Fundamentos de la electroforesis
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz.
Fue empleado por primera vez por
en el año 1937, pero su
importancia vino a
incrementarse cuando en
los años cincuenta E.
L.Durrum y Arne W.K.
Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la
separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de
soporte; aunque este termino se limitó originalmente al análisis de coloides y
partículas submicroscópicas, se ha convertido en estos últimos años en una
metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta son colocadas
en un campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que
posea carga opuesta.
Según las leyes de la electrostática cuando una molécula de carga q se encuentra en un
campo eléctrico de magnitud E, la fuerza que provoca la aceleración de la partícula será
qE. Dicha fuerza se verá contrarrestada por la resistencia friccional f dando una
velocidad resultante v, de forma que:
qE = fv
Aplicando las leyes de Stokes para una molécula esférica de radio r que se mueva a
través de un medio de viscosidad n, se cumple:
f= 6 nr
A partir de las anteriores expresiones se obtiene:
qE= 6nrv
La movilidad electroforética V de una molécula se define como la migración por unidad
de campo de fuerza, de modo que:
v q q
V= = = nr
E f 6
Por tanto, la movilidad electroforética depende de la carga de las partículas y del
coeficiente de fricción f, que es dependiente del tamaño de la molécula, de su forma y
de la viscosidad del medio.
Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se
desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se
desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales;
por un lado, la fricción con el solvente dificultará
este movimiento (es decir, al moverse los solutos
chocarán con las moléculas de solvente que están
en su camino), lo que genera una fuerza que se
opone al movimiento; por otro lado, las moléculas
tienden a moverse en forma aleatória
(movimiento browniano) debido a que poseen
energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera
homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la
solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentrá
con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas
empleando un medio que oponga una mayor resistencia a dicho movimiento. Una forma
común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy
alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molécular que
dificulta el movimiento de los solutos.
Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el
ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la intensidad
del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molécular, pero no por ello variará
la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos
mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y
esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado
por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se
puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos.
La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que las moléculas de mayor
tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que las
moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento
electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su
carga eléctrica.
TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis zonales.
Son las más comunes, dada su alta aplicabilidad en
diferentes campos. Son útiles para lograr la
separación de mezclas complejas. Se aplican
pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a
un soporte sólido, que se impregna con una solución
tampón. Los soportes son en general polímeros y
forman un gel poroso que restringe el movimiento de
las moléculas a través del medio durante la
electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y
acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se
aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud
del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es
simple: fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos
electrodos.
Electroforesis en papel
La muestra se aplica en un punto de una
tira de papel de celulosa impregnado en
una solución buffer de acetato. Los
extremos de la tira están inmersos en unos
reservorios de la disolución buffer
separados, en los cuales se sitúan los
electrodos. Mediante la apliación de una corriente directa los iones de la muestra migran
hacia los electrodos de polaridad opuesta, formando bandas discretas. La migración de
los iones está influenciada por su interacción con la matriz soporte, pero es sobre todo
una función de su carga. Tras completarse el electroforetograma lo que normalmente
conlleva varias horas, la tira de celulosa se seca y los componentes de la muestra son
localizados usando los mismos métodos de detección que en la cromatografía.
Para la mayoría de las separaciones el campo eléctrico adecuado es de 20V/cm. La alta
difusividad de pequeñas moléculas como aminoácidos y pequeños péptidos, sin
embargo, limita la resolución en las mezclas complejas. Esta dificultad se reduce y la
separación se acelera usando campos eléctricos de unos 200 V/cm, en esta electrofiresis
de alto voltaje el papel es sujetado entre dos placas enfriadas para disipar el calor
generado por la corriente de alto voltaje.
La electroforesis en papel y la cromatografía en papel son similares superficialmente,
sin embargo, la electroforesis en papel separa iones basandose en sus cargas, mientras
que la cromatografía en papel separa moléculas en base a su polaridad. Estos dos
métodos pueden combinarse en una técnica bidimensional conocida como
fingerprinting (huella digital), en la cual la muestra al inicio se trata como en una
cromatografía bidimensional en papel y luego se la somete a lectroforesis. Por lo tanto,
las moléculas se separan tanto en función de su carga como en su polaridad.
Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es una de las más poderosos y convenientes métodos para la
separación de macromoléculas. Los geles más comúnmente usados son la
poliacrilamida y agorosa. Estas tienen poros de dimensiones moleculares cuyo tamaño
puede ser especificado. Las separaciones moleculares están basadas en la filtración de
gel así como en la movilidad electroforética de las moléculas que están siendo
separadas. Los geles en la electroforesis en gel deceleran la migración de las moléculas
grandes en comparación con las de menor tamaño, al revés de lo que ocurre en la
cromatografía de filtración en gel.
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción
de un agente entrecruzador químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de
ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten
buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera
controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en
diagnostico debido a su neurotoxocidad.
Preparación del soporte. El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida que
forma largas cadenas lineales, con abundantes grupos polares que las hace solubles en
medios acuosos. Al no estar las cadenas unidas entre sí, formarían un gel sin
consistencia mecánica y totalmente inmanejable. Para evitar esto, se utiliza otro
monómero, la N,N’-metilen-bisacrilamida que forma parte de dos cadenas que quedan
así unidas covalentemente.
En función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos
densos, mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de
entrecruzamiento de las cadenas. Ambos componentes determinan, en conjunto, las
características físicas del gel resultante: su resistencia mecánica, fragilidad, elasticidad,
grado de reticulación (tamaño de poro), etc.
