PORTADA

UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO

FACULTAD CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

Proyecto de Investigación
previo a la obtención del título
de Ingeniera Agroindustrial.

Título del Proyecto de Investigación:

Evaluación de las concentraciones de aceites esenciales de citrus sinensis (naranja) en la

inhibición de hongos patógenos en phaseolus vulgaris l. (frijol canario) almacenados en
las bodegas del Cantón Quevedo 2016

Autora:

Jessica Alexandra Daquilema Rea

Directora de proyecto de investigación:

Ing. MS.c. Flor Marina Fon Fay Vásquez

Quevedo - Los Ríos – Ecuador.

2016

UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO

i
 Facultad de Ciencias de la Ingeniería
Escuela de Ingeniería para el Desarrollo Agroindustrial
Teléfonos: (593-05) 2750320 – 2752430 – 2753302 CASILLAS
Fax: (593-05) 2753300 – 2753303 Quevedo – Los Ríos – Ecuador Guayaquil: 10672
e-mail: info@[Link] Km. 1.5 vía a Quito Quevedo: 73
Pàgina web: [Link]
__________________________________________________________________________

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS.

Yo, Jessica Alexandra Daquilema Rea, declaro que la investigación aquí descrita es
de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación
profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este
documento.

La Universidad Técnica Estatal de Quevedo, puede hacer uso de los derechos

correspondientes a este documento, según lo establecido por la Ley de Propiedad
Intelectual, por su Reglamento y por la normatividad institucional vigente.

f. _____________________________
Jessica Alexandra Daquilema Rea
C.C. # 120745615-1

ii
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CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO DE

INVESTIGACIÓN

La suscrita, Ing. [Link]. FLOR MARINA FON FAY, Docente de la Universidad

Técnica Estatal de Quevedo, certifica que la Egresada JESSICA ALEXANDRA
DAQUILEMA REA, realizó la tesis de grado previo a la obtención del título de
Ingeniero Agroindustrial titulada: EVALUACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES
DE ACEITES ESENCIALES DE Citrus sinensis (NARANJA) EN LA
INHIBICIÓN DE HONGOS PATÓGENOS EN Phaseolus vulgaris L. (FRIJOL
CANARIO) ALMACENADOS EN LAS BODEGAS DEL CANTÓN QUEVEDO
2016, bajo mi dirección, habiendo cumplido con las disposiciones reglamentarias
establecidas para el efecto.

______________________________
Ing. [Link]. FLOR MARINA FON FAY
DIRECTORA DE TESIS

iii
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CERTIFICADO DEL REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE

PREVENCIÓN DE COINCIDENCIA Y/O PLAGIO
ACADÉMICO

iv
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CERTIFICADO DE APROBACIÓN POR TRIBUNAL DE

SUSTENTACIÓN.

Tesis de grado presenta al Honorable Consejo Directivo de la Facultad de Ciencias de

la Ingeniería Previo a la Obtención del Título de:

INGENIERO AGROINDUSTRIAL

Título de tesis:

EVALUACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ACEITES ESENCIALES

DE Citrus sinensis (NARANJA) EN LA INHIBICIÓN DE HONGOS
PATÓGENOS EN Phaseolus vulgaris L. (FRIJOL CANARIO) ALMACENADOS
EN LAS BODEGAS DEL CANTÓN QUEVEDO 2016.

Aprobado:

_______________________________________________________________

Ing. Sonia Barzola Miranda, Msc. Ing. Ruth Torres Torres, Msc.
Presidente del Tribunal de Tesis Miembro del Tribunal de Tesis
APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DE TRIBUNAL

_________________________________

Ing. Andrea Cortez Espinoza Msc.

Miembro del Tribunal de Tesis

v
 AGRADECIMIENTO
A mis padres por ser el apoyo y el sustento en momentos difíciles de este largo camino.
Sin ellos no hubiese sido posible llegar hasta aquí. A mis hermanos Edison, Jimmy y a
mi amada hermana por ser el ejemplo de coraje que necesite en tiempos de
vulnerabilidad.

A mi directora de proyecto de Investigación, Ing. MS.c. Flor Marina Fon Fay por
brindar su aporte en cuanto a conocimientos y sugerencias para la realización de este
proyecto. Gracias por el tiempo y por la paciencia brindada.

Al Dr. Fabricio Canchignia por el aporte en el campo experimental de esta

investigación.

A la Ing. Vanessa Canchignia por brindar sus conocimientos en el laboratorio y su total

apertura en cuanto al acceso del mismo.

A amiga y hermana en Cristo Ing. Flor Narváez por compartir cada uno de sus
conocimientos adquiridos en el laboratorio.

A los amigos que logre encontrar durante el desarrollo de este proyecto, a los
compañeros de aula de los cuales guardo gratos y hermosos recuerdos. Gracias por su
amistad.

A mi familia y hermanos en Cristo que estuvieron presentes mediante sus oraciones

para que lo que ayer era solo un objetivo pudiera ser hoy una meta alcanzada.

Y por último pero no menos importante, a mi amado Jesús, mi eterno enamorado,

Padre, Consejero y Amigo Fiel. Su fidelidad estuvo conmigo cuando hubo momentos
difíciles que no lograba entender. Su favor, su amor y su gracia estuvieron presentes a
lo largo de mi vida y de mi carrera universitaria; brindando no solo la fortaleza
necesaria sino también la sabiduría para realizar y culminar con éxitos una de mis
tantas metas propuestas. Sin Dios la vida de todo ser humano carece de sentido y
propósito.

Jessica Daquilema.

vi
 DEDICATORIA

Este proyecto de investigación va dedicado a mi eterno

enamorado, Jesús. Sin Él, llegar hasta aquí no hubiera
sido posible lograr ni alcanzar.

A mis padres, esto es por y para ustedes. Gracias por el

amor y la paciencia que brindaron a lo largo de mi
carrera universitaria. En especial, gracias a mamá por
ser ejemplo de entrega absoluta, ejemplo de que nunca
podía rendirme, de que no importara cuan cansada podías
estar al final siempre me enseñaste que el trabajo duro
trae recompensa.

A mis hermanos, Edison y Jimmy espero que esto sea para

ustedes solo un pequeño ejemplo. Sé que si se lo proponen
llegaran a alcanzar y a lograr algo mucho más grande.

A mi hermana, Rosa. Que es y será siempre el reflejo de

una mujer fuerte, una mujer que no es conformista. Me
enseñaste que no debo huir si veo que algo se pone difícil
o complicado. Si hubieses apoyado mis miedos, no hubiese
llegado hasta aquí.

Jessica Alexandra Daquilema Rea

vii
 RESUMEN

En esta investigación se evaluó las concentraciones del aceite esencial de Citrus

sinensis, frente a hongos patógenos presentes en frijol canario almacenados en bodegas
del cantón Quevedo. Se obtuvo aceite esencial extraído de hojas, de corteza y se
adquirió un aceite comercial proveniente de ISABRUK BOTANIC S.A. Las semillas
del frijol canario fueron sembradas en cajas Petri con PDA durante 7 días para luego ser
aislados e identificados, obteniendo el género Fusarium spp de dos especies. Las
concentraciones de aceite esencial utilizadas fueron del 1,5 % 2,5 % y 3,5 %. La
actividad antifúngica de los aceites esenciales se determinó mediante el crecimiento
radial de micelio y germinación de esporas. Obteniendo los siguientes resultados: una
mayor actividad antifúngica en aceite esencial comercial con un porcentaje de
inhibición del 100% en Crecimiento Radial y germinación de esporas. El aceite esencial
extraído de las hojas obtuvo un 95% y 91% en crecimiento radial y un 100 % de
inhibición en germinación de esporas, mientras que el aceite esencial extraído de
corteza no tuvo un efecto antifúngico en cuanto a inhibición del crecimiento micelial del
Fusarium spp, sin embargo este mismo aceite logro inhibir en un 90% la germinación
de esporas. A concentraciones bajas se pudo obtener un mayor efecto antifúngico sin
necesidad de recurrir a concentraciones más elevadas. Con una concentración del 1,5%
de aceite esencial comercial se obtuvo un efecto antifúngico que inhibió en su totalidad
el crecimiento radial y en la germinación de esporas se evidencio una inhibición total.
Mientras que con el aceite esencial extraído de hojas, se observó un mayor efecto
antifúngico con una concentración del 2,5%. El efecto antifúngico del aceite esencial de
Citrus sinensis fue evidente en la inhibición de Fusarium spp esto debido a los
componentes que presenta dicha fruta en sus hojas y corteza.

Palabras claves: Cítricos, Corteza, Leguminosas, Inhibición de crecimiento radial

Inhibición de esporas.

viii
 ABSTRACT

In this research we evaluated the concentrations of the essential oil of Citrus sinensis,
against pathogenic fungi present in Canary beans stored in warehouses of the canton
Quevedo. Was obtained essential oil extracted from leaves, bark and acquired a
commercial oil from ISABRUK BOTANIC S.A. canarian bean seeds were sown in
Petri dishes with PDA during 7 days and then be isolated and identified, obtaining the
genus Fusarium spp of two species. The concentrations of essential oil used were 1.5 %
2.5 % and 3.5 %. The antifungal activity of the essential oils was determined by the
radial growth of mycelium and spore germination. Obtaining the following results:
greater antifungal activity in essential oil with a percentage of inhibition of 100% in
radial growth and germination of spores. The essential oil extracted from the leaves
obtained a 95% and 91% in radial growth and a 100 % inhibition on germination of
spores, while the essential oil extracted from bark did not have an antifungal effect in
terms of inhibition of the mycelial growth of Fusarium spp, however this same oil was
able to inhibit in a 90% germination of spores. At low concentrations could not obtain a
higher antifungal effect without the need to resort to higher concentrations. With a
concentration of 1.5% of commercial essential oil was obtained an antifungal effect that
inhibited the radial growth and in the germination of spores showed a total inhibition.
While with the essential oil extracted from leaves, there was a greater antifungal effect
with a concentration of 2.5%.The antifungal effect of the essential oil of Citrus sinensis
was evident in the inhibition of Fusarium spp this due to the components that presents
such fruit in their leaves and bark.

Keyword: Citrus fruits, bark, Pulses, inhibition of radial growth inhibition of spores

ix
TABLA DE CONTENIDO

PORTADA......................................................................................................................... i
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS. ..................................... i
CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ... iii
CERTIFICADO DEL REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE PREVENCIÓN DE
COINCIDENCIA Y/O PLAGIO
ACADÉMICO……………………………………….iv
CERTIFICADO DE APROBACIÓN POR TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN. .......... v
AGRADECIMIENTO ..................................................................................................... vi
DEDICATORIA ............................................................................................................. vii
RESUMEN…………………………………………………………………………….viii
ABSTRACT …………………………………………………………………………….ix
TABLA DE CONTENIDO .............................................................................................. x
INDICE DE TABLAS ................................................................................................... xiii
INDICE DE CUADROS ............................................................................................... xiv
INDICE DE ANEXOS .................................................................................................. xiv
CÓDIGO DUBLIN: ....................................................................................................... xvi
INTRODUCCION ............................................................................................................ 1
CAPITULO I CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ........................... 2
1.1 Problema de Investigación. ........................................................................................ 3
1.1.1. Planteamiento del problema ........................................................................ 3
1.1.2. Formulación del problema ........................................................................... 4
1.1.3. Sistematización del problema ...................................................................... 4
1.2. Objetivo ....................................................................................................... 4
1.2.1. Objetivo general .......................................................................................... 4
1.2.2. Objetivos específicos ................................................................................... 4
1.3. Justificación ................................................................................................. 5
1.4. Hipótesis ...................................................................................................... 5
CAPITULO II FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN ............. 6
2.1. Marco conceptual ........................................................................................ 7
2.1.1. Aceite Esencial ............................................................................................ 7
2.1.2. Obtención de Aceites Esenciales. ................................................................ 7

x
 2.1.3. Hidrodestilación. ......................................................................................... 8
2.1.4. Propiedades Antifungicas. ........................................................................... 8
2.1.5. Características de las propiedades antifúngica de los aceites esenciales ..... 8
2.1.6. Actividad biológica ................................................................................... 10
2.1.7. Aceite Esencial de cítricos......................................................................... 10
2.1.8. El uso de Aceite esencial de Cítricos como una alternativa "natural" para la
preservación química de los alimentos. ..................................................... 10
2.1.9. Aceite esencial de naranja. ........................................................................ 11
2.1.10. Aceite esencial de hojas de naranja ........................................................... 11
2.1.11. Aceite esencial de corteza de naranja ........................................................ 11
2.1.12. Microorganismos ....................................................................................... 13
2.1.13. Hongos ....................................................................................................... 13
2.1.14. Fusaryum spp ............................................................................................ 13
2.1.15. Frijol canario ............................................................................................. 14
2.1.16. Almacenamiento en bodegas ..................................................................... 15
2.1.17. Granos dañados por hongos ....................................................................... 16
2.2. MarcoReferencial..................................................................................................... 16
2.2.1. Catálogo de hongos en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) ............ 16
2.2.2. Propiedades Antifúngicas en Plantas Superiores. Análisis Retrospectivos
de Investigaciones...................................................................................... 16
2.2.3. Actividad antifúngica del aceite esencial de naranja (Citrus sinensis L.)
sobre hongos postcosecha en frutos de lechosa (Carica papaya L. .......... 17
2.2.4. Actividad antifúngica del aceite esencial y sus componentes en el
crecimiento de Fusarium sp. aislado de papaya (Carica papaya) .............. 17
2.2.5. Evaluación preliminar de la actividad fungicida de los aceites esenciales de
eucalipto (Eucalyptus tereticornis, Myrtaceae) y cáscara de naranja (Citrus
sinensis, Rutaceae) sobre algunos hongos filamentosos ........................... 18
2.2.6. Efecto de aceites esenciales extraídos de la cascara de dos especies de
cítricos en algunos hongos......................................................................... 18
2.2.7. Actividad Antibacterial y Antifúngica In-Vitro de Aceites Esenciales
Seleccionados ............................................................................................ 19
2.2.8. Análisis multivariado de los componentes del aceite esencial del género
Cítrus y su actividad antifúngica ............................................................... 19
2.2.9. Composición Química y Actividad Antifúngica de Aceites Esenciales de
Cítricos Argelinos ...................................................................................... 20

