de absorbencia obtenidos para la separación de
fluoresceína y azul de metileno
No. de fracción A 493 A590

2. Construir el perfil de elución colocando en el eje de las abscisas el

volumen de elución y en las ordenadas el valor correspondiente de
absorbencia a 493 y a 590 nm. Interprete el resultado.
3. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta
separación.___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4. Defina el término adsorción y describa, empleando fórmulas, cuales son
las fuerzas intermoleculares que participan en el
proceso._____________________________________________________

31
 ____________________________________________________________
____________________________________________________________
DISCUSIÓN:__________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
CONCLUSIONES:_____________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Heftman, E. 1975. Chromatografy. A Laboratory Handbook of Cromatografic

and Electrophoretic Methods. 38. ed. Van, Nostrand Reinhold Co., New York,
969 pp.
2. Shott, J. and W. Heine. 1951. A Chromatographic Separation of Some
Dyestuffs. J. Chem. Educ. 28: 39-40
3. Barnard, J. And A. Chayan. 1965. Modern Methods in Chemical Analysis. Mc.
Graw- Hill Publishing Co., N.Y., pp.168
4. Castellan, G.W. 1990 Fisicoquimica. Fondo Educativo Interamericano, S.A.,
México, 818 pp.

32
 PRÁCTICA 6: VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN
ESPECTROFOTÓMETRO

INTRODUCCIÓN
La obtención de mediciones exactas, por medio del análisis
espectrofotométrico requiere de instrumentos calibrados, cuyos parámetros
fotométricos esenciales se encuentren dentro de las especificaciones establecidas
para su buen funcionamiento.
La utilidad y confiabilidad de los análisis fotométricos, dependen del control
de las fuentes de variación o errores determinados que se pueden presentar en
una medida fotométrica. Por tanto, es indispensable la verificación periódica del
funcionamiento correcto de los espectrofotómetros, mediante pruebas que se
deben hacer para el caso. Esto permite saber si es necesario el ajuste o
calibración del fotómetro por personal especializado.
Para el control de calidad de un espectrofotómetro se debe efectuar el
seguimiento de las características o parámetros fotométricos como son: la
sensibilidad de la respuesta, la exactitud de la escala de longitud de onda, la
linealidad fotométrica, la presencia de luz dispersa, el aumento en el ancho de
banda y la exactitud fotométrica.

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN MÍNIMO DE LECTURA Y OBSERVACIÓN

DEL “EFECTO MENISCO”
En las determinaciones fotométricas es de vital importancia que el volumen que
se deposita en la celda de lectura sea el adecuado para asegurar que el rayo
de luz atraviesa completamente la solución.
El manejo de volúmenes inferiores al volumen mínimo requerido ocasiona
lecturas erróneas y como consecuencia resultados incorrectos.
Cuando se coloca una cantidad insuficiente de solución en la celda, el rayo de
luz atraviesa por el menisco de la misma y por el efecto de difracción se
obtienen lecturas elevadas.
RENDIMIENTO INSTRUMENTAL
Los resultados de la sensibilidad de respuesta, conocidos también como
rendimiento instrumental, evalúan en conjunto el funcionamiento de la fuente de
radiación, del monocromador y del detector.
EXACTITUD DE LA ESCALA DE LONGITUD DE ONDA

33
Hay que considerar que la absorbencia de un cromóforo es una medida a la
longitud de onda de máxima absortividad. Por lo tanto, si la calibración de la
exactitud de la longitud de onda de un instrumento cambia, la absorbencia puede
cambiar y la magnitud de este cambio genera un error que depende de la
localización relativa de este punto en el espectro de absorción del cromóforo,
siendo el error muy grande en espectros de banda de absorción muy estrecha.
PROPORCIONALIDAD FOTOMÉTRICA
Un espectrofotómetro funcionando adecuadamente debe exhibir una relación
lineal entre la energía radiante absorbida y la lectura instrumental. Lo que se está
verificando así, es la respuesta lineal del detector. La proporcionalidad
instrumental es un prerrequisito para la exactitud espectrofotométrica, y la
exactitud analítica.
RADIACIÓN DISPERSA
Se puede definir como la energía radiante que llega al detector, que no es
transmitida por el cromóforo y que no se encuentra indicada en el selector de
longitud de onda. Esta radiación ocasiona desviación negativa de la ley de Bouger
y Beer, dando como resultado una disminución aparente en la concentración del
analito a determinar; de allí la importancia en determinar su presencia.
ANCHO DE BANDA
Está muy relacionada con la radiación dispersa, pues si el ancho de banda es
amplio se aumenta la presencia de radiación dispersa. El ancho de banda se
puede definir como: el intervalo de longitud de onda que incide con la mitad de la
intensidad máxima de transmisión, sobre el material absorbente. El ancho de
banda se encuentra, también, dado por la abertura de la ranura de salida del
monocromador. Su determinación es importante pues un ancho de banda amplio
ocasiona desviación negativa a la Ley de Bouger y Beer.
EXACTITUD FOTOMÉTRICA
Esta característica se refiere principalmente a la exactitud en la escala de
absorbencia en el fotómetro. La exactitud fotométrica es importante cuando se
efectúan análisis fotométricos que no tienen estándares químicos, como es el
caso de las determinaciones enzimáticas, donde la exactitud de la absorbencia es
fundamental.

34
OBJETIVO
 Realizar las siguientes pruebas de control de calidad de un
espectrofotómetro: proporcionalidad o linealidad fotométrica, exactitud de la
escala de longitud de onda, presencia de radiación dispersa, ancho de
banda y exactitud para determinar la respuesta instrumental del equipo.
MATERIAL Y EQUIPO
1. Espectrofotómetro Shimadzu UV 1201
2. Espectrofotómetro Spectronic 20
3. Cubetas para el espectrofotómetro UV-Vis
4. Una gradilla
5. Veinte tubos de ensaye de 18 X 150 mm
6. Dos pipetas de 5 ml (graduadas en décimas)
7. Una pipeta de 1 ml (graduada en centésimas)
8. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
9. Un vaso de precipitados de 100 ml
PROCEDIMIENTO

A) Determinación del volumen mínimo de lectura y observación del “Efecto

menisco”.
Ajustar el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm. Colocar
0.2 ml de la solución dicromato de potasio al 0.08 % y tomar la primera lectura.
Agregar 0.2 ml de la solución nuevamente y registrar la lectura. Repetir la
adición de la misma cantidad de solución tomando las lecturas hasta que
permanezca constante. Determinar el volumen mínimo de lectura.
A) Exactitud de la escala de longitud de onda
A.1) Método del filtro de tierras raras (didimio). Nota: No se realiza.
Colocar el selector de longitud de onda en 380 nm y ajustar el instrumento al aire
(0 %T) Ajustar a 100 %T con agua destilada e insertar el filtro de didimio en el
portacubetas sin quitar la celda con agua y leer la transmitancia a las siguientes
longitudes de onda 400, 410, 420, 430, 450, 460, 470, 490, 495, 500, 510, 525,
530, 550, 560, 580 y 590 nm, Tabla 2

NOTA: Cada vez que se cambie la longitud de onda, quite el filtro y ajuste a 100 %T

A.2) Método de solución química colorida. Solución acuosa de NiSO 4. 6H20 al 20

35
%.
Colocar el selector de longitud de onda en 400 nm y ajustar a 100 %T con una
solución de HCI al 1 %, empleada como blanco de reactivos. Colocar la solución
del sulfato de níquel en el portacubetas y leer la transmitancia de 380 a 600 nm en
intervalos de l0 nm, ajustando a 100 %T con el blanco de reactivos cada vez que
cambie la longitud de onda, tabla 3.
A.2,1) 1. Adicionar 25 µL de la solución de rojo de cresol al 1 % en cada uno de
tres matraces aforados de 25 mL.
2. Aforar cada uno de los matraces con las siguientes soluciones
a) Ácido sulfúrico 0.5 M
b) Hidróxido de sodio 0.5 M
c) Regulador de citratos 0.5 M pH 4.7
3. Leer las absorbencias de las tres soluciones en un espectrofotómetro, desde
360 nm hasta 680 nm con intervalos de 20 nm. Ajustar a cero con agua
destilada después de cada cambio de longitud de onda.
B) Proporcionalidad o linealidad fotométrica
Determine la absorbencia a 460 y 550 nm de la solución de NiSO4. 6H20 al 20 %
ajustando previamente el aparato al aire y a 100 %T al 1 %, tabla 4.
C) Luz dispersa, espuria y errática o extraña
Ajustar el instrumento al aire (0 %T) y a 100 %T con HCI al 1 %. Leer la
transmitancia de la solución estándar de sulfato de níquel al 20 % a 400 nm, para
comprobar que no existe luz extraña a ambas longitudes de onda, comparar con
las lecturas del experimento del inciso A.2. Se considera que existe luz extraña
cuando hay un crecimiento de %T mayor a 3, con respecto a la lectura original a
ambas longitudes de onda, Tabla 5.
D) Ancho de la banda (ranura de salida)
Leer la transmitancia del sulfato de níquel al 20 % a 510 nm, ajustando
previamente el aparato a 0 y 100 %T con HCI al 1 %. Se considera que hay
cambios en el ancho de banda cuando hay decrementos del 3 %T con respecto a
la lectura original (inciso B) Tabla 6.
E) Exactitud fotométrica
En una espectrofotómetro que trabaje en la región ultravioleta, determinar la
absorbencia a 235, 257, 313 y 350 nm de una solución de referencia de dicromato
de potasio. Ajustar el instrumento al aire y a 100 %T con H2SO4 0.005 M. La

36
lectura se efectúa en una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz, Tabla 7.
COMPORTAMIENTO INTEGRAL DEL ESPECTROFOTÓMETRO
a) Prepare por duplicado la curva de calibración de acuerdo a la siguiente
tabla:
Tabla No. 1 Preparación de la curva de calibración del sulfato de níquel

Tubo No. NiSO4. 6H2O HCl al 1 %

a b al 0.19 M (ml) (ml)
1 1’ 0.0 4.0
2 2’ 0.2 3.8
3 3’ 0.6 3.4
4 4’ 1.4 2.6
5 5’ 2.2 1.8
6 6’ 3.0 1.0
7 7’ 3.2 0.8
8 8’ 3.6 0.4
9 9’ 3.8 0.2
10 10’ 4.0 0.0

Determine la absorbencia de cada tubo de ambas series, a 400 nm ajustando al

100 % T con el tubo 1 y 1 ' respectivamente, Tabla 8.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

A) Exactitud de la escala de longitud de onda

A.1) Método del filtro de tierras raras (didimio)
a) No se tienen resultados
b) Construya el espectro de transmisión, colocando en el eje de las abscisas la
longitud de onda (nm) y en las ordenadas el porcentaje de transmitancia.
c) ¿Cómo es la exactitud de la escala de longitud de onda del espectrofotó
metro?____________________________________________________________
A.2) Método de solución química colorida, solución acuosa de NiSO 4. 6H2O al 20
%.
a) Con los datos obtenidos con la solución de NiSO4. 6H20 al 20 % complete la
Tabla 3.