Al polimerizar la acrilamida, adquiere la forma del recipiente, por lo que es necesario un
molde para preparar el gel; los hay de dos tipos:
* Tubo. Consiste en un tubo de vidrio de dimensiones variables, abierto por los
extremos.
* Placa. Es la forma más habitual. Puede llevarse a cabo en posición horizontal o
vertical (dependiendo del tipo de cubeta empleada), aunque lo más habitual
(sobre todo para la separación de proteínas) es el modo vertical.
Electroforesis en geles de gradientes.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de
archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño
del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de
acrilamida. En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el
tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se
alcanza el limite del poro no se produce una
migración apreciable aunque no se detiene
completamente. Una de las ventajas de este tipo de
geles es que resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones mas estrechas, además de
incrementar el rango de pesos moleculares que se
pueden resolver en un mismo gel comparado con los
de una concentración fija.
SDS-PAGE
Los jabones y detergentes son moléculas anfipáticas con un gran poder de
desnaturalización proteíca. El dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente usado con
frecuencia en las preparaciones bioquímicas.
El SDS se une a las cadenas polipeptídicas desnaturalizadas (haciéndolas asumir una
forma cilíndrica) con una relación aproximada de una molécula de SDS por cada dos
aminoácidos. Esta unión masiva de moléculas de SDS enmascara la carga intrínseca de
la molécula de proteína y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a
su masa, haciendo que todas las proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo.
La separación de los complejos SDS-proteína es proporcional sólo a la masa de la
proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces
determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un
patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos.
Las masas moleculares de las proteínas normales se determinan con una precisión del 5-
10% mediante SDS-PAGE. La movilidad relativa de proteínas en estos geles cambia
linelamente con el log de sus masas moleculares.
Además de la adición de SDS, las proteinas pueden ser calentandas hasta casi ebullición
en presencia de un agente reducror tal como el ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol,
que desnaturaliza la proteína mediante la reducción de sus puentes disulfuro y por tanto
rompiendo los plegamientos terciarios y la estructura cuaternaria en sus unidades
oligoméricas. Esta técnica se conoce como SDS-PAGE reductora y es comunmente
usada. La SDS-PAGE no reductora (sin calentamiento ni agente reductor) se utiliza
mayormente cuando la estructura nativa es importante para posteriores anàlisis.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero
de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 ºC y formar un gel semisólido al
enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las
moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000
nucleótidos.
Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas
convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener
una serie de ventajas al respecto. Esta separación de péptidos se realiza sobre un capilar
de silica fundida a potenciales elevados de 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica generada por los grupos silanol de la superficie interna
del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta
con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución.
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida, que generalmente se cubre
con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, permite el pasaje de la
luz UV. Con esta técnica descrita es posible separar cationes, aniones, proteínas,
macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.
Isoelectroenfoque.
Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento
de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los
aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un
gradiente de pH . La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos
se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su
punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en
regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y
migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más
bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el ánodo. La
migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico,
tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas se
sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
PROCESO DE ELECTROFORÉSIS EN PROTEÍNAS.
PASOS GENERALES
Las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de
aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e
histidina) y del grado de ionización de éstos al pH considerado.
En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migración, ya
que el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el tamaño de poro
del soporte), la separación depende de la densidad de carga de las moléculas y, así,
cuanto mayor sea la densidad, mayor será la velocidad de migración en un campo
eléctrico hacia el polo que determine su carga neta.
La primera etapa del proceso es la aplicación de la muestra. En papel o acetato de
celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el análisis de varias muestras
simultáneamente en pequeñas cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de
una sola muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en el tampón de
electroforesis, del que está impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios
de la cubeta, y se deposita en una pequeña zona, lo más estrecha posible, en el centro o
en un extremo del soporte (si se conoce cuál va a ser la dirección de desplazamiento de
la misma) y de forma perpendicular a la dirección del campo eléctrico. Conviene evitar
la proximidad de los bordes del papel, ya que allí el campo eléctrico no es homogéneo y
se distorsionan las bandas según avanzan. El volumen que se aplica suele ser inferior a
10 μL y si se necesitan mayores volúmenes porque la muestra se encuentre muy diluida,
pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la misma zona, dejando secar entre
aplicación y aplicación. Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa,
ha de utilizarse un papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la
electroforesis analítica (85-100 gr/cm2; 0.15mm de espesor), lo que permite la
aplicación de una mayor cantidad de muestra (50-100μL).
Es necesario humedecer el soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor;
para ello, se impregna el soporte de tampón de electroforesis por ambos extremos y de
forma simultánea para que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicación de la
muestra.
En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de
diámetro adecuado y se elimina esa porción por succión. La perforación puede ser
cilíndrica o rectangular, dependiendo del número y cantidad de muestra a analizar y la
muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el
tampón está embebido en el soporte (agarosa).
En todos los casos, la zona de aplicación debe ser lo más estrecha posible, para
aumentar la resolución y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones
cercanas.
La electroforesis termina cuando se haya producido la máxima separación de los
componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte. Para evitar que
se sobrepasen estos límites, se utilizan los marcadores electroforéticos que son
moléculas coloreadas con una movilidad electroforética superior a cualquier
componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tamaño). Entre los
marcadores más utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de
bromofenol.
REVELADO Y VISUALIZACIÓN
Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al
ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para
hacerlas visibles. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de
la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente
hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen
átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán
separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a
cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un
solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.
Las bandas en diferentes separaciones paralelas que están a la misma distancia del
principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma
velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de
tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla
desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las
obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño.