xi
CAPÍTULO III METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN .................................. 22
3.1. Localización............................................................................................... 23
3.2. Tipo de investigación ................................................................................ 23
3.3. Métodos de investigación .......................................................................... 23
3.3.1. Método experimental ................................................................................. 23
3.3.2. Método inductivo- deductivo ................................................................... 23
3.4. Fuentes de recopilación de información. ................................................... 24
3.5. Diseño de la investigación ......................................................................... 24
3.5.1. Diseño estadístico de la investigación. ...................................................... 24
3.6. Instrumentos de investigación ................................................................... 25
3.7. Tratamiento de los datos ............................................................................ 25
3.8. Recursos humanos y materiales ................................................................. 25
3.9. Manejo específico del experimento. .......................................................... 27
CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................ 30
4.1. Resultados.................................................................................................. 31
4.1.1. Identificación del hongo aislado en el frijol canario almacenados en
bodegas. ..................................................................................................... 31
4.1.2. Actividad Antifúngica del aceite esencial de Citrus sinensis (Hojas,
Corteza y Comercial) ................................................................................. 33
4.1.3. Concentraciones de los aceites esenciales (1,5% 2,5% 3,5%) para la
inhibición de hongos presentes en el frijol canario (Phaseolus vulgaris
L.)………………………………………………………………………...38
4.2. Discusión ................................................................................................... 43
4.2.1. Hongos aislados de Phaseolus vulgaris L ................................................. 43
4.2.2. Actividad Antifúngica de los aceites esenciales ........................................ 43
4.2.3. Concentraciones de AEs ............................................................................ 44
4.2.4. Tratamiento de las hipotesis. ..................................................................... 45
CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................... 46
5.1. Conclusiones.............................................................................................. 47
5.2. Recomendaciones ...................................................................................... 47
CAPÍTULO VI BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 49
CAPÍTULO VII ANEXOS ........................................................................................... 55
ANEXO 1: Crecimiento radial del Fusariumspp 1 ......................................................... 56
ANEXO 2: Crecimiento Radial del Fusarium spp 2 durante los 7 días de medición. ... 57

xii
ANEXO 3: Crecimiento radial de esporas del Fusarium spp 1 ..................................... 58
ANEXO 4: Germinación de esporas del Fusarium spp 2 .............................................. 59
ANEXO 5: Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 1 ................................. 60
ANEXO 6: Inhibición del crecimiento radial de fusarium spp 2 .................................. 61
ANEXO 7: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 1 ......................... 62
ANEXO 8: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 2 ........................ 63
ANEXO 9: Fotos de la fase experimental. ..................................................................... 64
ANEXO 10: Diagrama de bloques para la determinación de la concentración óptima de
aceite esencial de Citrus sinensis. (Naranja) en la inhibición de fusarium
spp presente en Phaseolus vulgaris l. (frijol canario). ............................... 71
ANEXO 11: Técnica de laboratorio para crecimiento radial.......................................... 73
ANEXO 12: Técnica de laboratorio para crecimiento de esporas .................................. 74
ANEXO 13: Certificado de Laboratorio ......................................................................... 76
ANEXO 14: Resultados obtenidos a partir de los datos del porcentaje de inhibicion de
crecimiento radial y germinacion de esporas de Fusarium spp 1 y Fusarium
spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) durante las primeras 48, 96 y 168 horas de
incubación. ................................................................................................. 77
ANEXO 15: Tablas de rangos múltiples para fusarium spp 1 durante las primeras 48, 96
y 168 horas. ............................................................................................... 80

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Concentraciones mínimas inhibitorias de aceites esenciales probados “in vitro”

contra microorganismos patógenos transmitidos por alimentos (Burt, 2004). ... 9
Tabla 2: Composicion quimica (%) de AEs de bergamota, limon y naranja a partir de
partes de cascara frescas identificadas mediante analisis de GC-MS .............. 12
Tabla 3.- Variedades de frijol cultivadas en Ecuador ..................................................... 14
Tabla 4.- Valor nutricional del frijol canario por cada 100 g ........................................ 15

xiii
 INDICE DE CUADROS

Cuadro 1: Factores de estudio para la evaluación de concentraciones de aceites

esenciales de citrus sinensis (naranja) en la inhibición de hongos patógenos
en phaseolus vulgaris L. (frijol canario). ................................................... 24
Cuadro 2: Combinación de los tratamientos propuestos para la evaluación de
concentraciones de aceites esenciales de citrus sinensis (naranja) en la
inhibición de hongos patógenos en Phaseolus vulgaris L. (Frijol Canario).
................................................................................................................... 25
Cuadro 3: Materiales y equipos .................................................................................. 26
Cuadro 4: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición del
Crecimiento Radial de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey. ........ 34
Cuadro 5: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de
Germinación de Esporas de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey. . 35
Cuadro 6: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibicion del
Crecimiento Radial de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey. ......... 36
Cuadro 7: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de
Germinación de Esporas de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey. . 37
Cuadro 8: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición del
Crecimiento Radial de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey. ......... 39
Cuadro 9: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de
Germinación de Esporas de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey. . 40
Cuadro 10: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibicion del
Crecimiento Radial de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey. ......... 41
Cuadro 11: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de
Germinación de Esporas de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey.
................................................................................................................. 42

INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1: Crecimiento radial del Fusariumspp 1 ....................................................... 56

ANEXO 2: Crecimiento Radial del Fusarium spp 2 durante los 7 días de medición. . 57

xiv
ANEXO 3: Crecimiento radial de esporas del Fusarium spp 1 ................................... 58
ANEXO 4: Germinación de esporas del Fusarium spp 2 ............................................ 59
ANEXO 5: Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 1 ............................... 60
ANEXO 6: Inhibición del crecimiento radial de fusarium spp 2 ................................ 61
ANEXO 7: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 1 ....................... 62
ANEXO 8: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 2 ...................... 63
ANEXO 9: Fotos de la fase experimental. ................................................................... 64
ANEXO 10: Diagrama de bloques para la determinación de la concentración óptima de
aceite esencial de Citrus sinensis. (Naranja) en la inhibición de fusarium
spp presente en Phaseolus vulgaris l. (frijol canario). ............................. 71
ANEXO 11: Técnica de laboratorio para crecimiento radial ....................................... 73
ANEXO 12: Técnica de laboratorio para crecimiento de esporas ................................ 74
ANEXO 13: Certificado de Laboratorio ....................................................................... 76
ANEXO 14: Resultados obtenidos a partir de los datos del porcentaje de inhibicion de
crecimiento radial y germinacion de esporas de Fusarium spp 1 y
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) durante las primeras 48, 96 y 168
horas de incubación. ................................................................................ 77
ANEXO 15: Tablas de rangos múltiples para fusarium spp 1 durante las primeras 48,
96 y 168 horas. ........................................................................................ 80

xv
 CÓDIGO DUBLIN:

“Evaluación de las concentraciones de aceites esenciales de Citrus sinensis

Título:
(Naranja) en la inhibición de hongos patógenos en Phaseolus vulgaris L. (Frijol
Canario) almacenados en las bodegas del Cantón Quevedo 2016”

Autor: Daquilema Rea Jessica Alexandra

Palabras
claves: Cítricos Corteza Leguminosas Inhibición de Inhibición de
Crecimiento Radial Esporas.
Editorial: Quevedo: Universidad Técnica Estatal de Quevedo, 2016
Resumen: Resumen.- En esta investigación se evaluó las concentraciones del aceite esencial de Citrus
(hasta 300 sinensis, frente a hongos patógenos presentes en frijol canario almacenados en bodegas del cantón
palabras) Quevedo. Se obtuvo aceite esencial extraído de hojas, de corteza y se adquirió un aceite comercial
proveniente de ISABRUK BOTANIC S.A. Las semillas del frijol canario fueron sembradas en
cajas Petri con PDA durante 7 días para luego ser aislados e identificados, obteniendo el género
Fusarium spp de dos especies. Las concentraciones de aceite esencial utilizadas fueron del 1,5 %
2,5 % y 3,5 %. La actividad antifúngica de los aceites esenciales se determinó mediante el
crecimiento radial de micelio y germinación de esporas. Obteniendo los siguientes resultados: una
mayor actividad antifúngica en aceite esencial comercial con un porcentaje de inhibición del 100%
en Crecimiento Radial y germinación de esporas. El aceite esencial extraído de las hojas obtuvo un
95% y 91% en crecimiento radial y un 100 % de inhibición en germinación de esporas, mientras
que el aceite esencial extraído de corteza no tuvo un efecto antifúngico en cuanto a inhibición del
crecimiento micelial del Fusarium spp, sin embargo este mismo aceite logro inhibir en un 90% la
germinación de esporas. A concentraciones bajas se pudo obtener un mayor efecto antifúngico sin
necesidad de recurrir a concentraciones más elevadas. Con una concentración del 1,5% de aceite
esencial comercial se obtuvo un efecto antifúngico que inhibió en su totalidad el crecimiento radial
y en la germinación de esporas se evidencio una inhibición total. Mientras que con el aceite esencial
extraído de hojas, se observó un mayor efecto antifúngico con una concentración del 2,5%. El
efecto antifúngico del aceite esencial de Citrus sinensis fue evidente en la inhibición de Fusarium
spp esto debido a los componentes que presenta dicha fruta en sus hojas y corteza.

Descripción: 88 hojas : dimensiones, 29 x 21 cm + CD-ROM 6162

URI: (en blanco hasta cuando se dispongan los repositorios)

xvi
 INTRODUCCION

Para el desarrollo de este proyecto se extrajo por hidrodestilación aceite esencial de

cortezas y hojas de Cicrus sinensis (naranja) con el fin de utilizarlo en la inhibición
de hongos patógenos presentes en frijol canario.

En el caso de las plantas del género Citrus, la mayoría de los aceites esenciales
están contenidos en pequeñas glándulas de la cáscara de la fruta, y se compone de
más de un centenar de componentes (terpenos, alcoholes, aldehídos y ésteres, entre
otros) que conjuntamente determinan las características del aceite. La destilación
del aceite esencial de las hojas de las plantas cítricas es menos común [1].

Dentro del grupo de las leguminosas que poseen semillas comestibles, el frijol es
uno de las más importantes. Actualmente se encuentra distribuido en los cinco
continentes y es un componente esencial de la dieta, especialmente en
Centroamérica y Sudamérica [2].

Los microorganismos ya sean hongos, bacterias, nematodos y virus; son

responsables de enfermedades a pesar de no tener un síntoma característico para
cada uno de ellos. Varias especies de hongos que normalmente habitan en el suelo
son responsables de causar las pudriciones radicales en frijol, entre ellos sobresalen:
Fusarium, Rhizoctonia, Pythium y Sclerotium [3].

Además, no solo es conocido por sus propiedades antifungicas y antioxidantes sino

tambien por su poder repelente frente a la especie Tribolium castaneum, Herbst,
una de las principales plagas de cereales y productos almacenados [4].

Mediante la utilización de aceite esencial de Citrus sinensis (naranja) extraído de

hojas, corteza y utilizando una marca comercial se pretende evaluar la
concentración inhibitoria de hongos patógenos en el frijol canario almacenado; lo
cual brinda una alternativa diferente de conservación de este alimento y aporta un
conocimiento eficaz en el área científica.

1
 CAPÍTULO I

CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

2
1.1. Problema de Investigación
1.1.1. Planteamiento del problema

La pequeña industria obtiene aceites esenciales destinados para la aromaterapia y

farmacéuticas. Los aceites esenciales tienen propiedades antimicrobianas y están
declarados como GRAS (generalmente reconocidos como seguros) FAO (2006), pero
son pocas las investigaciones sobre el aprovechamiento de estas propiedades. Mayores
son las investigaciones de aceites esenciales de corteza y no así de las partes aéreas del
árbol de naranja.

Los aceites esenciales y extractos de plantas se han utilizado desde hace mucho tiempo
para obtener aromas y sabores. Se han estudiado los extractos y aceites esenciales de
especies y condimentos y especias desde un punto de vista funcional. Es decir se ha
estudiado si los extractos o aceites tienen actividad antimicrobiana, si actúan como
agentes antioxidantes o si aportan nutrientes. Los métodos de obtención de los aceites
esenciales determinan el uso de los mismos [5].

Diagnóstico

El almacenamiento indebido en bodegas causa en el frijol canario contaminación por

hongos, logrando que este pierda capacidad de germinación, decoloración y otras
afecciones. Esto de igual manera provoca que los consumidores se vean afectados al
ingerir leguminosas infectadas con micotoxinas. El estudio del aceite esencial extraido
de hojas y de corteza de naranja como inhibidor de hongos patogenos en frijol canario
ha sido poco frecuente debido a esto se desconoce su efecto inhibidor en hongos de
almacén.