37
 Tabla 3. Exactitud de la escala de longitud de onda con la solución de
NiSO4. 6H20 al 20 %
Longitud de onda (nm) %T
380
390
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600

b) Construya el espectro de transmisión, colocando en el eje de las abscisas la

longitud de onda (nm) y en las ordenadas el porcentaje de transmitancia.
c) Escriba las ventajas y desventajas de la determinación de la exactitud de la
escala de longitud de onda con los métodos empelados en la práctica.
B) Linealidad o proporcionalidad fotométrica
Con los datos obtenidos complete la tabla 4 y diga si hay proporcionalidad.

38
 Tabla 4. Linealidad o proporcionalidad fotométrica
Longitud de onda A
(nm)
460
550

NOTA: Dadas las propiedades de absorción y transmisión de luz de la solución de

NiSO4. 6H20 al 20 %, para que haya linealidad fotométrica la proporción de la
intensidad de luz que llega al detector, en este caso debe, ser 2:1.

C) Luz dispersa
a) Complete la tabla 5
Tabla 5. Luz dispersa

Longitud de onda (nm) %T

400

b) Compare sus datos con los del experimento del inciso A.2 e indique si hay
luz dispersa en el aparato.
D) Ancho de banda
a) Con el resultado obtenido, complete la Tabla 6.
Tabla 6. Ancho de banda.
Longitud de %T
onda (nm)
510
b) Compare el valor obtenido de %T, con el valor original y diga si hubo
modificación en el ancho de banda.
E) Exactitud fotométrica
a) Con los datos obtenidos complete la Tabla 7

39
 Tabla 7. Exactitud fotométrica. Valores experimentales esperados de la
solución de referencia de dicromato de potasio
Longitud de onda 235 257 313 350
(nm) min máx min máx
A esperada 0.748 0.865 0.292 0.640
Tolerancia aceptada 0.740-0.756 0.856-0.874 0.289-0.295 0.634-0.646
E (1%, 1cm) 24.54 144.2 48.62 106.56
A medida

b) Indique si el espectrofotómetro tiene exactitud fotométrica. Complete la

siguiente tabla
Tabla 8. Verificación del funcionamiento del espectrofotómetro.
Experimento Datos obtenidos
Exactitud de la escala de longitud de onda.
Proporcionalidad o linealidad fotométrica.
Luz dispersa, espuria y errática o extraña.
Ancho de la banda (Ranura de salida).
Exactitud fotométrica.

Señale dos causas que originen:

 Luz extraña.
 Cambio en el ancho de banda.
 Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental.

F) Funcionamiento integral del espectrofotómetro. Con los datos obtenidos

completa la siguiente tabla.
Tabla 8. Funcionamiento integral del espectrofotómetro
Tubo No. Concentración de A400 Serie ajustada por
a b NiSO4. 6H20 (M) Serie a Serie b regresión lineal
1 1’
2 2’
3 3’
4 4’

40
5 5’
6 6’
7 7’
8 8’
9 9’
10 10’

b) Construya la curva de calibración, poniendo los puntos por duplicado, en los

mismos ejes coordenados, trazando la recta ajustada por regresión lineal.
Calcule y coloque en la misma gráfica los valores de la pendiente, b; la
ordenada al origen, a y el coeficiente de correlación r.
c) ¿Cómo se interpretan estos valores para esa curva?
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
d) Concluya respecto a la linealidad en la respuesta del detector
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Ayres, G. 1949. "Evaluation of Accuary in Photometric Análisis". Anal.
Chem., 21.

41
2. Frings, C.S. and L. A. Broussard. 1979. Calibration and monitoring of
Spectromenters and Spectrophotometers. Clin Chem. 25(6): 1013-1017.
3. Kaplan, L.A., and A.J. Pesce 1992. "Química clínica: Técnicas de laboratorio
de fisiología Métodos de análisis". Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires,
Argentica, pp. 60-72.
4. Lee, L.W. 1978. Elementary Principles of Laboratory Instruments. 4a ed.
The C.V. Mosby Company, pp. 59 –73.
5. Manual de Operaciones del espectrofotómetro, Milton Roy Company, Serie
Spectronic 20. 1991. Analítica Products División. Rochester N.Y:
6. Willard H.; L. L. Merritt; J.A. Dean and F.A. Settle Jr. 1991. "Métodos
instrumentales de Análisis" Grupo Editorial Iberoamérica., México, D.F., 883
pp.
7. Milton Roy Filter Kit For the SPECTRONIC 20 and 20D
Spectrophotometers. 1991. Milton Roy Co., Rochester, N.Y.

42
 PRÁCTICA 7: ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL
ESTABLECIMIENTO DE UN MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO

INTRODUCCIÓN
Durante el diseño de un método espectrofotométrico hay que considerar
que en la determinación de sustancias se pueden presentar dos casos: o son
incoloras o bien, tienen una absortividad muy baja. En ambos casos es
conveniente, para su análisis, la realización de una reacción química entre el
material de interés y un cromógeno para producir un cromóforo con una
absortividad tal, que permita su determinación fotométrica de manera
adecuada.
Para el establecimiento de un método espectrofotométrico es importante
seleccionar la longitud de onda de trabajo en función del cromóforo producido
por la reacción, determinar el efecto que tiene la temperatura, el pH, la
concentración del cromógeno, y observar como afecta la presencia de
sustancias extrañas al desarrollo de color. También, debe establecerse el
tiempo óptimo para la producción total del color y el intervalo de tiempo en que
este es estable. De esta forma se conocen los factores que afectan el color
desarrollado y se podrán controlar, para que la transmitancia dependa
solamente de la concentración.
Con la elaboración de una curva de calibración, y el tratamiento
adecuado de estos datos espectrofotométricos, se podrá verificar el
cumplimiento de la ley de Bouger-Beer, obtener el intervalo útil de
concentración, la sensibilidad, el error fotométrico del método con el
instrumento (calculado por el método de Ringbom) y el límite de detección
(LDD), que se puede definir como la concentración de analito que proporciona
una seña igual a la señal del blanco, YB más dos veces la desviación estándar
del blanco, SB.
Y= YB + 3SB (1)
Aunque la mayoría de los instrumentos que se emplean en la región
visible (400-700 nm) se suministran con sus propias celdas, tienen un
adaptador que permite utilizar tubos comunes de laboratorio de dimensiones
apropiadas que se pueden seleccionar para usarlo como cubetas en el
espectrofotómetro. Para el uso de éstos, deberá verificarse que posean

43
superficies ópticas equivalentes (libres de imperfecciones en el vidrio) y
diámetro interno equivalente, de tal manera que el paso de luz en todos los
tubos sea el mismo.
OBJETIVOS
 Seleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas
para el espectrofotómetro Baush and Lomb.
 Analizar algunos de los parámetros que intervienen en el
establecimiento de un método espectrofotométrico para establecer las
condiciones óptimas de trabajo.
MATERIAL Y APARATOS
1. Gradilla
2. Veinticinco tubos de ensaye de 13 X 100 mm
3. Veinticinco tubos de ensaye de 18 X 150 mm
4. Una pipeta de 0.1 ml (graduadas en milésimas)
5. Dos pipetas de 1 ml (graduada en centésimas)
6. Dos pipetas de 5 ml (graduadas en décimas)
7. Dos pipetas de 10 ml (graduadas en décimas)
8. Un vaso de precipitados de 100 ml
9. Un espectrofotómetro para la región visible
10. Papel indicador de pH
11. Plástico autoadherente
12. Una propipeta
13. Balanza analítica

PROCEDIMIENTO
I. SELECCIÓN DE TUBOS PARA SER USADOS COMO CUBETAS
a) Selección de tubos que tengan superficies ópticamente equivalentes
En primer lugar se deben seleccionar tubos que tengan superficies
equivalentes, es decir, que el vidrio posea una superficie homogénea y paredes
de igual grosor en toda la circunferencia del tubo; para ello se debe:
1. Seleccionar la longitud de onda adecuada; en el caso particular de esta
práctica, 400 nm es la indicada para usarse en la selección de cubetas.
2. Adicionar un mínimo de 5 ml de agua destilada a 25 tubos de la misma
medida y marca comercial, previamente lavados. No usar escobillón

44
 para evitar rayarlos. Limpiarlos cuidadosamente evitando que queden
sucios, con polvo o huellas digitales.
3. Escoger un tubo que será utilizado como blanco, el cual debe tener
pared óptica y diámetro interno muy semejante a la mayoría. Ajustar el
espectrofotómetro a cero, colocar el tubo y llevar la escala de
transmitancia a una lectura de 95 %T. Marcar una línea vertical en el
extremo superior del tubo, alineada exactamente con la marca
correspondiente del receptáculo de la cubeta, para colocarlo siempre en
la misma posición. Numerarlo como No.1.
4. Colocar otro tubo en el espectrofotómetro, si es necesario, girarlo
lentamente hasta hallar una posición donde una pequeña rotación no
haga variar la lectura del aparato en ±2 %T. Marcar una línea vertical
igual que en el anterior y numerarlo como No. 2.
5. Repetir el paso 4 con cada uno de los tubos, numerándolos y anotando
la lectura de %T. Anote los resultados en la Tabla 5.
6. Seleccionar 15 de los tubos anteriores que den lectura de 95 ± 2 %T,
cuando se colocan en la posición marcada.
b) Selección de tubos con diámetro equivalente.
Para que los tubos anteriores puedan ser usados como cubetas, además,
poseer diámetro interno equivalente. De acuerdo con la ley de Bouger y Beer,
la absorbencia de una solución es proporcional tanto a la concentración del
soluto, como al grosor de la solución o paso de luz. Con objeto de relacionar la
absorbencia directamente con la concentración de una serie de muestras, es
necesario conocer el paso de luz y mantenerlo constante para todas las
mediciones, requisito que se cumple seleccionado tubos que tengan diámetro
interno equivalente.
1. A los 15 tubos seleccionados, con pared ópticamente se les adicionan 5
ml de una solución de NiSO4 al 4 %. Se escoge una solución de esta
concentración con el fin de que pequeñas variaciones en el paso de luz
causen variaciones relativamente grandes en la absorbencia observada.
2. Ajustar el espectrofotómetro al 100 %T, usando agua destilada como
blanco. Colocar cada tubo en la posición marcada y anotar la lectura de
%T a 400 nm.
3. Seleccionar 10 tubos que den lecturas que no varíen más de 2 %T. Para

45
 conservar los tubos seleccionados estos deberán guardarse envueltos
en papel suave.
II. FACTORES QUE AFECTAN EL DISEÑO DE UN MÉTODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO
a) Estabilidad del color en función del tiempo
Preparar dos tubos como se indica en la tabla 1, tapar con plástico
autoadherente, mezclar y leer en el espectrofotómetro a 480 nm a los 0, 30, 60,
90 y 120 minutos de efectuada la reacción, usando el tubo 1 como blanco para
ajustar a 100 %T.
Tabla 1. Preparación de las soluciones para el estudio de la estabilidad
del color en función del tiempo.
Tubo No. FeCl3 0.00025 M Agua destilada NH4SCN 0.5 M
(ml) (ml) (ml)
1 0 19.7 0.3
2 5 14.7 0.3

NOTA: Cada vez que realice la reacción entre Fe3+ y SCN lea inmediatamente
después de agregar el NH4SCN

b) Efecto de la concentración del cromógeno.

