Lavado de columnas de sílice ligada Las claves para rejuvenecer una columna

de HPLC contaminada son conocer la naturaleza de los contaminantes y

encontrar un solvente apropiado que los elimine. Cuando la contaminación es
el resultado de la acumulación de sustancias fuertemente retenidas por
inyecciones repetidas, un simple proceso de lavado para eliminar estos
contaminantes a menudo puede restaurar el rendimiento de la columna. A
veces, después de la operación isocrática, el lavado de una columna con 20
volúmenes de columna de 90–100% de disolvente B (el disolvente más fuerte
en un sistema binario de fase inversa) puede eliminar los contaminantes. (La
Tabla 2 enumera los volúmenes de columna para varios tamaños de
columnas de HPLC, por lo que los lectores pueden determinar fácilmente el
volumen de lavado de una columna en particular lavando una columna con
disolventes no acuosos como metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. Si está
utilizando un móvil acuoso tamponado fase, no salte inmediatamente al
solvente fuerte. Un cambio abrupto a un alto contenido de solvente orgánico
podría resultar en la precipitación del tampón en el sistema de flujo de HPLC,
lo que podría causar problemas aún mayores, como fritas obstruidas, tubería
de conexión obstruida, falla del sello de la bomba, un pistón rayado o falla del
rotor de la válvula de inyección. En su lugar, lave la columna con una fase
móvil libre de tampón (es decir, reemplace el tampón con agua). Después de
lavar con 5-10 volúmenes de columna, el solvente más fuerte puede pasar a
través de la columna . Ocasionalmente, el fuerte componente disolvente de
una fase móvil es insuficiente para eliminar los contaminantes de la columna.
Será necesario un solvente más fuerte o una serie de solventes para limpiar la
columna. Si los contaminantes no son biológicos, los usuarios pueden pasar
uno o más disolventes orgánicos adicionales a través de la columna para
eliminar los compuestos no deseados. Los disolventes y las combinaciones
de disolventes que se pueden utilizar son numerosos. Visite los sitios web de
uno o más fabricantes de columnas para ver varios sistemas de disolventes
recomendados.
Generalmente, todos los enfoques de lavado siguen un patrón similar. Los
disolventes de lavado utilizados aumentan en su fuerza de disolvente, a
menudo terminando con un disolvente que podría ser muy no polar (por
ejemplo, acetato de etilo o incluso un hidrocarburo), lo que ayuda a solubilizar
sustancias no polares como lípidos y aceites. Es importante asegurarse de
que cada disolvente de la serie sea miscible con el siguiente disolvente. Al
final del ciclo de lavado, retroceda a través de un solvente intermediamente
miscible antes de regresar al sistema de fase móvil original. Por ejemplo, el
isopropanol es un excelente disolvente para este paso intermedio porque es
miscible con disolventes orgánicos como el hexano o el cloruro de metileno y
también es miscible con soluciones acuosas. Debido a que el isopropanol es
bastante viscoso, asegúrese de que el caudal no sea lo suficientemente alto
como para causar sobrepresión en la bomba. Además, si usa un detector de
UV, evite usar solventes que absorban en la región ultravioleta del espectro
porque puede requerir mucho lavado para eliminar todo el solvente
absorbente para obtener una línea de base estable. Se debe utilizar un
sistema de lavado de columna recomendado para una columna típica de
sílice ligada y una fase móvil sin sales tampón. • 100% metanol, • 100%
acetonitrilo, • 75% de acetonitrilo– 25% de isopropanol, • 100% isopropanol, •
100% cloruro de metileno y • 100% hexano. Cuando se usa cloruro de
metileno o hexano, la columna debe lavarse con isopropanol antes de volver a
una fase móvil acuosa debido a la inmiscibilidad del solvente. Se debe pasar
un mínimo de 10 volúmenes de columna de cada disolvente de lavado a
través de una columna. Para columnas analíticas de 250 mm y 4,6 mm, los
analistas pueden utilizar un caudal típico de HPLC de 1 a 2 ml / min. Para
volver a la fase móvil original, los cromatógrafos generalmente pueden omitir
la serie completa en orden inverso. Se recomienda el uso de isopropanol
como disolvente intermedio, seguido de la fase móvil sin tampón y finalmente
con la composición de la fase móvil de partida. El tetrahidrofurano es otro
solvente popular que se puede usar para limpiar columnas contaminadas. Si
los usuarios sospechan que hay incrustaciones graves, pueden mezclar
dimetilsulfóxido (DMSO) o dimetilformamida mezclada 50:50 con agua y
pasarlos a velocidades de flujo inferiores a 0,5 ml / min. La regeneración
exitosa de una columna de fase reversa puede ser un proceso que requiere
mucho tiempo, y los lavados con solvente se pueden programar en un
sistema de gradiente para operación durante la noche.
Surge la pregunta de si invertir la columna de HPLC durante el procedimiento
de lavado. Como la mayoría de los contaminantes fuertemente retenidos
generalmente se encuentran en la cabeza de la columna, invertir la columna
puede acortar la distancia de migración que los contaminantes solubilizados
deben viajar para salir de la columna. En cuanto a la estabilidad del lecho
empacado está preocupado, la mayoría de las columnas de HPLC modernas
se han empacado a una presión considerablemente más alta que la presión
de funcionamiento normal; por lo tanto, sus lechos no deben ser perturbados
por el flujo inverso. Sin embargo, si una frita superior tiene una porosidad más
alta que una frita inferior, este tipo de inversión podría ser perjudicial. Por
ejemplo, si la frita de fondo tiene una porosidad de 2 µm, normalmente es
suficiente contener un relleno de columna con un tamaño medio de partícula
de 5 µm (con una partícula de 2 µm distribución de tamaño). Sin embargo, un
fabricante a veces colocará una frita de porosidad más grande en la parte
superior de la columna para evitar que se obstruya con la muestra o las
partículas de la fase móvil. Si la porosidad de esta frita es mayor que la de las
partículas más pequeñas en la curva de distribución del tamaño de partícula,
es posible que parte del material de relleno pase a través de la frita y se
elimine de la columna, creando así un vacío. Si una columna tiene una flecha
para recomendar la dirección del flujo, consultaría el manual o la hoja de
instrucciones, el sitio web del fabricante o el grupo de soporte técnico antes
de invertir la columna para asegurarme de que sea una práctica segura. Ya
sea que invierta la columna o no, es una buena práctica desconectar la
columna del detector de HPLC para que los contaminantes o las partículas
alojadas en la frita no se introduzcan en la celda del detector, donde pueden
causar contaminación. La frecuencia de limpieza de las columnas de fase
inversa sucias depende de la cantidad de material no retenido que se haya
inyectado en la columna. Debido a que las columnas de fase reversa a veces
pueden resistir una gran cantidad de contaminación antes de la pérdida de
resolución o la elución de compuestos extraños, los usuarios tienden a
esperar hasta que observan algún comportamiento inusual. Sin embargo, una
mayor acumulación de contaminantes dificultará la limpieza de la columna.
Por esta razón, si sabe que está sometiendo sus columnas de fase reversa a
matrices de muestra sucias, le recomiendo limpiar sus columnas de forma
regular. Cuanto más frecuente sea la limpieza, menos rigurosas condiciones
de limpieza necesitará.