Pronóstico

Los aceites esenciales de hojas y corteza de Citrus sinensis inhibirán los hongos
patógenos en Phaseolus vulgaris L almacenado.

3
1.1.2. Formulación del problema

Se desconocen las concentraciones inhibitorias de aceites esenciales extraidos de hojas

y corteza de Citrus sinensis (naranja) de hongos patógenos en Phaseolus vulgaris L.
(frijol canario) almacenados.

1.1.3. Sistematización del problema

Es necesario identificar los hongos patógenos presentes en el frijol canario almacenados

en bodegas.
Se desconoce la actividad antifúngica del aceite esencial de naranja (Citrus sinensis) en
hojas, corteza y comercial.
Es preciso conocer la concentración inhibitoria de los aceites esenciales para la
inhibición de hongos presentes en el frijol canario (Phaseolus vulgaris L.)

1.2. Objetivo
1.2.1. Objetivo general

 Evaluar las concentraciones de aceites esenciales de naranja (Citrus sinensis) en

la inhibición de hongos patógenos en frijol canario (Phaseolus vulgaris L.)
almacenados.
1.2.2. Objetivos específicos

 Identificar los hongos patógenos presentes en el frijol canario almacenados en

bodegas.

 Evaluar la actividad antifúngica del aceite esencial de naranja (Citrus sinensis)

de hojas, corteza y comercial.

 Determinar la concentración de los aceites esenciales para la inhibición de

hongos presentes en el frijol canario (Phaseolus vulgaris L.).

4
1.3. Justificación

Esta investigación radica en la importancia de preservar de daños por

contaminación de hongos al frijol canario; debido a que se destacada por las
propiedades nutritivas que posee, de manera fundamental por su alto contenido en
proteínas y en menor medida en carbohidratos [6].

Se conocen alrededor de 3000 tipos de aceites esenciales, aunque solo 300 tienen
importancia comercial. Además, se puede afirmar que a escala mundial, los 18
aceites esenciales más importantes representan casi el 50% del total del valor. Casi
el 90% del consumo mundial de aceites esenciales y absolutos, se produce solo en
13 países, liderados por EEUU y China, que acaparan juntos el 44 % del consumo
mundial [7].

Mediante la aplicación de aceite esencial de naranja extraído de varios orígenes

como son de: hojas y corteza; se evaluará el porcentaje de crecimiento radial de
hongos en el frijol canario y el crecimiento de esporas presentes en el mismo. Sin
embargo existe otro factor que debe tomarse en cuenta para el estudio antifúngico
de hongos y es el aceite esencial comercial adquirido.

Los aceites esenciales presentan la propiedad de inhibir el crecimiento de

microorganismos, expresada como actividad antimicrobiana, actuando como
agentes bacteriostáticos o antifúngicos [5]. Esto permitirá conocer la importancia
que posee los aceites esenciales, al estudiar y evaluar el poder antifúngico no solo
permitirá controlar hongos patógenos en frijol; si no también otorgara un amplio
conocimiento para futuras investigaciones.

1.4. Hipótesis

 Las concentraciones de aceites esenciales de naranja inhibirán hongos

patógenos en frijol canario almacenados.

5
 CAPÍTULO II

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN

6
2.1. Marco conceptual

2.1.1. Aceite Esencial

Los AE son una mezcla compleja de compuestos orgánicos volátiles, algunos de ellos
con actividad atrayente o repelente de insectos. Dentro de los compuestos presentes en
estas mezclas con alta actividad repelente están: α-pineno, eugenol, limoneno, terpineol,
citronelol, citronelal, alcanfor y timol [4].

Generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias
responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica
(saborizantes). Los aceites esenciales se clasifican en base a diferentes criterios:
consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios [8].

Sin embargo no todos los extractos olorosos de plantas oleaginosas cumplen con la
definición de un “aceite esencial”. El documento ISO/DIS 9235.2 de la Organización
Internacional de Normas (ISO) define a un aceite esencial, correspondiente a materias
primas aromáticas naturales, como: “Producto obtenido a partir de materias primas
vegetales, ya sea por destilación con agua o vapor, o desde el epicarpio de los frutos
cítricos mediante un proceso mecánico, o por destilación seca” [9].

2.1.2. Obtención de Aceites Esenciales.

La obtención del aceite se efectúa generalmente por métodos mecánicos “presión en frío
de la cáscara”, sin embargo también se realiza el proceso de extracción del aceite por
medio de hidrodestilación (HD), destilación con vapor (VD), hidrodestilación asistida
por microondas (MWHD), extracción con solvente (SE) y extracción con fluidos
supercríticos (CO2) (SFE) [10]. La forma tradicional de obtener los compuestos
volátiles como aceites esenciales de cítricos es principalmente por prensado en frío para
corteza de cítricos [11].

7
2.1.3. Hidrodestilación.

La hidrodestilación es un método de destilación que consiste en evaporar una

suspensión acuosa del material vegetal que durante toda la operación se encuentra
sumergido en agua y en constante agitación para evitar aglomeración o sedimentación
que pueden degradar térmicamente el aceite esencial [9].

Los aceites esenciales poseen un punto de ebullición superior al del agua, pero en la
mezcla de aceite esencial más agua presenta un punto de ebullición inferior y por esto
puede ser destilada; al pasar por el condensador los vapores se enfrían, se condensan y
se transforman en un líquido formado por dos fases inmiscibles [12].

2.1.4. Propiedades Antifungicas.

Los componentes de los aceites esenciales muestran actividades prometedoras contra

patógenos transmitidos por los alimentos y los microorganismos causantes de deterioro
[13]. Algunos poseen propiedades insecticidas, antifúngico y antibacterianas frente a
microorganismos patógenos y han sido considerados como ingredientes activos en
algunos plaguicidas botánicos, debido a su eficacia frente a un número considerable de
plagas, su toxicidad mínima en mamíferos y su disponibilidad general [14].

2.1.5. Características de las propiedades antifúngica de los aceites esenciales

La actividad antifúngica de los aceites esenciales se asocia al contenido de fenoles

monoterpenos especialmente el de tomillo (Thymus vulgari L.), orégano (Origanum
vulgare L.) y clavo (Eugenia caryophyllata Thunb). Su mecanismo de acción se asocia
con la capacidad de interactuar con el citoplasma del patógeno y su modo de acción
parece estar estrechamente relacionado con la solubilidad de cada compuesto. Se ha
reportado toxicidad en humanos por la utilización de los aceites esenciales puros o en
altas concentraciones, ocasionando desde irritaciones en la piel hasta cáncer [15].

Sin embargo, la utilización de aceites en concentraciones mínimas no genera

alteraciones en el organismo, siendo además productos considerados como GRAS. Los
aceites esenciales han mostrado una actividad fungicida contra patógenos postcosecha
en un amplio intervalo de hongos. Actualmente, se han reportado varias investigaciones
en donde se demuestra la actividad fungicida de los aceites esenciales [15].

8
Los experimentos de Screening han informado que el tomillo, clavo, canela, laurel,
orégano, ajo y limón son algunos de los mejores candidatos de amplio espectro para la
inhibición de los agentes patógenos transmitidos por los alimentos y microorganismos
de descomposición ya que estos poseen los cinco principales componentes activos
contra 25 microorgansimos [16]. Son relativamente pocos los estudios sobre la
actividad antimicrobiana de aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos o en
alimentos propiamente dichos. Sin embargo, en los estudios realizados se ha logrado ver
que la eficacia de los aceites esenciales “in vitro” es frecuentemente mucho mayor que
en los alimentos [17].

Tabla 1: Concentraciones mínimas inhibitorias de aceites esenciales probados “in

vitro” contra microorganismos patógenos transmitidos por alimentos (Burt,
2004).

Planta de la cual se deriva el CMI rango

Especie bacteriana
AE aproximado(ul/ml)
Romero Escherichia coli 4.5 - > 10
Salmonella typhimurium > 20

Bacillus cereus 0.2

Staphyloccocus aureus 0.4 10
Listeria monocytogenes 0.2
Orégano E. coli 0.5 1.2
S. typhimurium 1.2
S. aureus 0.5 1.2
E. coli 0.6
S. typhimurium 2.5
S. aureus 0.6
E. coli 3.5 5
S. typhimurium 10 20
S. aureus 0.75 10
L. monocytogenes 0.2
E. coli 0.4 2.5
S. typhimurium > 20
L. monocytogenes 0.3
E. coli 0.45 1.25
B. cereus 5 10
Fuente: Rodríguez Elvia. 2011

9
2.1.6. Actividad biológica

En los últimos años se ha evidenciado un extraordinario auge de la química de los

productos naturales en el ámbito mundial. Entre los tres grupos de productos de origen
botánico que con mayor probabilidad tendrán el impacto más notable en la protección
de plantas en la próxima década se encuentran los aceites esenciales y sus
constituyentes, provenientes de diferentes especies vegetales [18].

Los componentes de aceites esenciales como el limoneno y derivados hidroxilados han

mostrado potencial uso en la quimioterapia del cáncer mamario. Los aceites esenciales
de varias especies de Sideritis sp., Lamiaceae, y otras plantas, presentan actividad
antimicótica (hongos patógenos al hombre), y en menor grado presentan actividad
antimicrobiana. El aceite esencial de Cymbopogon densiflorus tiene actividad contra
varias bacterias Gram-positivas y Gram-negativas [19].

2.1.7. Aceite Esencial de cítricos

Los aceites esenciales de cítricos son una mezcla de compuestos volátiles y consisten
principalmente en hidrocarburos monoterpénicos, que poseen altos niveles de
insaturación y son generalmente inestables, debido a muchos factores, tales como la luz,
el calor, oxidación e hidratación [11]. Estas mezclas contienen más de un centenar de
compuestos, las mismas que se agrupan en tres fracciones: hidrocarburos terpénicos,
compuestos oxigenados y compuestos no volátiles. La fracción terpénica puede
constituir de 50 o más del 95% del aceite [20].

2.1.8. El uso de Aceite esencial de Cítricos como una alternativa "natural" para la
preservación química de los alimentos.

Las nuevas tecnologías de procesamiento de alimentos, incluidos los antimicrobianos

naturales están cobrando cada vez mayor importancia. Los AE de cítricos se han
aplicado industrialmente en muchos productos, incluidos los alimentos y bebidas y las
actividades contra algunos de los patógenos más importantes transmitidos por los
alimentos se han [Link] AE de cítricos tienen un gran potencial para satisfacer
las demandas de los alimentos, farmacéutica y cosmética, ya que no sólo son fáciles y
baratas de producir sino que son también sin ningún riesgo percibible para los seres
humanos [21].

10
2.1.9. Aceite esencial de naranja.

El aceite esencial de naranja se encuentra principalmente en sacos de forma ovalada en

el flavedo o en la porción anaranjada de la cáscara y actúa como una barrera natural
para muchos microorganismos e insectos, [10]. Además, no solo es conocido por sus
propiedades antifungicas y antioxidantes sino tambien por su poder repelente frente a la
especie Tribolium castaneum, Herbst, una de las principales plagas de cereales y
productos almacenados [4].

2.1.10. Aceite esencial de hojas de naranja

Los aceites esenciales de hojas son productos obtenidos a partir de materiales vegetales
crudos que deben ser extraídos por medios físicos [11]. Son ampliamente utilizados en
la medicina y la industria alimentaria para estos fines. El creciente interés en las
sustancias naturales está llevando a la comunidad de investigadores a encontrar nuevos
usos para las aplicaciones de estas sustancias [13].

2.1.11. Aceite esencial de corteza de naranja

Están presentes en los sacos de aceite o barras de aceite situado a diferentes

profundidades en la cáscara y los cuerpos de la fruta. Se aplican en muchos productos,
como alimentos, bebidas, cosméticos y medicamentos, como agentes aromatizantes, así
como para la aromaterapia [11].

La cáscara de cítricos tiene numerosas glándulas que contienen aceite; cada uno de los
cítricos tiene su propio conjunto de compuestos característico que posee el aceite y que
son responsables de su sabor y aroma a productos como el carbonatado, bebidas,
helados, tortas, ambientadores y perfumes. Se elige la cáscara de naranja para extraer el
aceite esencial porque proporciona gran potencial para la forma comercial adicional
[20].

11
Tabla 2: Composición química (%) de AEs de bergamota, limón y naranja a partir de
partes de cascara frescas identificadas mediante análisis de GC-MS

Porcentaje (%)
N° Compuesto RI
AE AE AE
Comp Compuesto Co
uestos s RI m Bergamota Limón Naranja
RI1 α-pineno pu
935 00,77 03,07 00,22
2 β-Phellandreno est
964 01,92 - -
os
3 β-pineno 980
RI 03,45 17,04 01,62
4 β-Myrcene 990 - 02,37 03,20
5 Octanal 1006 01,25 - -
6 Carene 1020 - - 01,09
7 Limoneno 1033 77,37 51,40 02,20
8 Ocimeno 1048 - - 02,24
9 γ-Terpineno 1060 - 13,46 -
10 β-Linanol 1080 01,22 - 23,37
11 Decanal 1175 00,83 - -
12 Nerol 1207 - 01,50 -
13 Geraniol 1234 - 02,43 -
14 Acetato de Linanilo 1255 - - 37,29
15 Citral 1336 - - 00,34
16 Acetato de Nerilo 1365 - 01,05 04,10
17 Acetato de Geranilo 1384 - - 06,35
18 Caryophyllene 1428 - - 01,12
19 Naftaleno - 01,42 - -
20 Isocaryophyllene - - 01,23 -
Total de los componentes
8821 93,55 83,14
identificados (%)
Rendimiento 0,60 0,70 0,58
Fuente: Djamel Djenane 2015

12
2.1.12. Microorganismos

Como microorganismo se define a cualquier organismo vivo que no sea visible a simple
vista. Esta definición operativa no incluye los hongos, tanto inferiores como superiores,
ni las algas aunque ambos grupos son considerados microorganismos porque su
organización es esencialmente unicelular (las células que los constituyen mantienen un
alto grado de autonomía entre sí). Por otra parte, organismos pluricelulares pueden ser
de tamaño tan pequeño que entren dentro de la definición anterior sin dejar por ello de
ser estructuralmente tan complejos como cualquier animal superior [22]

Los microorganismos se agrupan en dos categorías: procarióticos y eucarióticos. En la

primera están las archaeas y las bacterias, mientras que en la segunda se encuentran
hongos, algas y protozoarios. No obstante, de manera convencional los virus, viroides y
priones son también considerados microorganismos [23].