Preparar la siguiente serie de tubos y leerlos, uno por uno, al momento de
agregar NH4SCN.

46
 Tabla 2. Preparación de las soluciones para el estudio del efecto de la
concentración del cromógeno
Tubo No. FeCl3 0.00025 M Agua destilada NH4SCN 0.5 M
(ml) (ml) (ml)
1 0. 9.70 0.3
2 3 6.27* 0.03*
3 3 6.92* 0.08*
4 3 6.70 0.3
5 3 6.0 1.0
6 3 5.0 2.0
7 3 4.0 3.0
8 3 3.0 4.0
9 3 2.0 5.0

c) Efecto del pH sobre la reacción entre Fe 3+ y SCN.

Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla 3. Al igual que en
experimento anterior, el desarrollo de color se deberá hacer tubo por tubo y
leerse inmediatamente, usando como blanco el tubo 1.

Tabla 3. Preparación del estudio del efecto del pH

Tubo FeCl3 0.00025 HCl Concentrado NaOH 4 M Agua destilada NH4SCN
No. M (ml) (ml) (ml) (ml) [Link]
(ml)
1 0.0 - - 9.8 0.2
2 4.0 0.8* - 5.0 0.2
3 4.0 0.10* - 5.7 0.2
4 4.0 - - 5.8 0.2
5 4.0 - 0.05* 5.75 0.2
6 4.0 - 0.10* 5.7 0.2

NOTA: El HCI y NaOH se agregan en la campana de extracción, usando una

propipeta. Medir el pH en todos los tubos excepto el blanco, empleando papel
indicador, después de hacer las lecturas en le espectrofotómetro. En la

47
medición de los volúmenes marcados con* emplear pipetas de 0.1 ml.
d) Efecto de algunos aniones sobre el color producido
1. Preparar un blanco de reactivos con 0.2 ml de solución saturada de
tiocianato de amonio y 9.8 ml de agua destilada. Ajustar el
espectrofotómetro a 100 % T.
2. En una vaso de precipitados de 100 ml, adicionar 12 ml de solución de
cloruro férrico 0.00025 M, 0.6 ml de solución saturada de tiocianato de
amonio, 0.43 ml de HCI concentrado (con pipeta) y 17 ml de agua
destilada.
3. Colocar 5 ml de solución colorida en cuatro tubos deferentes y leer
cualquiera de los tubos al espectrofotómetro, esta lectura se considera
como la inicial. Agregar inmediatamente 10 mg de fluoruro de sodio,
agitar y leer en el espectrofotómetro a 480 nm. Repetir esta operación
con tartrato de sodio, oxalato de sodio y fosfato de potasio.
e) Curva de calibración
La curva de calibración es útil para la determinación de la sensibilidad del
método, la gama útil de concentración, la escala útil del aparato y el límite de
detección del método. Para realizarla, se debe preparar una serie de tubos de
acuerdo a la tabla 4, tomando las precauciones que a continuación se
mencionan.
1. Agregar todos los reactivos, excepto el NH4SCN
2. Adicionar el NH4SCN al tubo 1, mezclar y leer a 480 nm en el
espectrofotómetro previamente ajustado a cero de absorbencia (100 %T)
3. Agregar NH4SCN al tubo No. 2, mezclar y leer inmediatamente. Repetir el
procedimiento con los demás tubos.
Tabla 4. Preparación de la curva de calibración
Tubo FeCl3 0.00025 M Agua destilada NH4SCN 0.5 M
No. (ml) (ml) (ml)
1 0.0 19.7 0.3
2 0.1 19.6 0.3
3 0.25 19.45 0.3
4 0.5 19.2 0.3
5 1.0 18.7 0.3

48
 6 1.5 18.2 0.3
7 3.5 16.2 0.3
8 5.5 14.2 0.3
9 7.5 12.2 0.3
10 9.5 10.2 0.3
11 11.5 8.2 0.3
12 13.5 6.2 0.3
13 15.5 4.2 0.3

DATOS EXPERIMENTALES E INORME

1.- Resultados de la selección de tubos
Completar la tabla 5.
Tabla 5. selección de tubos comunes para usarlos como celdas
Tubo No. %T400 Tubo No. %T400
(H2O) (NiSO4)
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
13 13
14 14
15 15

2. Curva de calibración
Complete la tabla 6.

49
 Tabla 6. curva de calibración de Fe 3+ por el método de NH4SCN
Tubo No. Fe 3+ A 480 A ajustada por
(μg/ml) regresión lineal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Con los resultados anteriores construya la curva de calibración (gráfica 1)

colocando en el eje de las abscisas la cantidad de ión férrico y en el eje de las
ordenadas las lecturas de absorbencia a 480 nm.
a) ¿Sigue esta reacción la Ley de Bouger y Beer?
Explique.________________________________________________________
_______________________________________________________________
b) Comente a cerca de la sensibilidad del método, el intervalo de concentración
y escala útil del aparato. Señale estos datos en el gráfico. ________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
c) Una línea recta calculada por regresión lineal, además de utilizarse para
tener la concentración de analitos de interés, se puede usar en la
determinación del límite de detección de un método analítico, a partir de la
ecuación.
Y= YB + 3SB (1)
Donde:

50
Y= Señal instrumental o medida de absorbencia, en este caso, que produce la
concentración mínima detectable.
YB = Medida de absorbencia del blanco que corresponde a la ordenada al
origen, a, de la recta de regresión, así YB = a
SB = es la desviación estándar del blanco y puede hacerse igual a S y/x, que es
la desviación estándar de los residuos de y, por medio de la ecuación (2)
2

Sy/x = Σ(y-ŷ1)2
(n-2)
Se ocupan los residuos de y, (y1 -i), donde los valores de i equivalen a los
puntos sobre la recta de regresión lineal calculada, son los valores de y
"ajustados" y se obtienen fácilmente a partir de la ecuación de regresión lineal.
Para obtener el LDD de un método analítico se calcula el valor de y de la
ecuación (1), posteriormente, a partir de la ecuación de la recta de regresión
lineal del método en estudio.
Y= mx+b
Se obtiene la concentración mínima detectable.
d) Método de Ringbom para determinar el %Ep
Complete la tabla 7. Con estos datos construya la gráfica de Ringbom (gráfica
2); Colocando en el eje de las abscisas el logaritmo de las respectivas
concentraciones de ión férrico y en el eje de las ordenadas, la absorbencia de
cada tubo. Determine el intervalo de concentración y la escala de A del aparato
para error fotométrico mínimo, y el porcentaje de error fotométrico (% E p) para
este método.
Tabla 7. Datos para aplicar el método de Ringbom en la determinación
de Fe3+ por el método del SCN
Fe3+ Absorbencia
3+
Tubo No. (μg/ml) Log Fe A 480 %T 100 - % T
1
2
3
4
5

51
 6
7
8
9
10
11
12
13

3. Efecto del tiempo en la estabilidad del color

Complete la tabla 8
Tabla 8. Estabilidad del color respecto al tiempo
Tiempo A 480
(min)
0
30
60
90
120

Construir una gráfica (gráfica 3) colocando el tiempo de reposo en el eje de las

abscisas y las lecturas de absorbencia, en el eje de las ordenadas.
Con base en los resultados obtenidos, conteste:
a) ¿Es estable el color?
b) ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas? Explique porqué.
4.- Efecto de la concentración del cromógeno
Complete la tabla 9
Tabla 9. Efecto de la concentración de SCN en la determinación de Fe3+
Tubo No. SCN Fe SCN-/Fe3+ A 480
(μg/ml) (μg/ml) (μg/ml)
1
2
3

52
 4
5
6
7
8
9

Colocando los valores de la relación SCN-/Fe 3+

en el eje de las abscisas y las
lecturas de absorbencia en el eje de las ordenadas, construya la gráfica 4
De acuerdo a la gráfica, ¿Qué concentración de tiocianato se recomienda?
Explique porqué. _________________________________________________
3+
5. Efecto del pH en el desarrollo de color de la reacción entre el Fe y el SCN-
Complete la tabla 10
Tabla 10. Efecto del pH
Tubo No. pH A 480
1
2
3
4
5
6

Construya la gráfica 5 con los valores de pH en el eje de las abscisas y las

lecturas de absorbencia en el eje de las ordenadas.
a) ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?
b) ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectúe la reacción Fe3+ y el
SCN?
6. Efecto de algunos aniones sobre la absorbencia absoluta
Complete la tabla 11.
Tabla 11. Efecto de algunos aniones en la reacción Fe3+ y el SCN-
Anión A 480 inicial A 480 final
Fluoruro
Oxalato

53
 Tartrato
Fosfato

a) ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción entre el ión

férrico y el tiocianato?
b) ¿A qué se debe ese efecto?
7. Parámetros óptimos para el método del sulfocianuro de amonio para
determinar fierro férrico.
Con los resultados obtenidos en todos los experimentos, complete la tabla 12
Tabla 12. Condiciones óptimas para la determinación de Fe3+ con NH4SCN
Parámetro Valor óptimo
pH
Tiempo
Concentración de SCN-
Límites de concentración con % Ep mínimo
Aniones que interfieren (en orden creciente)
Límite de detección del método (LDD)

DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Ayres. G. H. 1970. Análisis Químico Cuantitativo. 2a. Ed., Ed. Harta. S.A.
México, D.F.., pp. 459-514
2. Long, G.L. and J.D. Winefordner. 1983. Limit of Detection: A closer Look at
the IUPAC Definition. Anal. Chem. 55: 712A
3. Kolthoff, I.M. and E.B. Sandel. 1952. Textbook of Cuantitative Inorganic
Analysis. The McMillan Co., New York, pp. 613-627

54
4. Rielley, C.N. and D.T. Sawyer. 1961. Experiments of Instrumental Methods.
McGraw Hill Co. Inc., New York, pp. 133-139
5. Sandell, E.N. 1959. Colorimetric Determination of Traces of Metals.
Interscience Publishers Ic., New York, pp. 524-537
6. Miller, J. L. and J.N. Miller. 1993. Estadística para Química Analítica. 21 ed.,
Addison- Wesley Iberoamericana. Pp. 86-121
7. Clark, R.C. 1997. A Stopped-Flow Kinetics Experiment for Advanced
Undergraduate Laboratories: Formation of Iron (Ill) Thiocyannate. J. Chem.
Ed. 74(10): 1214