2.1.13. Hongos

Los hongos son heterótrofos y como saprofitos obtienen su alimento de la materia

orgánica muerta o se alimentan de huéspedes vivos parasitándolos. Pueden destruir
plantas completas y restos de animales degradándolos a formas químicas simples que
pasan al suelo y son absorbidas por otra generación de plantas [24].

2.1.14. Fusaryum spp

El género Fusarium habita en el suelo y sobrevive entre los restos de plantas infectadas
que yacen en el mismo en forma de micelios mediante clamidiosporas. Los tubos
germinales de las esporas penetran directamente por las puntas de la raíz, mediante
heridas o a nivel de zonas donde se forman las raíces laterales. El micelio se propaga
intercelularmente a través de la corteza de la raíz y cuando llega a los vasos xilemáticos
ascienden hasta la parte superior de las plantas en el torrente de la savia obstruyendo los
vasos y afectando el transporte de agua, causando la marchitez de las hojas. Fusarium
forman estructuras de resistencia en el suelo que les permite subsistir bajo condiciones
adversas del medio ambiente [25].

13
2.1.15. Frijol canario

Es un grano perteneciente a la familia Fabaceae de la subfamilia Papilonoidea, género

Phaseolus y especie vulgaris Linneo [26]. El frijol (Phaseolus vulgaris L.) es de las
leguminosas más importantes del mundo; su cultivo está extendido en los cinco
continentes y es uno de los alimentos básicos en África, América Latina y el Caribe
[27]. En la producción del frijol se pueden elevar los rendimientos a niveles entre 57 a 75
quintales por hectárea, haciendo de éste un cultivo rentable y no de subsistencia, como
normalmente se considera [28].

Esta clase comprende a las variedades de grano de color amarillo especial, similar al ave
canario. Las variedades de este tipo son originarias del Perú desde donde se introdujeron a
México en los años 70 [29].

Tabla 3.- Variedades de frijol cultivadas en Ecuador

Clase de grano
Variedad Color Tamaño Origen
Amarillo Matahambre Amarillo moteado Mediano
Bayo Bolón Pardo Grande
Bola 60 días Blanco Grande
Canario Amarillo Mediano Introducido de Perú
Canario Bolón Amarillo Grande
Calima Crema con pintas Grande
rojas
Cargabello Crema con pintas Grande
rojas
Cocacho Pardo Mediano Introducido de Perú
Machetón
Magola Rosa moteado Grande
Panamito Blanco Pequeño
Percal Crema moteado Mediano
Rojo Bolón Rojo Grande
Uribe Rosado moteado Grande Introducido de Colombia
Fuente: Voysest, O. (1983)

14
Tabla 4.- Valor nutricional del frijol canario por cada 100 g

Valor nutricional
Nutrientes. Cantidad.
Energia 339
Proteina 21.90
Grasa Total (g) 2.10
Colesterol (mg) -
Glúcidos 60.10
Fibra (g) 2.90
Calcio (mg) 138
Hierro (mg) 6.60
Yodo (µg) -
Vitamina A (mg) 0
Vitamina C (mg) 6.30
Vitamina D (µg) -
Vitamina E (mg) -
Vitamina B 12 (µg) -

Folato (µg) -
Fuente: Fundacion Universitaria Iberoamericana. 2012

2.1.16. Almacenamiento en bodegas

En particular los granos y las semillas son infectados por diversos hongos en el campo
entre ellos Fusarium sp., Alternaria sp. y Helminthosporium sp. Por otra parte, los
granos también pueden ser invadidos por hongos de almacén, siendo Aspergillus sp. y
Penicillium sp. los principales géneros de hongos que se presentan. Durante su
desarrollo en los granos, los hongos causan diferentes clases de daños, siendo los más
importantes la pérdida de capacidad de germinación, decoloración, calentamiento y
producción de micotoxinas. Existen varios métodos de control de plagas, pero
desgraciadamente las sustancias químicas empleadas en el control de insectos han
provocado el desarrollo de resistencia, contaminación ambiental y riesgos de salud
pública. Así mismo, actualmente no existe ningún método de control de hongos, sólo
medidas preventivas como monitorizar la temperatura y la humedad del grano [30].
15
2.1.17. Granos dañados por hongos
Granos de frijol y sus partes que presentan en la superficie, en el germen o en los
cotiledones, afectación parcial o total por desarrollo de hongos de campo y/o de
almacén [26].

2.2. Marco Referencial

2.2.1. Catálogo de hongos en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.)
Los hongos transmitidos por semillas son una gran limitación para la producción de
frijol en Nicaragua y causa grandes pérdidas en el rendimiento. Sin embargo, la
identificación de hongos trasmitidos por semillas ha ganado poca atención. Una de las
prioridades es identificar aquellos transmitidos por semillas en el cultivo del frijol. Los
hongos identificados mediante secuencias de espacios internamente transcritos fueron:
Complejo de Fusarium (F. chlamydosporum, F. equiseti y F. incarnatum);
Macrophomina phaseolina (anamorfo o sinónimo Rhizoctonia bataticola);
Lasiodiplodia theobromae (teleomorfo Botrysphaeria rhodina) Corynespora cassiicola;
Collectotrichum gloesporiodes (teleomorfo Glomerella cingulata); Colletotrichum
capsici; Diaporthe sp/Phomopsis. Mediante identificación de prueba de incubación y
prueba de germinación en sustrato estéril fue detectado la presencia de Rhizoctonia
solani Kühn [31].

2.2.2. Propiedades Antifúngicas en Plantas Superiores. Análisis Retrospectivos de

Investigaciones

Para el tratamiento de semillas, los mejores productos han sido los aceites esenciales
que pueden tener acción inclusive sobre la parte interna de las semillas. Contra A.
flavus en maíz, se han conseguido excelentes resultados con los aceites esenciales de
canela, clavo, orégano, epazote, albahaca, tomillo y yerbabuena a su máxima
concentración; sólo el ajo, la pimienta negra y la cebolla no tuvieron efecto eficiente.
Mientras que los aceites de clavo, canela y tomillo demostraron su efecto
fungicida sobre Fusarium moniliforme; sin embargo, el efecto de los aceites, ha
sido en dosis altas; en maíz se requieren dosis de 8% en yerbabuena y 3% para
epazote, en tanto que en sorgo, el clavo, la canela y el tomillo requieren dosis de

16
10% para un efecto óptimo; en contacto directo del hongo con el aceite, la
concentración mínima efectiva es mucho menor, como ocurrió con el tomillo que fue
eficiente a 150 ppm para inhibir a F. moniliforme. Se han probado combinaciones de
aceites esenciales y en algunos casos se han obtenido lo que llamamos efecto
sinérgico (que no corresponde estrictamente al concepto); es decir, utilizando dosis por
debajo de la mínima eficiente para cada producto, al combinar dos productos se obtiene
también la eliminación del hongo, como sucede con la combinación de la canela con el
clavo, el orégano, el epazote y el tomillo contra Aspergillus flavus [32].

2.2.3. Actividad antifúngica del aceite esencial de naranja (Citrus sinensis L.)
sobre hongos postcosecha en frutos de lechosa (Carica papaya L.)

En este estudio se evaluó la actividad antifúngica del aceite esencial de naranja (Citrus
sinensis L.) sobre los hongos Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium indicum,
Fusarium solani, Rhizopus stolonifer y Aspergillus flavus, en medio de cultivo Papa
Dextrosa Agar (PDA) en un diseño completamente al azar. Los resultados mostraron
que existe un efecto inhibidor del aceite esencial de naranja (AEN) en el crecimiento
micelial de los hongos in vitro, superior al 80% a concentración de AE de 1%, y 100%
de inhibición a concentraciones de 2,5% y 5% de AE (p<0,05). Al ser utilizado como
recubrimiento de los frutos, a concentraciones de 2,5% y 5%, disminuye la presencia de
lesiones en los mismos, sin diferencias significativas (p<0,05), con igual
comportamiento en efectividad in vitro e in vivo. El AEN puede ser una alternativa
factible, para el control natural y eficaz de hongos postcosecha, causantes de grandes
pérdidas en frutas para exportación y consumo [33].

2.2.4. Actividad antifúngica del aceite esencial y sus componentes en el

crecimiento de Fusarium sp. aislado de papaya (Carica papaya)

El efecto antifúngico de aceites esenciales y sus compuestos fue investigado en

bioensayos de inhibición del crecimiento micelial de Fusarium sp. Durante ocho días de
incubación se midió el diámetro de la colonia y se determinó la tasa de crecimiento
micelial. En general, el mejor efecto antifúngico fue observado con el aceite de Thymus
vulgaris, el cual presentó una total inhibición a 200, 250 y 300 µg/ml. Los aceites de
Cinnamomum zeylanicum, Syzygium aromaticum y Teloxys ambrosioides, exhibieron

17
una inhibición del crecimiento micelial dependiente de la dosis al incrementarla de 100
a 300 µg/ml. Mientras que los aceites de Allium sativum, Citrus aurantifolia, Ruta
chalepensis, Mentha piperita y Eucalyptus globulus no tuvieron actividad antifúngica en
las diferentes concentraciones probadas. Todos los compuestos con excepción del cineol
tuvieron un efecto fungicida o fungistático [34].

2.2.5. Evaluación preliminar de la actividad fungicida de los aceites esenciales de

eucalipto (Eucalyptus tereticornis, Myrtaceae) y cáscara de naranja (Citrus
sinensis, Rutaceae) sobre algunos hongos filamentosos

Se evaluó la actividad antifúngica de los aceites esenciales de Eucalyptus sp

(Myrtaceae) y cáscara de naranja, Citrus sinensis (Rutaceae) a diferentes
concentraciones frente a los modelos biológicos: Trichoderma harzianum, Absidia sp y
Fusarium oxysporum, hongo que es considerado como un patógeno importante de
humanos y plantas. El aceite esencial de eucalipto inhibió completamente el crecimiento
de este hongo a 3000 ppm, mostrando mayor potencial inhibitorio que el fungicida
comercial Dithane empleado a 10000 ppm. Los hongos Absidia sp y Trichoderama
harzianum resultaron ser más susceptibles a los componentes del aceite y su crecimiento
fue inhibido por completo a 1000 ppm. El aceite esencial de cáscara de naranja fue
menos efectivo y solamente mostró actividad fungicida sobre el hongo Trichoderma
harzianum a 11000 ppm. Los hongos F. oxysporum y Absidia sp no fueron afectados
por los componentes de ese aceite esencial en ninguna de las concentraciones evaluadas
(de 100 a 12000 ppm) [35].

2.2.6. Efecto de aceites esenciales extraídos de la cascara de dos especies de

cítricos en algunos hongos.

Este estudio investigó el efecto de los aceites esenciales extraídos de la cáscara de

Citrus limon y Citrus reticulata en dos especies de hongos: Penicillium expansum y
Fusarium proliferatum y también el efecto de dos fungicidas: Hymexazol y Benomyl
contra estos hongo. Los resultados demostraron que los aceites esenciales de C. limon
inhibían el crecimiento radial de P. expansum y F. Proliferatum a una concentración de
4,5 y 5%, respectivamente. Sin embargo, el aceite esencial de C. reticulata inhibieron
este crecimiento a una concentración de 5,5 % y 6%, respectivamente. Además, los dos
fungicidas estudiados inhibieron el crecimiento radial de este hongo [36].

18
En conclusión, existe una relación entre el aumento de la concentración y el porcentaje
de inhibición de crecimiento radial de hongos [36].

2.2.7. Actividad Antibacterial y Antifúngica In-Vitro de Aceites Esenciales

Seleccionados

La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales (aceite de naranja, aceite de

palmarosa moha y aceite Palmarosa CN-5) se evaluó mediante el método de difusión de
disco en bacterias patógenas humanas, es decir Staphylococcus aureus, Proteus Vulgaris
y hongos patógenos de plantas, es decir, Aspergillus niger, Penicillium Chrysogenum,
Fusarium acuminatum y Phanerochaete Chrysosporium. La actividad antimicrobiana in
vitro del aceite de naranja, Palmarosa moha y Palmarosa CN-5 contra los
microorganismos y su actividad potencial fueron evaluados cuantitativamente por
presencia o ausencia de zona de inhibición [37].

La actividad antifúngica del aceite de naranja se encontró menor que la de Neomicina

(ZOI 26,5 mm) y Cloxacilina (ZOI 28,5 mm). Los hongos patógenos vegetales (es
decir, Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Phenerochactan) se encontraron resistentes
al aceite de naranja con concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 60 μl de aceite. La actividad
antibacteriana y antifúngica del aceite de naranja fue insignificante (P> 0,05) en
comparación con los antibióticos estándar. La actividad del aceite de Palmarosa moha
se encontró mejor que la de Neomicina (ZOI 7,5 mm) y aceite de naranja [37].

2.2.8. Análisis multivariado de los componentes del aceite esencial del género
Cítrus y su actividad antifúngica

Los aceites esenciales y sus componentes químicos se analizaron mediante Análisis de

Componentes Principales (PCA) y el Análisis Cluster Jerárquico (HCA). La
identificación química y la cuantificación del Aceites esenciales basados en
cromatografía de gases acoplados a espectrometría de masas (GC / MS) mostrando
varias sustancias se correlacionan entre sí, siendo el limoneno el compuesto más
predominante. Los aceites esenciales fueron agrupados en tres grupos sobre la base de
análisis multivariante. El primer grupo Citrus sinensis (naranja) y Citrus reticulata
(ponkan), la segunda Citrus limonia (lima limón) y la tercera Citrus aurantifolia (lima)
y Citrus medica (citrón) [38].

19
Usando la concentración de 2000 μg mL-1, el aceite esencial del tercer grupo (lima,
citrón) inhibió completamente el crecimiento micelial de los hongos Fusarium
oxysporum y Alternaria alternata., mientras que los otros aceites esenciales con la
misma concentración presentó una menor poder inhibitorio. Por otro lado, utilizando la
misma concentración, sólo el aceite esencial del citrón fue capaz de inhibir
completamente el crecimiento micelial de los hongos Colletotrichum musae. Los aceites
esenciales de C. medica (cidra) y C. aurantifolia (cal) mostraron una inhibición total del
crecimiento micelial de los hongos F. oxysporum y A. alternata en la concentración de
2000 μg mL-1 [38].

2.2.9. Composición Química y Actividad Antifúngica de Aceites Esenciales de

Cítricos Argelinos

El objetivo de este estudio fue determinar la composición química de los aceites

esenciales de cítricos argelinos. Fueron extraídos por hidrodestilación de las hojas de
especies de cítricos (naranja, Bigaradier, mandarina y limón), utilizando cromatografía
de gases / espectrometría de masas (GC / MS). Su composición química y su actividad
antifúngica contra cuatro hongos fitopatógenos (Fusarium oxysporum, albedinis sp,
Penicelium sp., Alternaria sp. y Fusarium sp.). La concentración mínima inhibidora
(CMI) también se dio para los cuatro aceites. Diez compuestos fueron registrados
conjuntamente entre los 51 identificados, de los cuales limoneno (7,18 a 36,10%), β
pineno (4,35 a 30,0%) y linalol (0,21 a 63,03%) representan los principales compuestos
[39].

Estos resultados indican que los aceites esenciales se pueden emplear como fungicidas
contra hongos fitopatógenos. El crecimiento radial de Fusarium. ox, A. sp y Fusarium.
sp fueron significativamente reducido con aceite esencial de naranja en respuesta a las
concentraciones de aceites esenciales de bigaradier, mandarina y limon, con
concentraciones de 1 a 0,05 mg / ml. Los resultados de los efectos de la inhibición en la
producción y la germinación de las esporas por los aceites esenciales en comparación
con el Control, se expresan por el porcentaje de inhibición de la producción de esporas
(PIs%) y la inhibición porcentaje de germinación de las esporas (%) [39].

20
La producción de esporas fue fuertemente inhibida por los aceites de naranja,
Bigaradier, mandarina y limón en Fusarium oxysporum, Penicilium. sp y A. sp. El
mayor porcentaje de inhibición de germinación de esporas se registró en Penicilium. sp
con limón (97, 85%). Y se notó una estimulación de la producción de esporas con
Fusarium. sp para aceites esenciales de limón y mandarina [39].

Se estudió la capacidad de los cítricos para inhibir la germinación de las esporas a partir
de esporas de cultivos previamente expuestos a aceites esenciales. AEs de naranja,
Bigaradier, mandarina y limón fueron expuestos a inhibiciones de las diferentes esporas
germinadas. El más eficaz frente a todas las poblaciones de hongos probados fue el
aceite de naranja, con una fuerte inhibición de porcentaje de germinación de esporas de
(PIg 58,66 a 100%). Se observó en Alternaria sp una estimulación de la germinación de
las esporas por la bioactividad de los aceites esenciales extraídos de limón y mandarina
[39].

21
 CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

22
3.1. Localización

Para la desarrollo de este Proyecto de Investigación se utilizó materiales y equipos

disponibles en el Laboratorio de Química Básica, Biotecnología y Microbiología la
Universidad Técnica Estatal de Quevedo.

Ubicación geográfica.
Altitud: 76 m.s.n.m
Longitudes: 79º 28’ 30” Oeste
Latitud: 1º 6’ S
Tº media: 24.8

3.2. Tipo de investigación

Este proyecto es considerado una investigación que corresponde al nivel explicativo ya
que una de las mayores problemáticas en el almacenamiento de frijol en bodegas es el
daño ocasionado por hongos, esta infección produce pudrición, pérdida de capacidad de
germinación y riesgo a la salud pública; por tal motivo mediante la evaluación de
concentraciones de aceite esencial de naranja se pretende minimizar el daño ocasionado
por Fusarium en frijol almacenado.

3.3. Métodos de investigación

3.3.1. Método experimental

En esta investigación se aplica el método experimental al relacionar las variables de
estudio entre sí y controlando las demás variables que puedan surgir e influir en el
estudio; de esto se obtiene resultados en donde luego se aplicará análisis de varianza y
prueba de significación Tukey, utilizando el sistema Statgraphics.

3.3.2. Método inductivo- deductivo

En este Proyecto de Investigación se constató la contaminación de frijol por hongos
almacenados en bodegas. El investigador se involucra de lleno en la recopilación de
información y aplicación del conocimiento adquirido en el problema ya constatado
anteriormente.

23
En este caso sería el evaluar las concentraciones de aceite esencial de naranja para
inhibición de Fusarium spp en frijol canario. De esta manera mediante los resultados
obtenidos al estudiar estas variables se concluye si el aceite esencial de naranja inhibe o
no el hongo encontrado en frijol canario almacenado.

3.4. Fuentes de recopilación de información.

Las fuentes utilizadas para respaldar este Proyecto de Investigación fueron: libros,
artículos científicos (Scielo, Dialnet, entre otros.), revistas científicas, páginas web,
guías prácticas, de igual manera todo el aporte obtenido de cada fuente consta de su
respectiva bibliografía.

3.5. Diseño de la investigación

3.5.1. Diseño estadístico de la investigación.

Factores de estudio
Los factores de estudio que intervinieron en esta investigación fueron los siguientes:
 Factor A: 2 (Hongos aislados de Phaseolus vulgaris L.)
 Factor B: 3 (Aceites Esenciales)
 Factor C: 3 (Concentraciones de AEs)

Lo que corresponde a 18 tratamientos, con 2 repeticiones da un total de 36 tratamientos

en la investigación.

Cuadro 1: Factores de estudio para la evaluación de concentraciones de aceites

esenciales de citrus sinensis (naranja) en la inhibición de hongos patógenos
en Phaseolus vulgaris L. (frijol canario).

Factores Simbología Descripción

A: Hongos a0 Hongo 1
a1 Hongo 2

B: Aceites esenciales b0 Hojas

b1 Corteza
b2 Comercial
C: Concentraciones c0 150 ul
c1 250 ul
c2 350 ul
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

24
3.6. Instrumentos de investigación

En la presente investigación los datos de cada uno de los tratamientos obtenidos fueron
ingresados en un programa estadístico como es el Statgraphics que permite establecer si
es que existe o no diferencia significativa entre cada uno de los factores analizados.

3.7. Tratamiento de los datos

Cuadro 2: Combinación de los tratamientos propuestos para la evaluación de

concentraciones de aceites esenciales de citrus sinensis (naranja) en la
inhibición de hongos patógenos en Phaseolus vulgaris L. (Frijol Canario).

Tratamiento Simbología Descripción

T1 a0b0c0 Fusarium spp 1, Hojas, 1,5 %.

T2 a0b0c1 Fusarium spp 1, Hojas, 2,5 %
T3 a0b0c2 Fusarium spp 1, Hojas, 3,5 %
T4 a0b1c0 Fusarium spp 1, Corteza, 1,5 %
T5 a0b1c1 Fusarium spp 1, Corteza, 2,5 %
T6 a0b1c2 Fusarium spp 1, Corteza, 3,5 %
T7 a1b0c0 Fusarium spp 1, Comercial, 1,5 %
T8 a1b0c1 Fusarium spp 1, Comercial, 2,5 %
T9 a1b0c2 Fusarium spp 1, Comercial, 3,5 %
T10 a1b1c0 Fusarium spp 2, Hojas, 1,5 %
T11 a1b1c1 Fusarium spp 2, Hojas, 2,5 %.
T12 a1b1c2 Fusarium spp 2, Hojas, 3,5 %
T13 a3b0c0 Fusarium spp 2, Corteza, 1,5 %
T14 a3b0c1 Fusarium spp 2, Corteza, 2,5 %
T15 a3b0c2 Fusarium spp 2, Corteza, 3,5 %
T16 a3b1c0 Fusarium spp 2, Comercial, 1,5 %
T17 a3b1c1 Fusarium spp 2, Comercial, 2,5 %
T18 a3b1c2 Fusarium spp 2, Comercial, 3,5 %
Elaborado: Daquilema, J. (2016)

3.8. Recursos humanos y materiales

 Tutor de proyecto de investigación
 Jefe de laboratorio de Microbiología
 Jefe de laboratorio de Química básica
 Jefe de laboratorio de Biotecnología

25
Cuadro 3: Materiales y equipos

PDA (Papa Dextrosa Agar)

Materiales Equipos Reactivos
Matraz Erlenmeyer 1000mL Microondas PDA (Papa Dextrosa Agar)
Marcador indelible Refrigerador Sulfato de Estreptomicina”GM”
Papel aluminio Autoclave Alcohol
Varilla de vidrio Balanza Agua destilada
Envases de vidrio
Aislamiento hongos.
Cajas Petri Cámara de aislamiento PDA (Papa Dextrosa Agar) con
Probeta 100 mL laminar antibiótico ( Sulfato de
Marcador indeleble Incubadora Estreptomicina”GM”) al 1%.
Algodón Alcohol
Papel toalla Agua esterilizada
Bisturí Hipoclorito al 3%
Pinzas de disección
Cinta Parafilm
Mechero
Repique de hongos
Materiales Equipos Otros
Tubos de ensayo Cámara de aislamiento Hongo madre por identificar.
Cajas Petri laminar Alcohol
Gradilla Refrigerador
Marcador indeleble Incubadora
Algodón
Asa
Mechero
Inhibición de hongos
Materiales Equipos Reactivos
Matraz Erlenmeyer 100mL Cámara de flujo laminar PDA (Papa Dextrosa Agar)
Probeta de 100 mL Incubadora Sulfato de Estreptomicina”GM”
Cajas Petri Contador de colonias Alcohol
Marcador indelible Agua destilada
Algodón Solución de TWEEN 20
Mechero Aceite esencial de hojas y corteza
Asa de mandarina
Micropipeta de 100 µL a Aceite esencial de hojas y corteza
1000µL de naranja
Cinta Parafilm
Pipetas Pasteur esterilizadas
Calibrador de Vernier

Conteo de esporas.
Probeta de 10mL Microscopio Olympus Solución de tween 20
Varilla de vidrio CX21 Agua esterilizada
Gasa Agitador Alcohol
Microtubos eppendorf Cámara de recuento
Micropipeta de 10µL a 100µL Neubauer
Marcador indeleble Contador de Esporas
Mechero
Papel toalla
Elaborado: Daquilema, J. (2016)

26
3.9. Manejo específico del experimento.

Para la inhibición de los hongos (Fusarium sp) aislados de frijol canario (Phaseolus
vulgaris L.) aplicando aceites esenciales de naranja (corteza, hojas) y aceite comercial
obtenido de Isabruk Botanic.

 Obtención de los aceites esenciales

Para la extracción de aceite esencial se empleó el método de hidrodestilación por
arrastre con vapor de agua convencional (HD) con capacidad para 4 L (balón de
destilación) [40].

Se pesó 200 g del material vegetal y la corteza del fruto, se seleccionó y troceó.
Fueron introducidos en el balón de extracción, el cual contenía 400 mL de agua
destilada. En el proceso de arrastre con vapor empleando manta de calentamiento el
tiempo de extracción fue de 4 horas a 70 °C. Para la separación del aceite esencial
del agua se utilizó éter etílico y sulfato de sodio, conservando los aceites en frascos
ámbar protegidos de la luz en refrigeración a 4 °C.

Mientras que el aceite esencial comercial se adquirieron del laboratorio ISABRUK

BOTANIC.S.A. de la ciudad de Ambato.

 Preparación del PDA (Papa Dextrosa Agar)

Para la preparación del PDA se utilizó 39 g de PDA (Papa Dextrosa Agar) disueltos
en 1000 mL de agua esterilizada, seguido de esto se mantuvo en el microondas
durante 10 minutos para que se disuelva completamente. Se esterilizó por tres horas
en el autoclave. Cuando estuvo completamente esterilizado, se esperó hasta que el
PDA se entibie para disolver los antibióticos; 500 uL de cada uno, en este caso fue
Cloranfenicol y Sulfato de Estreptomicina, para su conservación se lo mantuvo en
refrigeración.