55
 PRÁCTICA 8: ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE UN SISTEMA
MÚLTIPLE

INTRODUCCIÓN
Partiendo de la ley de Bouger y Beer, se tiene que la absorbencia es
proporcional al número de partículas efectivas que absorben la radiación
electromagnética a una longitud de onda específica, esto implica que si en la
solución hay más de una especie absorbente o cromóforo y éstas no
reaccionan entre sí, cada especie absorberá como si las otras no estuvieran
presentes, esto es, la absorbencia total, a una determinada longitud de onda
(λl) para dos A y B, en la mezcla, es:
AT(λl) = A (Aλl) + AB(λl) (1)
Esta ecuación afirma que la absorbencia en un sistema múltiple es una
propiedad aditiva y supone que no hay interacción química entre los
cromóforos. La adición de las absorbencias es importante en el análisis de
mezclas, por ejemplo, en la cuantificación simultánea de dos o más sustancias
en la misma solución. En este tipo de determinaciones, es requisito
indispensable que las longitudes de onda máxima de los componentes no sean
demasiado cercanas entre sí. Las longitudes de onda de trabajo se seccionan a
partir de los espectros de absorción de cada uno de los componentes del
sistema, y serán aquellas en las que un compuesto presente su máxima
absorción (λmax), y el otro no presente absorción o ésta sea mínima. De la
ecuación 1 podemos decir que la absorbencia total del sistema a λ l es:
AT(λl) = a m A (λl ). bC mA + a mB (λl) . bC mB. (2)
La absorbencia total a λ2 es:
AT(λ2) = a m A (λ1). bC MA + a mB (λ2). bC mB. (3)
Las absortividades molares, am, de A y B a λl y λ2 se calcula a partir de curvas
de calibración de los cromóforos A y B a las dos longitudes de onda. Para
determinar CmA y CmB, se resuelven simultáneamente las ecuaciones de 2 y 3.
OBJETIVO
 Determinar constantes fotométricas para aplicarlas en el cálculo de la
concentración de los componentes de un sistema múltiple para
comprobar la ley de aditividad.

56
MATERIALES Y APARATOS
1. Una gradilla
2. Veinte tubos de ensaye de 18 X 150 mm
3. Una pipeta de 1 ml (graduada en centésimas)
4. Dos pipetas de 5 ml (graduada en décimas)
5. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
6. Un vaso de precipitados de 100 ml
7. Espectrofotómetro para la región visible
8. Cubetas para el espectrofotómetro
PROCEDIMIENTO
1. DETERMINACIÓN DE LAS LONGITUDES DE ONDA DE TRABAJO (λl y λ2)
Obtener los espectros de absorción de las soluciones tipo de K 2Cr2O7 0.0016M
y KMnO4 0.0004 M, leyendo entre 340-600 nm en intervalos de 10, contra un
blanco de H2SO4 0.5 M. Seleccionar la longitud de onda de trabajo para cada
solución, considerando que la absorbencia sea máxima para un componente y
mínima para el otro.
2. OBTENCIÓN DE LAS ABSORTIVIDADES MOLARES DE CADA
COMPONENTE A LAS DOS LONGITUDES DE ONDA SELECCIONADAS (λl y
λ2)
Realizar curvas de calibración de K2Cr2O7 y KMnO4 midiendo la absorbencia de
seis diluciones (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 y 1:7) en H2SO4 0.5 M de cada sustancia,
a cada una de las longitudes de onda seleccionadas, utilizando como blanco
H2SO4 0.5 M
3. COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ADITIVIDAD
Medir la absorbencia de las mezclas que se indican en la tabla 1, contra un
blanco que contenga 5.0 ml de agua destilada y 5.0 de H2SO4 0.5 M
Tabla 1. Preparación de las mezclas para la comprobación de la ley de
aditividad
Mezcla No. K2Cr2O7 0.0016 M KMnO4 0.0004 M H2SO4 0.5 M H2O
(ml) (ml) (ml) (ml)
1 5.0 1.0 0.2 3.8
2 2.5 2.5 0.2 4.8
3 1.0 5.0 0.2 3.8

57
4. DETERMINACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL SISTEMA MÚLTIPLE.
Medir la absorbencia de la solución problema a λl y λ2
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
1. Espectros de absorción de las soluciones tipo de K2Cr2O7 0.0016 M y de
KMnO4 0.0004 M
Tabla 2. Valores de absorbencia para construir los espectros de
absorción de K2Cr2O7 y KMnO4
Longitud de onda A A
(nm) K2Cr2O7 KMnO4
340
350
360
370
380
390
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
570

58
 580
590
600

Con los datos anteriores construya los espectros de absorción del K 2Cr2O7 Y
KMnO4 en la misma gráfica (gráfica 1)
a) A partir de sus espectros de absorción, escoja la longitud de onda de
máxima absorbencia para el dicromato de potasio (λl) y la de máxima
absorbencia para el permanganato de potasio (λ2). Con estos datos llena la
tabla 3.
Tabla 3. Valores de λmax para K2Cr2O7 y KMnO4
Compuesto λmax
K2Cr2O7 λl
KMnO4 λ2
b) ¿Porqué se escogen estas longitudes de onda y no otras?
2. Curvas de calibración, ajustadas por regresión lineal, de K2Cr2O7 y
KMnO4 a las dos longitudes de onda seleccionadas. Con los datos
obtenidos complete la Tabla 4.
Tabla 4. Curvas de calibración de K2Cr2O7 y KMnO4 a λl y λ2
Compuesto Dilución Concentración A λl A λ2
Molar (CM)
1:7
1:6
K2Cr2O7 1:5
1:4
1:3
1:2
1:7
1:6
KMnO4 1:5
1:4
1:3
1:2

59
a) En la misma gráfica, construya las curvas de calibración, para cada
compuesto a las dos longitudes de onda, colocando en el eje de las ordenadas
la absorbencia y en el de las abscisas la concentración molar (gráficas 2 y 3).
b) A partir de las curvas anteriores, utilizando la fórmula de la ley de general de
fotometría, determine los valores de a,,, para cada sustancia a las dos
longitudes de onda seleccionadas (λl y λ2) y complete la Tabla 5. Escriba sus
cálculos.
Tabla 5. Valores de am para K2Cr2O7 y KMnO4 a λl y λ2
Absortividad Sustancia
K2Cr2O7 KMnO4
am a λl
am a λ2
3. Comprobación de la Ley de la aditividad en un sistema múltiple.
Con los datos obtenidos en este experimento complete el siguiente cuadro.
Tabla 6. Valores de CM y absorbencia en las mezclas de K2Cr2O7 y KMnO4
CM CM A Observada
Mezcla No. K2Cr2O7 KMnO4 λl λ2
1
2
3

a) A partir de la Ley general de la fotometría, obtenga la absorbencia calculada

de cada mezcla a las dos longitudes de onda (λl y λ2). Compare los valores con
los de la Tabla 6 y complete la tabla 7.
Escriba todos sus cálculos
Tabla 7. Valores absorbencia observados y calculados de absorbencia de
las mezclas de K2Cr2O7 y KMnO4
Mezcla No. A Calculada A Observada
λl λ2 λl λ2
1
2
3

60
b) Para la verificación adecuada del seguimiento de la ley de aditividad, calcule
el valor de r y r2 a a λl y λ2, considerando como variable independiente las
absorbencias calculadas y como variable dependiente, las absorbencias
observadas. Explique si se cumple la ley de la aditividad.
4. Determinación de la concentración de K2Cr2O7 y KMnO4 en la solución
problema.
No olvide anotar el número del problema y escribir sus cálculos.
A λl = A λ2=
CM del K2Cr2O7 = CM del KMnO4 =
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Harley, J.H. and S.E. Wiberley. 1954. Instrumental Analysis. John Wiley,
New York.
2. Willard, H.; L.L Merritt; J.A. Dean and F.A. Settle Jr. 1991. "Métodos
instrumentales de Análisis". Grupo Editorial Iberoamérica., México, D.F.,
883 pp.

61
 PRÁCTICA 9: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS (MÉTODO DE KUNITZ)
INTRODUCCIÓN
Las proteasas son enzimas que tienen gran importancia desde el punto
de vista científico, nutricional e industrial. Las enzimas proteolíticas son una
herramienta que usa el bioquímico para estudiar la estructura de las proteínas.
Industrialmente las proteasas son de gran valor pues, merced a ellas, se
pueden obtener péptidos y aminoácidos de aplicación en la industria de los
alimentos. Desde el punto de vista alimenticio, las enzimas proteolíticas tienen
un amplio uso tanto como ablandadores, como en la modificación de proteínas
alimenticias que pueden inducir mejores sabores.
Uno de los métodos más utilizados en la determinación de la actividad
de las enzimas proteolíticas es el Kunitz, que se basa en medir la cantidad de
péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis aprovechando la
capacidad, de algunos de ellos, de absorber selectivamente a 280 nm.
OBJETIVO
 Elaborar una curva estándar de actividad enzimática para determinar la
actividad proteolítica de la bromelaína, de la papaína y otras proteasas.
MATERIAL Y APARATOS
1. Una gradilla metálica
2. Dieciocho tubos de ensaye de 13 X 100 mm
3. Dieciocho tubos de ensaye de 18 X 150 mm
4. Un termómetro
5. Cinco pipetas de 1.0 ml (graduada en centésimas)
6. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
7. Un matraz aforado de 200 ml
8. Cuatro matraces aforados de 50 ml
9. Dos matraces Erlenmeyer de 1 l
10. Baño María a 35 ºC
11. Centrífuga
12. Es pectrofotó metro UV
13. Cubetas de cuarzo para espectrofotómetro
14. Camisas para centrífuga para tubos de 13 X 100 mm
15. Potenciómetro

62
PROCEDIMIENTO
a)En tubos de 13 X 100 mm, se preparan las series que se indican abajo y se
marcan de la siguiente forma:
Tubos
problema 1 2 3 4 5 I II III IV
Tubos testigo T1 T2 T3 T4 T5 TI Tll TIII TIV
b) Medir 1.0 ml de la solución de enzima, de las diferentes concentraciones, de
la siguiente manera:
Tubos:
T1 y 1 solución de tripsina 0.04 mg/ml
T2 y 2 solución de tripsina 0.08 mg/ml
T2 y 2 solución de tripsina 0.12 mg/ml
T3 y 3 solución de tripsina 0.16 mg/ml
T4 y 4 solución de tripsina 0.20 mg/ml
TI y I solución de bromelaína dil 1:10
Tll y II solución de bromelaína dil 1:20
TIII y Ill solución de ablandador de carne
TIV y IV solución de proteasa
3. Preincubar los tubos en baño María a 35 ºC.
4. Después de 5 min, agregar, únicamente a los tubos problema, 1.0 ml de la
solución de caseína al 1 % (preincubada a 35 °C por 5 min) en intervalos de un
minuto. Agitar perfectamente cada tubo e incubar en baño María a 35 °C
durante 20 minutos.
5. Al término de la incubación agregar, a los tubos problemas (1,2,3,4,5, I, II, Ill,
IV) en intervalos de un minuto, 3 ml de ácido tricloroacético al 10 % y agitar
vigorosamente. A los tubos testigo( T1, T2, T3, T4, T5, TI, TII,TIII y TIV) se les
agregan 3 ml de ácido tricloroacético al 10 % y 1.0ml de caseína al 1 % (que se
ha mantenido 20 minutos a 35 ºC). Agitar, sacar del baño María, dejar reposar
30 minutos y homogeneizar perfectamente cada tubo. Centrifugar a 2000 rpm
durante 20 minutos.
6. Determinar, en el sobrenadante de los tubos testigo y problema, los valores
de absorbencia a 280 nm, ajustando con un blanco de reactivos que deberá
contener 1.5 ml de ácido tricloroacético al 10 % y 1.0 ml de agua destilada.