 Desinfección del frijol.

Se desinfecto las muestras en una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% durante 3
minutos. Se enjuagó luego los muestras desinfectadas con agua destilada estéril y se

27
colocó las muestras lavadas sobre toallas de papel estériles hasta que se sequen
[41].
 Aislamiento de los hongos.
Para el aislamiento de los hongos realizándose en la cámara de aislamiento laminar
previamente desinfectada con alcohol, con la pinza esterilizada se siembra cinco
muestras de frijol canario en la caja petri dispensada con PDA (Papa Dextrosa Agar)
rotulando y sellando con cinta Parafilm para dejar en la incubadora por 7 días a
27°C; cuando el hongo se desarrolló completamente se mantuvo en refrigeración ya
que esta se considera como muestra madre.

 Repique de hongos aislados

En la cámara laminar se aíslo el hongo se abre la caja petri del hongo madre cerca
del mechero y con el asa se quitó una parte del hongo sembrándolo en el centro de
los tubos de ensayo con PDA (Papa Dextrosa Agar) tipo pico flauta se dejaron en la
incubadora a 27°C por 5 días; posteriormente para conocer el tiempo de desarrollo
del hongos se sembró en cajas Petri y se esperó hasta que el hongo cubrió totalmente
la caja; el hongo encontrado fue Fusarium de dos especies que lograron
desarrollarse en 7 días

 Proceso de Inhibición de hongos.

Para la inhibición del hongo Fusarium sp de dos especies (F sp1 y F sp2 )se dejaron
dos testigo para comparar con los tratamientos evaluando el porcentaje de inhibición
de los aceites esenciales de la naranja obtenidos de la corteza y del material vegetal;
se utilizaron concentraciones de 3,5%, 2,5% y 1,5% disueltos en una solución de
Tween 20 y PDA dispensado en cajas Petri, se sembró los hongos dejándolos en la
incubadora a 24°C; se realizó un control del desarrollo de los hongos durante 7 días
midiendo el crecimiento radial con el calibrador Vernaut y el contador de colonias.

Se realizó la evaluación del Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR),

empleando la fórmula de Abbott [42].

𝑅𝐶 − 𝑅𝑇
𝑃𝐼𝐶𝑅 (%) = × 100
𝑅𝐶

Dónde: RC = Radio del micelio del control.

28
 RT = Radio del micelio del tratamiento.

 Conteo de esporas
Se obtuvieron las cajas petri con las muestras de hongos de Fusarium spp en los
cuales se le aplicó 10 mL de agua estéril y 20 uL de TWEEN 20 y con una varilla se
raspó el micelio, para luego con una micropipeta de 1000 uL tomar una parte de la
muestra y filtrar mediante una gasa estéril para que se deposite en microtubos
eppendorf. Se agitó por 10 segundos. Seguido de esto se utilizó la cámara Neubauer
y se tomó 20 uL de la muestra ya filtrada para depositarla dentro de la cámara
situándolo en el microscopio Olympus CX21 observando las esporas con el lente 10
contándolas con el contador de esporas; para calcular el porcentaje de inhibición de
las esporas se aplicó la siguiente fórmula:

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 − 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

% 𝑑𝑒 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = ∗ 100
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜

29
 CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

30
4.1. Resultados.

4.1.1. Identificación del hongo aislado en el frijol canario almacenados en

bodegas.
Los hongos patógenos identificados en el frijol canario fueron aislados desde la
semillas verificando en placas petri: PDA con las características morfológicas para
Fusarium spp 1 y Fusarium spp 2

Características macroscópicas para la identificación taxonómica del aislamiento

correspondiente a Fusarium spp 1 y Fusarium spp 2

Fig. 2: Colonia en PDA,

incubada a 27 °C por 7 días.
A Colonia del hongo con
B formación del micelio rojo
algodonoso.

Fig. 1: Colonia de los hongos aislados de

semillas de frijol canario en tubos de
ensayo. A Colonia del hongo con formación
del micelio rojo algodonoso. B Colonia del
hongo con formación del micelio violeta Fig. 3: Colonia en PDA, incubada
algodonoso a 27 °C por 7 días. Colonia del
hongo con formación del micelio
violeta algodonoso. Anverso.

31
 Características microscópicas para la identificación taxonómica del aislamiento
correspondiente a Fusarium spp 1 y Fusarium spp 2

La fiálide es generalmente fina, con forma de botella; simple o ramificada; cortas o

largas; monofialídica (que emergen esporas de un poro de la fiálide) o polifialídica (de
varios poros). Los macroconidios son esporas que presentan forma de medialuna,
hialinos y septados. Para su correcta clasificación es importante el largo, ancho,
curvatura, septos, agrupaciones mucoides (esporodoquios) y detalles de las células de
los extremos (célula apical y pie). Los microconidios, ausentes en algunas especies,
poseen variadas formas (fusiformes, ovales, clavadas, entre otras), agrupaciones
(estructuras mucoides llamadas “falsas cabezas”), en cadenas largas o cortas. Otro tipo
de conidios son los mesoconidios, que son similares pero de menor tamaño que los
macroconidios y nunca forman estructuras mucoides. Las clamidosporas características
con doble pared gruesa, lisa o rugosa; de manera aislada, en pareja o en grupo [43].

Fig. 1: Filiades Laterales. Fusarium spp 1 Fig. 2: Microconidias Unicelulares.

Fig. 3: Fiálides laterales. Fusarium spp 2 Fig. 4: Microconidias Unicelulares.

Fusarium spp 2

32
4.1.2. Actividad Antifúngica del aceite esencial de Citrus sinensis (Hojas, Corteza
y Comercial)
Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 1 durante las 48 horas, 96 horas
y 168 horas de medición

La actividad antifúngica del aceite esencial obtenido de hojas de Citrus sinensis al 1,5%
durante las primeras 48 horas de medición se verifica el 94,44% de inhibición de
crecimiento radial, mientras que en concentraciones de 2,5 % y 3,5 % de aceite esencial
extraído de hojas se logró inhibir en un 100 % el crecimiento radial. En el aceite
esencial extraído de corteza al 1,5 %, se observó una actividad antifúngica de 8,33 %
de inhibición de crecimiento radial, sin embargo al usar concentraciones de 2,5% y
3,5% se obtuvo una actividad antifúngica de 16,05% y 66,11 % de inhibición de
crecimiento radial respectivamente. El aceite esencial comercial obtuvo el porcentaje
más alto de actividad antifúngica con un 100% de inhibición de crecimiento radial.

A las 96 horas la actividad antifúngica del aceite esencial extraído de hojas al 1,5 %
mostro el 92,45 % de inhibición de crecimiento radial, mientras que al utilizar el 2,5 %
de aceite se verifico el 96,78% de inhibición de crecimiento radial y al usar el 3,5 % de
aceite esencial de hojas se obtuvo un 100 % de inhibición. Para el aceite esencial
extraído de corteza los resultados fueron: un 4,48 % de actividad antifúngica frente al
8,33 % y al 51,89 % de inhibición de crecimiento radial que presentaron las muestras
con sus respectivas concentraciones de aceite. El aceite esencial adquirido en el
laboratorio de Isabruk Botanic presento la mayor actividad antifúngica con una
inhibición del 100 %.

Los resultados finales a las 168 horas fueron: con una concentración del 1,5 % de aceite
esencial extraído de hojas se verifico un 92,7% de inhibición, mientras que en
concentraciones del 2,5 %, y 3,5 % su porcentaje de inhibición del crecimiento radial es
del 95,22 % y 95,68 %. Mientras que la actividad antifúngica del aceite esencial de
corteza de naranja presenta un porcentaje de inhibición del crecimiento radial de 0%,
10,48% y 23,21% en concentraciones del 1,5 %, 2,5 %, y 3,5 % respectivamente. Por
último, para el aceite esencial comercial se evidencio una actividad antifúngica del
crecimiento radial del 100% en sus tres concentraciones.

33
Cuadro 4: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de inhibición del
crecimiento radial de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey.

Porcentaje de Inhibición Crecimiento Radial Fusarium spp 1

Desviación Desviación Desviación
Descripción 48 horas 96 horas 168 horas
Estándar Estándar Estándar
AEs Hojas 1,5 % 94,44 E ± 2,4 92,45 E ±0 92,70 E ± 2,3
AEs Hojas 2,5 % 100 E 0 96,78 F ± 1,1 95,22 E ± 2,1
AEs Hojas 3,5 % 100 E 0 100 F ±0 95,68 E ± 2,9
AEs Corteza 1,5 % 8,33 B 0 4,48 B ± 1,0 0B ±0
AEs Corteza 2,5 % 16,05 C ± 6,7 8,33 C ± 2,8 10,48 C ± 1,3
AEs Corteza 3,5 % 66,11 D ± 4,3 51,89 D ± 2,5 23,21 D ± 1,0
AEs Comercial 1,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0
AEs Comercial 2,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0
AEs Comercial 3,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0
Control 0A 0 0A ±0 0A ±0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

Inhibición de germinación de esporas del Fusarium spp 1, posterior a las 168

horas

El aceite esencial de hojas (b0) inhibió significativamente el crecimiento de Esporas,

obteniendo un porcentaje del 100% en sus diferentes concentraciones. Por otro lado el
aceite esencial de corteza (b1) obtuvo porcentajes de inhibición del 93,41% 94,5% y
96,27%. Y por último el aceite esencial comercial (b2) inhibió en su totalidad el
Crecimiento de Esporas. Mientras que el control obtuvo un 0% de inhibición.

34
Cuadro 5: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de
Germinación de Esporas de Fusarium spp 1 mediante prueba de
Tukey.

Porcentaje de Inhibición de Esporas Fusarium spp 1

Descripción 168 horas Desviación Estándar
AEs Hojas 1,5 % 100 D 0

AEs Hojas 2,5 % 100 D 0

AEs Hojas 3,5 % 100 D 0
AEs Corteza 1,5 % 93,41 B ± 0,6
AEs Corteza 2,5 % 94,5 B ± 1,8

AEs Corteza 3,5 % 96,27 C ± 0,2

AEs Comercial 1,5 % 100 D 0

AEs Comercial 2,5 % 100 D 0

AEs Comercial 3,5 % 100 D 0

Control 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 2 durante las 48 horas, 96 horas
y 168 horas de medición

La actividad antifúngica del aceite esencial extraído de hojas de naranja presento un

85,69% de inhibición de crecimiento radial durante las 48 horas de medición. Sin
embargo la actividad antifúngica fue más alta al utilizar el 2,5% de aceite y 3,5 % es
decir; un promedio de 91,54 % y 90,26 % de inhibición radial. El aceite esencial
extraído de corteza obtuvo una inhibición de crecimiento micelial del 53,90 % frente al
69,49 % y 66,87 %, resultados que fueron los más bajos en cuanto a la actividad
antifúngica del aceite esencial. Sin embargo, el aceite esencial comercial inhibió en su
totalidad el crecimiento radial del Fusarium spp 2 durante las primeras 48 horas de
medición. El control obtuvo un 0 % de inhibición.

35
 Durante las 96 horas el porcentaje de inhibición radial fue de 89,26%, un promedio
mayor se obtuvo en 2,5% de aceite esencial extraído de hojas de naranja, es decir, una
inhibición radial del 91,49% frente al 91,11%. Los resultados obtenidos para la
actividad antifúngica del aceite esencial de corteza fueron relativamente bajos en
consideración a los anteriores debido a que solo presentaron una inhibición del
crecimiento radial del 13,49 en 1,5% de aceite, mientras que al 2,5% la inhibición radial
fue de 51,28 frente al 48,10% de inhibición micelial al 3,5% de aceite esencial.

A las 168 horas la actividad antifúngica del aceite esencial de hojas de Citrus sinensis
obteniendo porcentajes de inhibición del 80,61%, 91,30%, y 90,96% con las
concentraciones de aceite esencial respectivamente. El aceite esencial de corteza con
las mismas concentraciones; inhibió el crecimiento radial en 14,11%, 19,49% y 13,11%.
Por otro lado, el aceite esencial comercial, inhibió en su totalidad el Crecimiento Radial
a una concentración de 3,5 mientras que al 2,5% inhibió un 96,49% y un 90,09% al
1,5% de aceite esencial.

Cuadro 6: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de inhibición del

Crecimiento Radial de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey.

Porcentaje de Inhibición Crecimiento Radial Fusarium spp 2

Desviación Desviación Desviación
Descripción 48 horas 96 horas 168 horas
Estándar Estándar Estándar
AEs Hojas 1,5 % 85,69 D ± 2,41 89,26 D ± 1,96 80,61 C ± 0,84
91,54 D
AEs Hojas 2,5 % ± 7,80 91,49 D ± 3,92 91,30 C D ± 1,99
E
AEs Hojas 3,5 % 90,26 D ± 1,93 91,11 D ± 1,33 90,96 C D ± 1,06
AEs Corteza 1,5 % 53,90 B ± 3,84 13,49 ± 10,90 14,11 B ± 9,35
AEs Corteza 2,5 % 69,49 C ± 3,87 51,284 C ± 6,51 19,49 B ± 3,97
AEs Corteza 3,5 % 66,87 C ± 2,06 48,10 C ± 1,85 13,10 B ± 0,09
AEs Comercial 1,5 % 100 E 0 100 D 0 90,09 C D ± 1,97
AEs Comercial 2,5 % 100 E 0 100 D 0 96,49 D ± 6,08
AEs Comercial 3,5 % 100 E 0 100 D 0 100 D 0
Control 0A 0 0A 0 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

36
 Inhibición de germinación de esporas del Fusarium spp 1, posterior a las 168
horas

El crecimeinto de esporas se vio afectado en su totalidad al utilizar las dos

concnetraciones mas altas de aceite esencial de hojas de Citrus sinensi, debido a que se
obtuvo un porcentaje de inhibición del 100% frente al 98,08% del 1,5% de aceite
esencial. El aceite esencial de corteza tuvo una menor actividad antifúngica, siendo el
91,02% su promedio de inhibición más alto, mientras que para las demas
concentraciones la inhibición del cremiento de esporas fue de 79,80% y 79,31%. El
Fusarium spp 2 fue sensible ante el aceite esencial comercial debido a que este inhibió
en su totalidad el crecimiento de esporas. Obteniendo un porcentaje de inhibición del
100%.

Cuadro 7: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de

Germinación de Esporas de Fusarium spp 2 mediante prueba de
Tukey.

Porcentaje de Inhibición de Esporas Fusarium spp 2

Descripción 168 horas Desviación Estándar
AEs Hojas 1,5 % 98,08 D ± 1,88
AEs Hojas 2,5 % 100 D 0
AEs Hojas 3,5 % 100 D 0
AEs Corteza 1,5 % 91,02 B ± 1,30
AEs Corteza 2,5 % 79,80 B ± 4,23

AEs Corteza 3,5 % 79,31 C ± 14,37

AEs Comercial 1,5 % 100 D 0

AEs Comercial 2,5 % 100 D 0

AEs Comercial 3,5 % 100 D 0
Control 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

37
4.1.3. Concentraciones de los aceites esenciales (1,5% 2,5% 3,5%) para la
inhibición de hongos presentes en el frijol canario (Phaseolus vulgaris L.)

Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 1 durante las 48 horas, 96 horas
y 168 horas de medición

Las concentraciones utilizadas para inhibir el crecimiento radial de Fusarium spp 1;

siendo las concentraciones de 2,5% y 3,5% las que presentaron un porcentaje inhibitorio
del 100%; frente al 94,44% de inhibición radial que presento la concentración más baja
que fue al 1,5% de aceite esencial extraido de hojas. Mientras tanto las concentraciones
del aceite esencial de corteza, presentaron porcentajes inhibitorios muy bajos, es decir, a
las 48 horas de medición el porecntaje de inhibición radial fue de 8,33% con el 1,5% de
aceite esencial, 16,05% con el 2,5% de aceite y 66,11% con 3,5% de aceite extraido de
corteza. Sin embargo, utilizando las tres concetraciones del 1,5 2,5% y 3,5% con aceite
esencial comercial se inhibe en su totalidad el crecimiento radial.

A las 96 horas de medicion del crecimiento micelial, el porcentaje de inhibición del

aceite esencial de hojas de naranja al 1,5% 2,5% y 3,5% es de 92,45%, 96,78 y 100% de
inhibición radial. Mientras que el 1,5% de aceite esencial extraído de corteza inhibió un
4,48%, y un 8,33% la concentración del 2,5% frente al 51,89% de inhibición radial que
se presentó al usar el 3,5% de aceite esencial extraído de corteza. El aceite esencial de
corteza se mantuvo al 100% de inhibición radial aun a las 96 horas de medición.

A las 168 horas la concentración del 3,5% de aceite esencial de hojas dio un promedio
de 95,68, el más alto con respecto a las demás concentraciones que obtuvieron
promedios de inhibición del 95,22% y 92,70% con concentraciones del 2,5% y 1,5%
respectivamente. El aceite esencial de corteza aun con la concentración más alta solo
inhibió un 23,21%, mientras que al 2,5% de aceite inhibió un 10,48% y al 1,5% de
aceite esencial extraído de corteza no se dio ningún efecto inhibitorio en el crecimiento
radial. Sin embargo, utilizando las tres concetraciones del 1,5 2,5% y 3,5% con aceite
esencial comercial se inhibe en su totalidad el Crecimiento Radial.

38
Cuadro 8: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición del
Crecimiento Radial de Fusarium spp 1 mediante prueba de Tukey.

Porcentaje de Inhibición Crecimiento Radial Fusarium spp 1

Desviación Desviación Desviación
Descripción 48 horas 96 horas 168 horas
Estándar Estándar Estándar
AEs Hojas 1,5 % 94,44 E ± 2,4 92,45 E ±0 92,70 E ± 2,3
AEs Hojas 2,5 % 100 E 0 96,78 F ± 1,1 95,22 E ± 2,1
AEs Hojas 3,5 % 100 E 0 100 F ±0 95,68 E ± 2,9
AEs Corteza 1,5 % 8,33 B 0 4,48 B ± 1,0 0B ±0
AEs Corteza 2,5 % 16,05 C ± 6,7 8,33 C ± 2,8 10,48 C ± 1,3

AEs Corteza 3,5 % 66,11 D ± 4,3 51,89 D ± 2,5 23,21 D ± 1,0

AEs Comercial 1,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0

AEs Comercial 2,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0

AEs Comercial 3,5 % 100 E 0 100 F ±0 100 F ±0

Control 0A 0 0A ±0 0A ±0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

Inhibición de germinación de esporas del Fusarium spp 1, posterior a las 168

horas

En la inhibición del crecimiento de esporas las concentraciones del 1,5 2,5% y 3,5%
obtienen un porcentaje inhibitorio del 100 % ya sea con aceite esencial extraido de hojas
o con aceite esencial comercial, mientras que la concentración de 3,5% en el aceite
esencial de corteza inhibió en un 96,27% el crecimiento de esporas, un 94,5% se inhibió
con una concentracion del 2,5% y con el 1,5% de aceite esencial de corteza se logro
inhibir un 93,41% la germinación de esporas.

39
Cuadro 9: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de inhibición de
germinación de esporas de Fusarium spp 1 mediante prueba de
Tukey.

Porcentaje de Inhibición de Esporas.

Descripción 168 horas Desviación Estándar
AEs Hojas 1,5 % 100 D 0

AEs Hojas 2,5 % 100 D 0

AEs Hojas 3,5 % 100 D 0
AEs Corteza 1,5 % 93,41 B ± 0,6
AEs Corteza 2,5 % 94,5 B ± 1,8

AEs Corteza 3,5 % 96,27 C ± 0,2

AEs Comercial 1,5 % 100 D 0

AEs Comercial 2,5 % 100 D 0

AEs Comercial 3,5 % 100 D 0

Control 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 2 durante las 48 horas, 96 horas
y 168 horas de medición

A las 48 horas de medición de crecimiento radial, las concentraciones del 1,5% 2,5% y
3,5% de aceite esencial extraído de hojas presentaron porcentajes de inhibición del
85,69% 91,54% y 90,26%. Mientras que para el aceite esencial extraído de corteza el
porcentaje más bajo de inhibición se obtuvo con el 1,5% de aceite al indicar un
porcentaje inhibitorio del 53,90%, resultados similares se obtuvieron al observar los
porcentajes inhibitorios de las concentraciones del 2,5% y 3,5% es decir se inhibió un
69,49% y 66,87% del crecimiento micelial respectivamente. Mientras que el aceite
esencial comercial en sus tres concentraciones inhibió en su totalidad el crecimiento
radial.

40
 A las 96 horas el aceite esencial de hojas al 1,5% inhibió un 89,26% el crecimiento
radial, el 2,5% inhibió un 91,49% y el 3,5% de aceite esencial de hojas inhibió el
crecimiento radial al 91,11%. La concentración del 2,5% de aceite esencial de corteza
dio un promedio de 51,28 % de inhibición, mientras que el 3,5% dio un promedio del
48,10% y un promedio de inhibición más bajo se obtuvo al usar el 1,5% de aceite
esencial, es decir un 13,49% de inhibición radial. El aceite esencial comercial se
mantuvo con el 100% de inhibición en las tres concentraciones.

La concentración que brindo la mayor inhibición en el crecimiento radial del Fusarium

spp 2 a las 168 horas de medición fue del 2,5% frente al 3,5% con porcentajes de
91,30% y 90,96% respectivamente. Estas mismas concentraciones usando aceite
esencial de corteza no tuvieron un poder inhibitorio frente al crecimiento radial del
Fusarium spp 2. Mientras que la concentración de 3,5% del aceite esencial comercial
inhibió en su totalidad el crecimiento radial.

Cuadro 10: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición del

Crecimiento Radial de Fusarium spp 2 mediante prueba de Tukey.

Porcentaje de Inhibición Crecimiento Radial Fusarium spp 2

Desviación Desviación Desviación
Descripción 48 horas 96 horas 168 horas
Estándar Estándar Estándar
AEs Hojas 1,5 % 85,69 D ± 2,41 89,26 D ± 1,96 80,61 C ± 0,84
91,54 D
AEs Hojas 2,5 % ± 7,80 91,49 D ± 3,92 91,30 C D ± 1,99
E
AEs Hojas 3,5 % 90,26 D ± 1,93 91,11 D ± 1,33 90,96 C D ± 1,06
AEs Corteza 1,5 % 53,90 B ± 3,84 13,49 ± 10,90 14,11 B ± 9,35
AEs Corteza 2,5 % 69,49 C ± 3,87 51,284 C ± 6,51 19,49 B ± 3,97
AEs Corteza 3,5 % 66,87 C ± 2,06 48,10 C ± 1,85 13,10 B ± 0,09
AEs Comercial 1,5 % 100 E 0 100 D 0 90,09 C D ± 1,97
AEs Comercial 2,5 % 100 E 0 100 D 0 96,49 D ± 6,08
AEs Comercial 3,5 % 100 E 0 100 D 0 100 D 0
Control 0A 0 0A 0 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

41
 Inhibición de germinación de esporas del Fusarium spp 2, posterior a las 168
horas

Las concentraciones que obtuvieron un porcentaje del 100% en la inhibición del

crecimiento de esporas fue del 2,5% y 3,5% en el aceite esencial de hojas. Mientras que
la concentración del 1,5% tuvo un porcentaje inhibitorio del 91,02% frente al 79,80% de
la concentración del 2,5% del aceite esencial de corteza.
Las concentraciones del 1,5% 2,5% y 3,5% del aceite esencial comercial inhibieron en
su totalidad el crecimiento radial de esporas del Fusarium spp 2.

Cuadro 11: Resultados porcentuales obtenidos de las medias de Inhibición de

Germinación de Esporas de Fusarium spp 2 mediante prueba de
Tukey.

Porcentaje de Inhibición de Esporas Fusarium spp 2

Descripción 168 horas Desviación Estándar
AEs Hojas 1,5 % 98,08 D ± 1,88

AEs Hojas 2,5 % 100 D 0

AEs Hojas 3,5 % 100 D 0
AEs Corteza 1,5 % 91,02 B ± 1,30
AEs Corteza 2,5 % 79,80 B ± 4,23

AEs Corteza 3,5 % 79,31 C ± 14,37

AEs Comercial 1,5 % 100 D 0

AEs Comercial 2,5 % 100 D 0

AEs Comercial 3,5 % 100 D 0
Control 0A 0

Elaborado: Daquilema, J. (2016)

42
4.2. Discusión
4.2.1. Hongos aislados de Phaseolus vulgaris L
En el aislamiento del hongo en frijol canario almacenado en bodega se pudo identificar
dos especies de Fusarium spp, mismos resultados que fueron obtenidos por [31] al
identificar Fusarium chlamydosporum, Fusarium equiseti y Fusarium incarnatum
transmitidos por semillas en el cultivo del frijol.

4.2.2. Actividad Antifúngica de los aceites esenciales

Aceite esencial de Hojas

Con respecto a los resultados obtenidos acerca de la actividad antifúngica del aceite
esencial de hojas en Fusarium spp 1 se obtuvo un porcentaje de inhibición del
crecimiento radial del 92,7% con una concentración del 1,5 %, en concentraciones del
2,5 % y 3,5 % su porcentaje de inhibición es del 95,22 % y 95,68 %. Y un 100% de
inhibición en la germinación de Esporas. La actividad antifúngica del aceite esencial de
hojas de Citrus sinensis mediante la Inhibición del crecimiento radial del Fusarium spp
2 obtuvo porcentajes de inhibición del 80,61%, 91,30%, y 90,96%. El crecimeinto de
esporas se vio afectado en su totalidad con el aceite esencial de hojas de Citrus sinensi,
debido a que se obtuvo un porcentaje de inhibicion del 100%. Resultados similares
fueron obtenidos por [39] en donde el crecimiento radial de Fusarium. oxysporum,
Alternari. sp y Fusarium. sp y la germinación de esporas de todas las poblaciones de
hongos probados fueron significativamente reducidos con aceite esencial de naranja
obtenido de hojas.

Aceite esencial de corteza

Mientras que el aceite esencial obtenido de corteza de naranja no presentó actividad

antifúngica en las diferentes concentraciones probadas; obteniendo porcentajes de
inhibición de crecimiento radial del 0 %, 10,48 % y 23,21 %. Sin embargo el aceite
esencial de corteza sí obtuvo porcentajes de inhibición del 93,41 % 94,5 % y 96,27 %
en el crecimiento de esporas. Y los resultados constatados por [35] en donde el aceite
esencial de corteza de naranja solo mostró actividad antifúngica en Trichoderma
harzianum mientras que para Fusarium oxysporum y Absidia sp no fueron afectados por

43
los componentes de ese aceite esencial en ninguna de las concentraciones evaluadas (de
100 a 12000 ppm).