63
Corregir el valor de absorbencia de cada problema, restándole el valor de
absorbencia del testigo correspondiente.
CONSTRUCCIÓN DE GRÁFICAS Y CÁLCULOS
1)Curva de actividad enzimática para la tripsina
Con las lecturas de absorbencia corregidas y los mg/ml de tripsina,
considerando la dilución, se construye la curva de actividad de tripsina.
2) Actividad especifica de la tripsina. La unidad tríptica se define como:
"LA CANTIDAD DE ENZIMA QUE ORIGINA, BAJO LAS CONDICIONES
EXPERIMENTALES DESCRITAS, UN AUMENTO DE UNA UNIDAD DE
ABSORBENCIA A 280 nm, POR MINUTO DE DIGESTIÓN"
Se designa como
cas

UT
mg

La actividad específica de la muestra de tripsina usada se obtiene dibujando

una línea recta tangente a la primera parte de la curva de actividad enzimática
(1). Enseguida se aplica la siguiente ecuación:
cas

UT = pendiente de la recta
mg
20
que nos da las unidades trípticas para caseína por miligramo de la tripsina
usada, por minuto de digestión.
3) Curva de actividad enzimática específica
Conociendo la actividad específica de la tripsina usada, se construye otra
gráfica en la que, en el eje de las ordenadas, se coloca la A280 corregida y en
las abscisas se coloca la actividad específica en unidades tríptícas. Los datos
de esta nueva curva son independientes de la muestra de tripsina usada, por lo
cual se puede utilizar como una curva estándar general para la determinación
de actividad proteolítica, manteniendo las mismas condiciones experimentales
de pH, temperatura, etc.
4) Determinación de la actividad proteolítica específica de las muestras
problema.
Interpolar los valores de A280 corregida de cada muestra en la curva estándar y
estimar las unidades trípticas.

64
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
1. Curva de actividad enzimática. Complete la tabla 1.
Tabla 1. Actividad enzimática de la tripsina
Tubo No. Concentración de A280 A280 corregida
Tripsina (mg/ml) Problema Testigo
T1 y 1
T2 y 2
T3 y 3
T4 y 4
T5 y 5
PROBLEMAS
TI y I Bromelaína 1:10
Tll y II Bromelaína 1:20
TIII y Ill Ablandador
TIV y IV Sol. de proteasa
Construir la curva de actividad enzimática de tripsina (gráfica 1), colocando en
el eje de las ordenadas la absorbencia corregida a 280 nm y en el de las
abscisas la concentración de tripsina (mg/ml).
b) ¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina, incluya los
cálculos?
[Link] de actividad enzimática específica.
Complete la tabla
Tabla 2. Curva estándar para la digestión de caseína por tripsina
Tubo No. Unidades Trípticas A280 corregida

a) Haga el gráfico de actividad enzimática estándar, colocando en las

ordenadas la A280 corregida y en las abscisas las unidades trípticas (gráfica 2).
Indique la actividad, en unidades trípticas por gramo de muestra, de la piña

65
(bromelaína), el ablandador (papaína) y la solución de proteasa. Incluya los
cálculos.
4. Preguntas adicionales.
a)Defina actividad enzimática y actividad enzimática
específica._______________________________________________________
______________________
b) Escriba la clasificación de las proteasas y diga en qué grupo se ubican las
determinadas en la práctica, en función de su mecanismo de acción.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
c) ¿Para qué se adiciona cisteÍna en la muestra de piña, y de ablandador? (ver
preparación de reactivos)__________________________________________
_______________________________________________________________
d)¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina? _____________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Kunitz, M. 1947. J. Gen. Physiol., 30: 291
2. Northrop, J. N. M. Kunitz, and R. M. herriot. 1948. Crystalline Enzymes.
Columbia University Press, New York, pp. 307-310.
3. Whitaker, John R. 1972. Principles of Enzimology for the Food Sciences.
Mercel Dekker, Inc., New York, U.S.A., pp.636

66
 PRÁCTICA 10: TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA CAPACIDAD DE
INTERCAMBIO DE UN INTERCAMBIADOR IÓNICO

INTRODUCCIÓN
Un intercambiador iónico es un polielectrolito (polianión o policatión)
insoluble. Está constituido por una matriz, un ión fijo y un ión móvil. Los
intercambiadores pueden ser naturales, semisintéticos y sintéticos. Estos
últimos se utilizan en las separaciones cromatográficas de moléculas de bajo
peso molécular, por ejemplo aminoácidos.
Las matrices de los intercambiadores sintéticos más comunes se
preparan por la copolimerización de estireno y divinilbenceno (DVB) o
poliacrilatos y divinilbenceno; este último se incluye como agente para el
entrecruzamiento, obteniéndose redes tridimensionales, porosas, a las que se
les une covalentemente un grupo químico ionizable.
La síntesis de estas redes tridimensionales se controla de tal forma, que
se obtienen intercambiadores química y físicamente estables; así como de
tamaño, forma, porosidad y composición química uniformes.
Los intercambiadores fónicos tienen propiedades tales como:
a) Grado de entrecruzamiento
b) Tamaño de partícula
c) Selectividad
d) Capacidad de intercambio
Esta última es una propiedad muy importante definida como: "La cantidad de
grupos cargados, expresada en miliequivalentes, que se intercambian por
gramo de intercambiador seco".
Una característica importante de los intercambiadores fónicos, es que se
pueden utilizar casi indefinidamente después de ser sometidos a un proceso
cíclico de regeneración, siempre y cuando las condiciones de intercambio y del
proceso de regeneración sean lo menos drásticas posible, pues cambios
bruscos en la temperatura y el pH de trabajo afectan la estabilidad y duración
de los intercambiadores.
OBJETIVO:
 Efectuará el tratamiento preliminar de un intercambiador iónico para
determinar la capacidad de intercambio iónico del mismo.

67
MATERIAL Y APARATOS
1. Un vaso de precipitados de 100 ml
2. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
3. Un matraz Erlenmeyer de 250 ml
4. Una bureta de 25 ml (graduada en décimas)
5. Una probeta de 50 ml
6. Un soporte universal
7. Una pinza para bureta
8. Un embudo de vidrio
9. Papel indicador de pH
10. Papel filtro
11. Balanza analítica
12. Un recipiente para pesar
PROCEDIMIENTO
A. TRATAMIENTO PRELIMINAR
1. Pesar 1 g de intercambiador Merck I y colocarlo en un vaso de precipitados
de 100 ml.
2. Hacer tres lavados con agua destilada de 10 ml cada uno

NOTA: si la resina es nueva, antes de tratarla con NaOH 1 N, deben hacerse 2

lavados con una mezcla de alcohol-acetona en proporción 1:3
3. Tratar dos veces con NaOH 1 N, empleando 10 ml de la solución cada vez
4. Realizar quince lavados con proporciones de 10 ml de H2O destilada.
5. Medir el pH del agua destilada y del agua de lavado; si son iguales
continuar con el tratamiento con HCI; de no ser así, seguir lavando hasta
igualarlos.
6. Efectuar dos tratamientos con 10 ml de HCI 1 N, cada uno.
7. Hacer veinticinco lavados con H2O destilada, empleando 10 ml de ésta en
cada ocasión.
8. Tomar el pH del agua destilada y el del agua de la solución de lavado, si
son iguales continuar con el siguiente paso, en caso contrario, lavar con
H2O destilada hasta que sean iguales.
9. Filtrar el intercambiador a través de papel Whatman 42, previamente
pesado. No olvide anotar la masa del papel filtro.

68
10. Colocar el intercambiador filtrado en un recipiente adecuado y secar a 37 ºC
en el cuarto estufa.
11. Pesar el intercambiador seco y obtener el porcentaje de intercambiador
recuperado.
B. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE INTERCAMBIO
1. Pesar 0.5 g de intercambiador Merck I regenerado y colocarlo en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml.
2. Agregar 50 ml de NaCI 1 M y dos gotas de fenolftaleína.
3. Titular con NaOH 0.1 N hasta el vire de la fenolftaleína a un color rosa
pálido, que debe permanecer al menos por 30 s.
4. Calcular la capacidad de intercambio con la ecuación:
capacidad = XV = meq
M g
donde:
X = Normalidad exacta de la solución NaOH
V = Volumen de NaOH empleado en la titulación
M = Masa de resina utilizada
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
A. PORCENTAJE DE INTERCAMBIADOR RECUPERADO
1. Con los datos de la masa del intercambiador, antes y después del
tratamiento, obtenga el porcentaje de intercambiador recuperado.
2. Diga cuál es la razón para determinar este porcentaje:
____________________________________________________________
_____________
3. ¿Cuál es el valor del pH después de los lavados con H2O destilada?___
__________________________________________________________
4. ¿Qué importancia tiene determinar el pH después de los últimos lavados
con H2O destilada?__________________________________________
__________________________________________________________
B. CAPACIDAD DE INTERCAMBIO
1. Obtenga el valor de la capacidad del intercambiador Merck I. Incluya
cálculos.
2. ¿Cuál es la importancia de determinar la capacidad de un
intercambiador?_____________________________________________

69
 __________________________________________________________
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Braithwaite, A. And F. J. Smith. 1985. Chromatographic Methods. 41. Ed.,
Chapman and Hall New York, pp. 98-103
2. Barnard, J. A. and R. Chayen. 1970. Métodos Modernos de Análisis
Químico. Ed. Urmo, Bilbao, pp. 218-227

70
 PRÁCTICA 11: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOÁCIDOS
POR CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO

INTRODUCCIÓN
El intercambiador iónico es un proceso en el que in electrolito problema
es solución se pone en contacto con los grupos iónicos enlazados a un
intercambiador de iónes al que se une reversiblemente, desplazando al ión
móvil. La desorción se puede dar por cambios en la fuerza iónica o el pH del
eluyente.
El proceso de intercambio iónico se puede esquematizar como sigue:

M ____ F-B+
M ____ F-M+ A ____ F-B+
A ____ F-M+ T ____ F-B+
R ____ F-B+
T _____F-M+ + A- B+ I ____ F-B+ + A- M+
R _____F-M+ Z ____ F-B+
I _____F-M+
Z _____F-M+
Donde: F- es el ión fijo, M+ es el ión móvil y A - B+ es un compuesto, con
agua, que se va a separar.
El proceso de intercambio iónico se aplica a la separación de,
prácticamente, cualquier molécula cargada, desde nucleótidos y aminoácidos
hasta proteínas de alto peso molecular.
OBJETIVO:
 Emplear la técnica de intercambio iónico para la separación de dos
aminoácidos y comprobar la separación mediante una reacción colorida
y el perfil de elución.
MATERIAL Y APARATOS
1. Columna de vidrio (1 X 52 cm)
2. 2. Tubos de Hule
3. Varilla larga, de vidrio de 2 mm de diámetro
4. Un vaso de precipitados de 50 ml
5. Un vaso de precipitados de 100 ml
6. Una pipeta de 1 ml (graduada en centésimas)
7. Una pipeta de 10ml (graduada en décimas)
8. Cuarenta tubos de ensaye de 13 X 100 mm

71
9. Cuarenta y dos tubos de ensaye de 18 X 150 mm
10. Una gradilla metálica
11. Una gradilla de plástico
12. Un soporte universal
13. Una pinza para bureta
14. Una pinza Hoffman
15. Espectrofotómetro para la región visible
16. Celdas para espectrofotómetro
17. Potenciómetro
18. Agitador magnético
PROCEDIMIENTO
1. Empaquetamiento de la columna con el intercambiador
Llenar la columna de vidrio con regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25, hasta
aproximadamente 3/4 partes de su capacidad, introducir un disco de lana de
vidrio (previamente humedecida), hasta la base para formar un soporte. De
acuerdo con las instrucciones del profesor, agregar en forma continua y con
agitación, el intercambiador amberlita IRC-50, previamente resuspendido en
regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25 hasta una altura de 35-40 cm. Al mismo
tiempo que se agrega la resina a la columna, se abre la llave para desalojar
regulador lentamente. Dejar sedimentar el intercambiador y ajustar la velocidad
de elución, entre 16 y 20 gotas por minuto. Lavar la columna con regulador de
citratos 0.1 M, pH 5.25, hasta que sea transparente al salir de la columna.
EVITAR QUE SE SEQUE LA COLUMNA DE INTERCAMBIADOR.
2. Aplicación de la muestra
Cuando la altura de la resina ya no varíe, bajar el nivel del regulador hasta
3mm sobre la superficie del intercambiador y agregar 1.0 ml de la mezcla de
aminoácidos (prolina e histidina), lo más cerca posible de la superficie,
procurando no perturbar la superficie del intercambiador. Abrir la llave para
introducir la muestra y comenzar a colectar la primera fracción; cuando la
mezcla esté al ras de la superficie de la resina, agregar 1.0 ml de regulador de
citratos 0.1 M, pH 5.25, resbalando por las paredes. Bajar el nivel del regulador
hasta la superficie de la resina y repetir la operación dos veces más.
3. Elución de la muestra
Llevar el regulador de pH 5.25, hasta una altura aproximada de 7 cm sobre la

72
superficie de la resina, manteniéndola constante durante el proceso de elución.
Eluir 12 fracciones de 3.0 ml cada una, con este regulador. Eluir otras 28
fracciones con regulador de citratos 0.1 M, pH 2.0.
4. Determinación de prolina e histidina
En tubos de ensaye de 18 X 150 mm, colocar 1.0 ml de cada una de las
fracciones colectadas y agregar 1.0 ml de ninhidrina al 0.2 % a cada una.
Preparar dos tubos que servirán como blanco de reactivos para el
espectrofotómetro, colocando en uno de los 1.0 ml de regulador de pH 5.25 y
en el otro, 1 ml de regulador de pH 2.0 y agregar 1.0 ml de ninhidrina al 0.2 %.
Colocar todos los tubos en un baño maría a ebullición durante 20min.
Transcurrido este tiempo dejar enfriar, agregar 3.0 ml de agua destilada y leer
en el espectrofotómetro las fracciones del primer aminoácido a 400 nm y las
restantes a 570 nm, ajustando a 100 % T con los blancos correspondientes.
DATOS EXPERIMENTALES
1. Complete la siguiente tabla.
Tabla 1. Separación de prolina e histidina
Volumen de elución A400 A570
(ml)

73
a) Con los datos obtenidos, construya el perfil de elución colocando en el eje de
las abscisas el volumen de elución y en el de las ordenadas el valor de
absorbencia correspondiente.
b)¿Cuál de los aminoácidos eluyó primero? Explique porqué._____________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
c)¿Cuál sería el efecto de reducir la velocidad de elución?________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

74
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Cooper, Terrance C. 1984. "Instrumentos y Técnicas de Bioquímica" Ed.
Reverté, Barcelona, España, pp. 141-143.
2. Braithwaite, L. And F. J. Smith. 1985. "Chromatographic Methods". 48. Ed.,
Chapman and Hall New York, pp. 98-101
3. Moore, S., D. H. Spackman and W. H. Stein 1958. "Chromatography of
Aminoacids on Sulfonated Poliestyrene Resins" Anal. Chem. 30: 1185.

75
 PRÁCTICA 12: SEPARACIÓN DE GRUPOS USANDO CROMATOGRAFÍA
POR EXCLUSIÓN

INTRODUCCIÓN
Desde los años 60's, se ha desarrollado con gran éxito la técnica de la
cromatografía por exclusión (filtración a través de tamices moleculares,
cromatografía en gel), aplicada a diferentes objetivos tales como: separación,
purificación, o caracterización de biomoléculas. Entre los materiales más
comúnmente utilizados como fase estacionaria para esta técnica están los
geles como el Sephadex, el Bio-Gel A y el Bio-Gel P. El Sephadex es un
biopolímero de dextrana de alto peso moléculas, insoluble en agua y
disolventes orgánicos, con enlaces entrecruzados de epiclorhidrina que forman
una red tridimensional. La cantidad de epiclorhidirna determina el tamaño de
los poros del gel y por lo tanto su comportamiento cromatográfico.
La separación por está técnica, se basa en la diferencia en el tamaño y
la forma de las moléculas componentes de una mezcla. Las moléculas que
puedan penetrar la estructura del gel serán retardadas en éste, mientras que
aquellas mayores que el tamaño del poro del gel serán excluidas, por lo tanto,
serán arrastradas a través de la columna por la fase móvil, eluyendo primero.
Los parámetros que caracterizan la columna del gel en el soporte (lecho
cromatográfico) son:
a) Volumen total (VT), el cual se define como el volumen que ocupa en su
totalidad el lecho cromatográfico.
b) Volumen vacío (Vo), que representa el volumen intersticial entre las esferas
del gel, ocupado por regulador.
c) Volumen del gel (Vg), volumen que ocupa únicamente el gel hinchado y
finalmente,
d) Volumen interno (Vi), volumen ocupado por el regulador en el interior de la
estructura del gel de tal forma que:
VT = Vo + Vg + Vi
Uno de los usos particulares de la cromatografía por exclusión, es la
separación de grupos, llamado también desalación o diálisis inversa que
consiste en la separación de moléculas grandes, que son excluidas del gel, y
moléculas pequeñas que penetran en el gel.

76
OBJETIVO
 Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico
para efectuar la desalación de la albúmina, utilizando la técnica de
cromatografía por exclusión.
MATERIAL Y APARATOS
1. Columna de vidrio de 60 X 2.0 cm
2. Disco de tafeta
3. Lana de vidrio
4. Pipeta Pasteur
5. Gradilla
6. Cuarenta tubos de ensaye de 13 X 100 mm
7. Dos vasos de precipitados de 100 ml
8. Soporte Universal
9. Pinzas dobles para bureta
10. Espectrofotómetro UV- visible
11. Celdas de cuarzo para espectrofotómetro
12. Centrífuga
13. Camisas para centrífuga
14. Horno para secado
15. Una pipeta de 1 ml (graduada en centésimas)
16. Una pipeta de 10 ml (graduada en décimas)
17. Potenciómetro
18. Agitador magnético
PROCEDIMIENTO
1. Empaquetamiento del gel en la columna
La columna de vidrio debe estar en posición vertical; agregar regulador hasta
3/4 partes de la columna e introducir un disco de lana de vidrio y uno de tafeta
(previamente humedecidos). Drenar el regulador, hasta dejar aproximadamente
5 cm. Resuspender 60 ml de Sephadex G-25 sedimentado en regulador, abrir
parcialmente la llave de la columna y añadirlo lenta y continuamente. Dejar
sedimentar para permitir que se empaque el gel, regular a la velocidad de
elución en 12-16 gotas por min. Agregar regulador hasta que no haya variación
en la altura del lecho cromatográfico. Medir y anotar la altura del lecho
cromatográfico y el diámetro interno de la columna. (Figura 1). EL NIVEL DEL

77
REGULADOR NUNCA DEBE ESTAR, POR DEBAJO DE LA SUPERFICIE
DEL GEL Y SU ALTURA SIEMPRE DEBE SER LA MISMA.
2. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna
Drenar el regulador hasta que el menisco esté sobre la superficie del
Sephadex. Cerrar la llave y añadir cuidadosa y suavemente con una pipeta, 0.5
ml de Dextrana Azul 2000 directamente sobre la superficie del Sephadex. Abrir
la llave lentamente para introducir la dextrana y comenzar a colectar la primera
fracción (3 ml). Hacer 3 lavados con 1 ml de regulador Tris- EDTA; elevar la
columna del regulador y eluir con este a una velocidad de 12 a 16 gotas por
min, colectar 14 fracciones de 3 ml cada una, hasta que toda la dextrana azul
haya sido eluída. Leer en el espectrofotómetro todas las fracciones a 615 nm,
ajustando a 100 %T con el tubo 1. El volumen vacío será el volumen de elución
de aquélla fracción que presente mayor absorbencia.
3. Separación del sulfato de amonio de la proteína.
Lavar 25 tubos de 13 X 100 mm, numerarlos con marcador indeleble, agregar 3
ml de agua y marcar el nivel; tirar el agua, secar los tubos en un horno. Una
vez secos y fríos pesarlos en una balanza analítica, anotando el peso. Pasar a
través de la columna 100 ml de regulador Tris-EDTA a una velocidad de
elusión de 12 a 16 gotas/min, bajar el volumen del regulador hasta que esté
sobre la superficie del Sephadex y añadir 0.5 ml de la solución de albúmina al 1
% en (NH4)2SO4 1 M. Abrir la llave para introducir la mezcla y comenzar a
colectar la primera fracción, hacer 3 lavados de 1 ml cada uno con regulador
Tris-EDTA. Llevar el regulador en la columna hasta una altura constante, eluir y
colectar un total de 25 fracciones, de 3 ml cada una, en los tubos aforados,
secos y pesados. RECUERDE QUE LA VELOCIDAD DEBE PERMANCER
CONSTANTE DURANTE EL PROCESO DE ELUCIÓN.
Determine la absorbencia de la albúmina en cada fracción a 280 nm, ajustando
el espectrofotómetro a 100 %T con la primera fracción colectada. Una vez
efectuadas las lecturas de absorbencia, añadirle a cada fracción 1.5 ml de
BaCI2 1 M, centrifugar los tubos donde aparezca precipitado de BaSO 4,
eliminar el sobrenadante, secar el precipitado y pesarlos en la balanza analítica
para obtener, por diferencia de pesos, la masa del sulfato de bario. DESPUÉS
DE OBTENER EL PRECIPITADO DE BaSO4 SECO, SE RECOMIENDA
USAR GUANTES PARA MANEJAR LOS TUBOS.

78
4. Lavado final de la columna
Pasar a través de la columna 100ml de regulador de Tris-EDTA 0.1 M, pH 7.5.
Vaciar el gel a un recipiente para su regeneración (Apéndice l), cuidado de
quitar la tafeta y la lana de vidrio.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
1. Determinación del Volumen vacío (Vo) de la columna.
Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna
Volumen de elución A 615
(ml)

a) Con los datos anteriores construya el perfil de elución de la dextrana azul

2000 (gráfica 1), colocando el volumen de elución en las abscisas y la
absorbencia a 615 nm en las ordenadas.
b) ¿Cuál fue el volumen total de la columna (VT)?____________________
c) ¿Cuál fue el volumen vacío (Vo) de la columna?___________________
d) Determine el volumen que ocupa en la columna el líquido que se encuentra
en el interior de la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel solo
(Vg).__________________
3. Separación del sulfato de amonio de la proteína.

79
 Tabla 2. Separación del sulfato de amonio de la proteína
Volumen de elución A 280 (NH4)2SO4
(ml) (mg)

a) Con los datos anteriores construya el perfil de elución de la albúmina y el

sulfato de amonio (gráfica 2), poniendo en el eje de las abscisas el volumen de
elución, hacer dos ejes de ordenadas: en el de la izquierda colocar la A 280 de la
albúmina y en el derecho los mg de (NH4)2SO4.
b) ¿Qué sustancia eluyó primero y cuál después? Explique porqué._________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
c) ¿Qué es un gel? _______________________________________________
¿Qué características debe tener el que es cromatográficamente útil?________
_______________________________________________________________

80
_______________________________________________________________
d) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a la usada en la
PRÁCTICA, que puede tener esta
técnica._________________________________________________________
______________________________________
e) Escriba las estructuras químicas del Sephadex y del Bio-Gel A. Indique
dónde se da el entrecruzamiento, en cada caso.
DISCUSIÓN:____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES: _______________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Barnard. J. A., R. Chayen. 1965. Modern Methods in Chemical Análisis. Mc
Graw Hill Publishing Co., New York, pp. 246-252
2. Sephadex in Gel Filtration 1963. Distribuido por Pharmacia ; Uppsala,
Sweden
3. Calcárcel, M.; A. Gómez H. 1998. "Técnicas Analíticas de Separación". Ed.
Reverté, pp. 573-592
4. Fischer, L. 1975. Introducción a la cromatografía en gel. De la serie
Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular de T.S: Work
and E. Work. Ed. El Manual Moderno.

81
 APÉNDICE I: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
EVALUACION DEL FUNCIONAMIENTO Y USO DE DISTINTOS SISTEMAS
DE MEDICIÓN DE VOLÚMENES
Sustancias: Dicromato de potasio
1. Dicromato de potasio al 5 %: En un matraz aforado de 100 ml disolver 5 g de
dicromato de potasio en agua destilada y aforar.
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE LOWRY
1. Reactivo A. Solución de Na2CO3 al 2 % en NaOH 0.1 N
(Reactivo cuproalcalino: Solución de NaOH 0.5 N que contiene 10% Carbonato
de Na, Tartrato de K al 0.1 % y sulfato cúprico al 0.05 %)
2.
3. Reactivo B. Solución de CUSO4 5H20 al 0.5 % en citrato de sodio al 1 %.
4. Reactivo C. Mezclar 1 ml de reactivo B con 50 ml de reactivo A. Se prepara
al momento de usarlo.
5. Reactivo D. Reactivo de Folin diluido 1:3 con agua destilada.
6. Reactivo de Fenol Folin- Ciocalteu. En un matraz balón de 1500 ml
colocar 100 g de tungstato de sodio (Na2WO4.2H20), 25 g de molibdato de
sodio (Na2MoO4.2H2O), 700 ml de agua destilada, 50 ml de ácido fosfórico
al 85 % y 100 ml de ácido clorhídrico concentrado. Reflujar la mezcla
anterior durante 10 horas. Enfriar y agregar 150 g de sulfato de litio, 50ml de
agua destilada y no más de 0.25 ml de bromo. Hervir la mezcla para
eliminar el exceso de bromo (aproximadamente 15 min) enfriar, diluir a un
litro y filtrar sobre papel Whatman No.1. El procedimiento anterior debe
hacerse en una campana de extracción. El reactivo debe presentar un color
amarillo, si presentara un tinte verdoso, agregar más bromo y hervir. Para
su uso debe diluirse 1:3 (V:V) con agua destilada.
7. Soluciones tipo de proteína
a) Solución de Albúmina bovina 0.25 mg/ml, en solución A
b) Solución de Hemoglobina bovina 0.25 mg/ml, en solución A
8. Preparar las siguientes soluciones, para probar interferencias
químicas del método:
A) Tris 1 M, pH 7.0
B) Tris 1M, pH 10
C) Glicerol al 1 % (v/v)

82
D) Detergente de uso común al 1 %
E) Ácido tricloroacético 5 %
F) Fenol al 1 % (v/v)
G) Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1%
H) β- Mercaptoetanol al 0.01 %
I) (NH4)2SO4 al 3 %
J) Urea al 5 %
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
1. Reactivo de Bradford. Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-
250 en 50 ml de etanol al 96 %, añadir 100 ml de H3PO4 al 85 % y aforar a
un litro con agua destilada. Dejar reposar 24 horas Filtrar a través de papel
Whatman No.1 y guardar un frasco oscuro a 4 ºC. Estable 15 días.
2. Soluciones tipo de proteínas:
a) Solución de albúmina bovina de 0.25 mg/ml en reactivo A de
Lowry (Na2CO3 al 2 % en NaOH 0.1 N)
b) Solución de hemoglobina bovina 0.25 mg/ml en reactivo A de
Lowry.
3. Prepara las siguientes soluciones, para probar interferencias químicas
del método:
A) Tris 1 M, pH 7.0
B) Tris 1 M, pH 10
C) Glicerol al 1 % (v/v)
D) Detergente de uso común al 1 %
E) Ácido tricloroacético 5%
F) Fenol al 1 % (v/v)
G) Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1 %
H) β - Mercaptoetanol al 0.01 %
I) (NH4)2S04 al 3 %
J) Urea al 5 %
4. Solución de alcohol ácido (para lavado de cubetas). A un galón al 96 %
se le adicionan 2.5 ml de HCI concentrado, o más, para tener un pH final de
1.0

83
 SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR
CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL
1. Disolvente de desarrollo
a) Butanol-ácido acético-agua ([Link]). Mezclar perfectamente los
componentes.
b) Metanol-etanol-agua-urea ([Link].3 g de urea) Mezclar todos
los componentes. Preparar al momento de usarse.
2. Ninhidrina al 0.2 %. Disolver 2 g de ninhidrina en 1 l de etanol al 96
%. Guardar en el refrigerador y en la oscuridad.
3. Soluciones tipo de aminoácidos (2 mg/ml), en isopropanol al 10 %
(excepto prolina).
Disolver cada aminoácido en un volumen pequeño de isopropanol al 10
% y agregar HCI 1 N hasta la disolución completa del aminoácido.
Agregar isopropanol al 10 % hasta el volumen deseado.
4. Prolina (4 mg/ml). Seguir el procedimiento del punto anterior.
5. Isopropanol al 10 % (v/v). Medir 12.8 ml de isopropanol y diluir con
agua destilada hasta un aforo de 100 ml
6. Ácido clorhídrico 1 N. Medir 8.3 ml de HCI (37 %, =1. 18 g/ml) y
aforar a 100 ml con agua destilada.

SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y

FLUORESCEÍNA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN
1. Óxido de aluminio Neutro Merck (Alúmina). Antes de montar la columna,
es necesario tratar la alúmina necesaria para el trabajo de todos lo equipo con
NaOH 4 M, para el pH de la misma sea de 11, eliminar el exceso de álcali con
agua destilada, hasta que el pH del sobrenadante sea igual a siete, filtrar el
vació y secar en el horno a 70 ºC.
2. Alcohol Etílico Ácido. A un galón de etanol al 96 % se le adicionan 2.5 ml
de HCI concentrado, o más, para tener un pH final de 1.0
3. Mezcla de Colorantes. Pesar 1.5 mg de azul de metileno y 1.5 mg de sal
sódica de fluoresceína, disolver en 5 ml de etanol al 96 %.

84
 VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN
ESPECTROFOTÓMETRO
1. Solución de HCI al 1 %. En una matraz volumétrico de 1000 ml colocar 200
ml de agua destilada, agregar lentamente y con cuidado, 10 ml de HCI
concentrado. Aforar a 1 litro con agua destilada.
2. Solución Estándar de NiSO4.6H2O al 20 %. Disolver 10 g de sulfato de
níquel hexahidratado grado reactivo en 20 ml de agua destilada. Agregarle 0.5
ml de HCI concentrado y aforar con agua destilada en un matraz volumétrico
hasta 50 ml.
3. Solución de NiSO4. 6H2O .19 M. Pesar 5 g de sulfato de níquel grado
reactivo, disolver en 50 ml de agua destilada, agregar 1 ml de HCI concentrado
y aforar a 100 ml con agua destilada. Filtrar en papel Whatman No.1 y guardar
en frasco ámbar a temperatura ambiente.
4. Ácido sulfúrico 0.005M. Colocar 0.27 ml de ácido sulfúrico en 50 ml de
agua destilada y llevar a 1 l con agua destilada.
5. Solución de Referencia de dicromato de potasio, que contiene
exactamente 60.06 mg en 1000 ml de una solución 0.005 M de ácido sulfúrico.

NOTA: si desea conservar la solución estándar y el HCI al 1 %

indefinidamente, filtre 10.0 ml de la solución preparada en un tubo de ensaye o
en una cubeta y cúbralo con una capa de parafina o con tapa de parafilm.
5. Solución Rojo de cresol al 1 %. En un matraz aforado de 10 ml disolver 0.1
g de rojo de cresol en etanol y filtrar con papel whatman # 1.
6. Solución de ácido sulfúrico 0.5 M. En un matraz aforado de 1000 ml
disolver en agua destilada 27.5 ml de ácido sulfúrico y aforar cuando esté a
temperatura ambiente.
7. Solución de hidróxido de sodio 0.5 M. En un matraz aforado de 1000 ml
disolver en agua destilada 20 g de hidróxido de sodio y aforar.
8. Solución de citrato de sodio 0.5 M, pH 4.7. Solución A: Disolver 52.52 g de
ácido cítrico en 500 ml de agua destilada. Solución B: Disolver 81.6 g de citrato
de sodio en 555 ml de agua destilada. En un vaso de precipitado de 1500 ml
poner la solución A y agregar lentamente la solución B hasta obtener el pH de

85
4.7.

9. Solución de dicromato de potasio al 0.08 %. Pesar 0.08 g de dicromato

de potasio y disolverlo en 15 ml de agua destilada en un vaso de
precipitados de 25 ml. Vaciar el contenido del la solución de dicromato
cuantitativamente en un matraz aforado de 100 ml. Llevar hasta el volumen
indicado para tal matraz.

ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE UN SISTEMA MÚLTIPLE

1. Ácido sulfúrico 0.5 M. Adicionar lentamente a 500 ml de aguadestilada, 28
ml de H2SO4 concentrado, llevar a 1000 ml con agua destilada.
2. Solución tipo de dicromato de potasio 0.0016 M en ácido sulfúrico 0.5 M.
Pesar 0.470 g de K2Cr2O7 disolverlos en H2SO4 0.5 M y aforar a un litro con
el mismo ácido.
3. Solución tipo de permanganato de potasio 0.0004 M en ácido sulfúrico
0.5 M. Disolver 0.0632 g de KMnO4 en ácido sulfúrico 0.5 M, aforar a 1 litro
con el mismo ácido.
4. Solución problema. Una mezcla de K2Cr2O7 y KMnO4 en H2SO4 0.5 M
DISEÑO DE UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
1. Solución De HCI 0.05 M. Tomar 4.2 ml de HCI concentrado (37 %, densidad
1.18) y aforar a un litro con agua destilada.
2. Solución de FeCl3 0.00025 M en HCI 0.05 M. Disolver 0.0625 g de
FeCI3.6H20 en 500 ml de HCI 0.05 M y aforar a un litro con el mismo ácido.
3. Solución saturada de sulfocianuro de amonio (NH4SCN). Agregar 128 g
de sulfocianuro por cada 100 ml de agua destilada.
4. Solución de NH4SCN 0.5 M. Disolver 38.06 g de sulfocianuro de amonio en
agua destilada y aforar a un litro.
5. Hidróxido de sodio (NaOH) 4 M. Disolver 80 g de NaOH en agua destilada
y aforar a 500 ml
6. Ácido clorhídrico concentrado
7. Fluoruro de sodio
8. Oxalato de sodio
9. Tartrato de sodio
10. Fosfato monopotásico

86
11. Solución estándar de NiS04.6H2O al 4 %

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

MÉTODO DE KUNITZ
1.- Regulador de fosfatos de Sorensen 0.1 M, pH 7.6. Preparar dos
soluciones 0.1 M de Na2HPO4 y KH2PO4, mezclarlas en proporción de 9 a 1
respectivamente. Verificar el pH, de ser necesario, ajustarlo.
2.-Solución de Caseína al 1 %. Colocar 4 g de caseína en un mortero y
disolver poco a poco con 400 ml de regulador de Sorensen 0.1 M, pH 7.6,
esterilizar a 15 lb durante 15 min.
3.-Ácido clorhídrico 0.0025 N. Tomar 0.21 ml de HCI concentrado (37 %) y
aforar a un litro con agua destilada.
4.-Soluciones de Tripsina. DEBEN PREPARARSE AL MOMENTO DE
USARLAS
a) Solución A. Pesar 40 mg de tripsina y aforar a 200 ml con HCI 0.0025
N. Esta solución contiene 0.20 mg/ml
b) Solución B. Tomar 40 ml de solución A y aforar a 50 ml con HCI
0.0025 N. Esta solución contiene 0.16 mg/ml
c) Solución C. Tomar 30 ml de solución A y aforar a 50 ml con HCI
0.0025 N. Esta solución contiene 0.12 mg/ml
d) Solución D. Tomar 20 ml de solución A y aforar a 50 ml con HCI
0.0025 N. Esta solución contiene 0.08 mg/ml.
e) Solución E. Tomar 10 ml de solución A y aforar a 50 ml con HCI
0.0025 N. Esta solución contiene 0.04 mg/ml

NOTA: La cantidad de tripsina que se pese originalmente va a depender del

grado de hidratación de la enzima, por lo tanto la preparación en el punto 4
puede variar.
5. Ácido tricloacético al 10 %
6. Obtención de Bromelaína. Mezclar 25 g de piña con 18 ml de
regulador de fosfatos de Sorensen 0.1 M, pH 7.6 y agregar cisteína
hasta una concentración de 2 mg/ml. Moler la preparación en un
mortero, filtrar a través de gasa y centrifugar a 2000 rpm durante 10
minutos. Del sobrenadante hacer disoluciones 1:10 y 1:20 con regulador

87
 de fosfatos 0.1 M, pH 7.6
7. Solución de ablandador de carne. Prepararla en regulador de
fosfatos 0.1 M a pH 7.6 a una concentración de 60 mg/ml. Agregar
cisteína hasta una concentración final de 2 mg/ml

TRATAMIENTO PRELIMINAR Y DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD

DE UN INTERCAMBIADOR IÓNICO
1. Hidróxido de sodio 1 N. Disolver 40 g de NaOH en agua destilada, enfriar y
aforar a un litro.
2. Acido clorhídrico 1 N. Medir 83 ml de HCI concentrado (37 %, densidad
1.18) y diluir con agua destilada, aforando a un litro.
3. Cloruro de sodio 1 M. Disolver 58.5 g de NaCI en agua destilada y aforar
a un litro.
4. Fenolftaleína al 0.1% en etanol al 95 %
5. Resina catiónica Merck I o un equivalente.
6. Solución valorada de NaOH 0.1 N. Disolver 4.0 g de NaOH en agua
destilada y aforar a un litro . Para valorarla seguir alguno de los siguientes
procedimientos.
a) Titular 10 ml de solución valorada de HCI (0.1 N) con NaOH 0.1 N,
utilizando fenolftaleína como indicador. Calcular la normalidad del NaOH
con la expresión:
C1V1= C2V2
b) Desecar una cantidad conocida de biftalato de potasio, durante 12
horas a 100ºC. Pesar una matraz Erlenmeyer de 250 ml y agregar una
pizca de biftalato desecado. Pesar nuevamente el matraz para obtener,
por diferencia de peso, la masa de biftalato. Agregar al matraz 10 ml de
agua destilada y 4 gotas de fenolftaleína. Titular con NaOH 1 N hasta el
vire de la fenolftaleína. Obtener la normalidad exacta del NaOH
empleando la siguiente expresión:
Masa del biftalato
N=
(ml de NaOH)) (meq de biftalato)

88
 SEPARACIÓN DE DOS AMINOÁCIDOS USANDO CROMATOGRAFÍA
POR INTERCAMBIO IÓNICO
1. Mezcla de aminoácidos. Prolina 2 mg/ml y L- histidina 8 mg/ml en
HCI 0.02 N. La solución de HCI debe tener un pH de 2.0
2. Citrato de sodio 0.1 M. Disolver 29.41 g de citrato de agua destilada y
aforar a un litro.
3. Ácido cítrico 0.1 M. Pesar 21.01 g de ácido cítrico, disolver en agua
destilada y aforar a un litro.
4. Regulador de Citratos 0.1 M, pH 5.25, Mezclar 305 ml de ácido cítrico
M con 695 ml de citrato de sodio 0.1 M. Verificar que el pH sea 5.25
5. Regulador de Citrato 0.1 M, pH 5.25. Mezclar 820 ml de ácido cítrico
0.1 M con 180 ml de citrato de sodio 0.1 M. En caso necesario, ajustar
el pH con HCI concentrado.
6. Ninhidrina al 0.2 % en Etanol al 96 %. Pesar 2.0 g de ninhidrina,
disolver en alcohol etílico al 96 % y aforar a un litro. Guardar en el
refrigerador y en la oscuridad.
7. Resina catiónica amberlita IRC-50 o una equivalente.

SEPARACIÓN DE GRUPOS USANDO CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN

1. Suspensión de Sephadex G-25. Suspender el Sephadex en una cantidad
tal de regulador Tris-EDTA 0.1 M, pH 7.5, que la suspensión tenga baja
viscosidad, agitar, dejar sedimentar y decantar. Repetir la operación cuatro
veces. Finalmente agregar más regulador y dejar reposar durante 6 horas.
2. Dextrana Azul 2000 (20 mg/ml). Disolver 1 g de dextrana azul 2000 en
agua destilada y aforar a 100 ml
3. Regulador Tris- EDTA 0.1 M, pH 7.5. Pesar 12.2 g de tris alcalino y 0.370
g de EDTA (sal disódica). Disolverlos y aforar a 1 litro. A 500 ml Tris. EDTA
se le agregan 400 ml de HCI 0.1 M y se afora a un litro con agua destilda.
Ajustar el pH a 7.5
4. Solución de albúmina al 1 % en (NH4)2SO4 1 M
a) Solución de (NH4)2SO4 1 M. Disolver 13.20 g de (NH4)2SO4 y aforar a

89
 100 ml con agua destilada.
b) Disolver 1 g de albúmina bovina en 100 ml de sulfato de amonio 1 M
5. Solución de BaCl2 1M. Pesar 208.25 g de BaCI2 y disolver en agua
destilada, aforar a un litro.
6. Alcohol etílico absoluto
7. Regeneración del Sephadex. Lavar el Sephadex con agua, pasar a un
embudo Büchner con papel filtro grueso y eliminar el exceso de líquido con
vacío. Pesar el Sephadex a un vaso de precipitados y añadir 1 a 2
volúmenes de etanol al 96 %, agitar y dejar reposar la suspensión por 1 ó 2
horas, pasar nuevamente por el embudo Büchner, repitiendo esta operación
4 ó 5 veces. Después del último lavado, secar el Sephadex con vacío y
llevar a un horno entre 60 y 80 ºC a un cuarto estufa a 37 ºC para terminar
de secar.

90