El aceite esencial de corteza, con las mismas concentraciones; obtuvo un porcentaje

inhibitorio bajo, solo logró inhibir el crecimiento radial del Fusarium spp 2 en 14,11%,
19,49% y 13,11%. Mientras que el aceite esencial de corteza tuvo un porcentaje de
Inhibicion de Esporas del 91,02%. Datos similares presenta [38], donde el aceite
esencial de Citrus sinensis presentó un menor poder inhibitorio del crecimiento micelial
de los hongos Fusarium oxysporum y Alternaria alternata

Aceite esencial comercial

Por último, el mejor efecto antifúngico en Fusarium spp 1 lo obtuvo el aceite esencial
comercial debido a que se evidenció una actividad antifúngica del crecimiento radial y
del crecimiento de esporas del 100% en sus tres concentraciones. Por otro lado, el aceite
esencial comercial, inhibió en su totalidad el crecimiento radial del Fusarium spp 2 a
una concentración de 3,5%. Este hongo fue sensible ante el aceite esencial comercial
debido a que este inhibió en su totalidad la germinacion de Esporas. Obteniendo un
porcentaje de inhibición del 100%. Siendo estos valores superiores a los alcanzados por
[34] debido a que en su estudio; el aceite esencial de Citrus aurantifolia no tuvo una
actividad antifúngica en las diferentes concentraciones probadas.

4.2.3. Concentraciones de AEs

Concentraciones del AEs Hojas

Las concentraciones que presentaron mayor porcentaje inhibitorio en el crecimiento

radial de Fusarium spp 1 fueron de 2,5% y 3,5% debido a que estas concentraciones
lograron inhibir en 95,22% y 95,68% respectivamente. Mientras que las
concentraciones de 1,5 2,5% y 3,5% lograron inhibir en su totalidad la germinación de
esporas. En el Fusarium spp 2, la concentración que brindo la mayor inhibición en el
Crecimiento Radial fue el de 2,5% frente a 3,5% con porcentajes de inhibición del
91,30% y 90,96% respectivamente. Las concentraciones que obtuvieron un porcentaje
del 100% en la ihibicion de Esporas fue del 2,5% y 3,5% en el aceite esencial de hojas.

44
Sin embargo concentraciones del 1%, 2,5% y 5% fueron utilizadas por [33] donde los
resultados mostraron que existe un efecto inhibidor del aceite esencial de naranja (AEN)
en el crecimiento micelial de Fusarium solani, superior al 80% a concentración de AE
de 1%, y 100% de inhibición a concentraciones de 2,5% y 5% de AE

Concentraciones del AEs Corteza.

Mientras que el aceite esencial de corteza, en ninguna de sus tres concentraciones

obtuvo un porcentaje inhibitorio en el crecimiento radial del Fusarium spp 1. Sin
embargo con una concentracion de 3,5% el aceite esencial de corteza inhibió en un
96,27% la germinación de esporas. Concentraciones mucho más bajas fueron evaluadas
por [37] donde también el Fusarium spp se encontró resistente al aceite de naranja con
concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 60 μl de aceite

Utilizando las mismas concentraciones de aceite esencial de corteza frente al

crecimiento radial del Fusarium spp 2. no se obtuvo un poder inhibitorio. Sin embargo
el estudio investigativo realizado por [36], indica que los aceites esenciales de corteza
de cítricos inhibían el crecimiento radial de Fusarium proliferatum a una concentración
de 5% y 6%,

Concentraciones del AEs Comercial.

Utilizando las tres concetraciones del 1,5 2,5% y 3,5% con aceite esencial comercial se
inhibe en un 100% el Crecimiento Radial y la Germinacion de Esporas del Fusarium
spp 1 y para el Fusarium spp 2 la concentración de 3,5% inhibió en su totalidad el
crecimiento radial. Las concentraciones del 1,5% 2,5% y 3,5% de igual manera
inhibieron en su totalidad la germinación de esporas. Estas concentraciones se
encuentran dentro de los valores aceptables según [44] , en su estudio donde demostró
que al utilizar el 1% inhibió un 54% el crecimiento radial de Fusarium oxysporum.

4.2.4. Tratamiento de la hipotesis.

Por lo tanto; se aprueba la hipótesis presentada que dice “Las concentraciones de aceites
esenciales de naranja inhibirán hongos patógenos en frijol canario almacenados” pues
en base a los resultados obtenidos me permito aprobar la misma.

45
 CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

46
5.1. Conclusiones

 Se logra identificar y aislar por caracteres morfológicos dos géneros de hongos.

Que corresponde al orden micológico Hypocreales, logrando definir el generó
Fusarium de semillas de frejol canario.

 Se concluye que el aceite esencial de naranja extraído de hojas tienen mayor

actividad antifúngica, logrando inhibir en su totalidad el crecimiento micelial y
la germinación de esporas; obteniendo los valores que corresponde: 95,7 % de
inhibición de crecimiento micelial y 100 % de inhibición de esporas para
Fusarium sp 1 y un 91,3 % de inhibición de crecimiento radial y un 100 % de
inhibición de esporas para Fusarium sp 2.

 Con una concentración del 3,5 % del aceite esencial extraido de hojas se logró
inhibir el crecimeinto micelial en un 95,7 % y en cualquiera de las tres
concentraciones se observó un 100 % de efectividad en la inhibición de esporas
del Fusarium sp 1. Para el Fusarium sp 2 una concetración del 2,5 % del aceite
esencial de hojas inhibió un 91,3 % de crecimiento micelial y 100 % de inibición
de esporas.

5.2. Recomendaciones

 Para obtener la especie del género Fusarium spp aislados del frijol canario se
recomienda realizar un estudio especializado debido a que existe más de 100
especies y las características morfológicas de este género son bastante complejas
por lo que se dificulta la identificación de la especie del Fusarium spp.

 Entre los aceites esenciales obtenidos de hojas, corteza de naranja y aceite

comercial, se recomienda en cuanto a actividad antifúngica la utilización de
aceite esencial destilado de hojas de naranja. Debido a que este presentó una
mayor actividad antifúngica en la inhibición de crecimiento radial e inhibición
de esporas del Fusarium spp 1 y Fusarium spp 2 aislados de frijol canario
(Phaseolus vulgaris L.) almacenados en bodegas.

47
 Es recomendable utilizar una concentración de aceite esencial obtenido de hojas
al 3,5% para la inhibición de crecimiento radial, mientras que para la inhibición
de germinación de esporas su concentración inhibitoria es del 1,5% para
Fusarium sp 1. Para Fusarium sp 2 es recomendable aplicar una concentración
del 2,5% para inhibición de crecimiento radial e inhibición de germinación de
esporas.

48
 CAPÍTULO VI

BIBLIOGRAFÍA

49
9. BIBLIOGRAFIA:

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Asistida por Radiación de Microondas (MWHD) con Hidrodestilación Convencional (HD) en
la Extracción de Aceite Esencial de Minthostachys mollis,» vol. 26, nº 1, 2015.

[41] G. Castellanos, C. Jara y G. Mosquera, «Guía Practica 4: Fusarium oxysporum. Manejo del
hongo en el Laboratorio,» 2013.

[42] Y. Duarte, O. Pino y B. Martínez, «Efecto de cuatro aceites esenciales sobre hongos
asociados al manchado del arroz,» vol. 29, nº 1, 2014.

[43] J. F. Leslie y B. A. Summerell, The Fusarium Laboratory Manual, Wiley- Blackwell. , 2006.

[44] J. BECERRA, M. BITTNER, V. HERNÁNDEZ, C. BRINTRUP, J. BECERRA y M. SILVA, «Actividad

de aceites esenciales de Canelo, Queule, Bailahuén y Culén frente a hongos
fitopatógenos.,» Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y
Aromáticas, vol. 9, nº 3, pp. 2-5, 2010.

[45] O. Voysest, Variedades de Frijol en América Latina y su origen, Cali: Centro Internacional
de Agricultura Tropical (CIAT), 1983, p. 87.

[46] F. Narváez, «Univerdidad Técnica Estatal de Quevedo,» Producciones UTEQ, 2015. [En
línea]. Available: [Link] [Último acceso: 23
Noviembre 2016].

[47] M. Box, Leguminosas de Grano, Primera ed., Madrid (España): Salvat Editores, 1961, p.
452.

[48] E. Peralta, J. Vásquez, J. Pinzón y R. Lépiz, «INIAP-411 Imbabello: Variedad de Frejol

Arbustivo,» 1991.

[49] O. Pino, Y. Sánchez, M. Rojas, H. Rodríguez, Y. Abreu, Y. Duarte, B. Martínez, B. Peteira, T.

Correa y D. Martínez, «COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD PLAGUICIDA DEL ACEITE
ESENCIAL DE Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake,» vol. 26, nº 3, 2011.

53
[50] D. Daferera, B. Ziogasb y M. Polissiou, «The effectiveness of plant essential oils on the
growth of Botrytis cinerea, Fusarium sp. and Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis,» vol. 22, nº 1, pp. 39-44, 2003.

54
CAPÍTULO VII

ANEXOS

55
ANEXO 1: Crecimiento radial del Fusariumspp 1

Tratamiento Hongo AE Concentracion Repeticion 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h

T1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 0,6 0,8 0,9 1 1,1 1,1 1,1
T1.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0,6 0,7 0,7 1 1 1 1,1
T2 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0,6 0,6 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8
T2.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0,6 0,6 0,7 0,7 0,9 1 1,1
T3 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,8 0,9 1
T3.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7
Testigo (Sin Control) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1,4 2,6 4,4 5,3 5,8 6,2 6,5
Testigo (Sin Control) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1,8 2,5 4,3 4,8 5,3 5,8 6,1
T4 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 0,6 2,8 2,8 5,6 7,5 8,8 9
T4.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 0,6 2,8 2,9 5,7 7,5 9 9
T5 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 0,6 2,5 2,8 5,3 6,8 7,6 8
T5.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 0,9 2,8 2,8 5,6 7 8 8,2
T6 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 0,6 1,5 1,5 3 4 5,5 7
T6.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 0,6 1,3 1,4 3,2 4,3 5,2 7
Testigo (Sin Control) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 0,9 2,4 4,5 5,4 6,3 7,2 7,3
Testigo (Sin Control) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1 3,2 5,2 5,6 6 6,4 6,7
T7 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
T7.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
T8 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
T8.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
T9 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
T9.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Testigo (Sin Control) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) - - 1 1,2 3 3,6 5,9 7,7 9 9

Elaborado: Daquilema, J. (2016).

56
ANEXO 2: Crecimiento Radial del Fusarium spp 2 durante los 7 días de medición.

Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 0,6 1 1,1 1,3 1,4 1,8 2,1
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0,6 0,9 1 1,1 1,2 1,6 2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0,6 0,6 0,7 0,9 1 1,1 1,1
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0,6 1 1,2 1,3 1,4 1,4 1,4
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0,6 0,8 1,1 1 1,2 1,3 1,3
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0,6 0,9 1 1,1 1,2 1,2 1,2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 1 1,5 2,8 3,6 5,2 6 6,9
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1 1,8 2,5 3,8 5,5 6,5 7
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 0,6 1,9 4,9 5,7 6 6,2 6,5
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 0,7 1,7 3,1 4,6 5,9 7 7,9
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 0,6 1,3 2,5 3,6 4,6 5,8 7
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 0,7 1,5 2,2 2,9 4 5,4 6,4
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 0,6 1,4 2,5 3,5 4,8 5,9 7,2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 0,7 1,5 2,5 3,3 4,5 6 7,2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 0,8 1,7 3,6 5,3 5,6 5,8 6
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 0,9 1,8 3,9 4,5 4,7 5,3 8,5
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 1,5
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 1,2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 1,4 1,4
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 1 3,2 4,2 6 6,5 7 8,2
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1 2 3,5 4,1 4,5 4,6 5,1
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

57
 ANEXO 3: Crecimiento radial de esporas del Fusarium spp 1

Esporas de Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.)

Tratamientos Hongo AE Concentracion Repeticion Cont. 1 Cont. 2 Cont. 3 Cont. 4 Cont. 5 Total
T1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 0 0 0 0 0 0
T1.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0 0 0 0 0 0
T2 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0 0 0 0 0 0
T2.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0 0 0 0 0 0
T3 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0 0 0 0 0 0
T3.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0 0 0 0 0 0
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1 2250 2153 1859 1125 2248 9635
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1478 1895 1487 1580 1987 8427
T4 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 155 142 112 177 166 752
T4.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 115 137 108 108 178 646
T5 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 118 142 110 112 170 652
T5.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 72 81 90 60 86 389
T6 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 71 83 95 63 75 387
T6.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 70 86 89 75 82 402
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1748 1879 2187 2128 1890 9832
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 896 1589 1589 2105 1874 8053
T7 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0 0 0 0 0 0
T7.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0 0 0 0 0 0
T8 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0 0 0 0 0 0
T8.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0 0 0 0 0 0
T9 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0 0 0 0 0 0
T9.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0 0 0 0 0 0
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1 2458 1983 2890 2569 1971 11871
Testigo Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 2 2108 2325 2387 2115 2023 10958
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

58
 ANEXO 4: Germinación de esporas del Fusarium spp 2

Tratamientos Hongo AE Concent. Repet. Cont. 1 Cont. 2 Cont. 3 Cont. 4 Cont. 5 Total
T10 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 59 46 73 81 81 340
T10.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0 0 0 0 0 0
T11 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0 0 0 0 0 0
T11.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0 0 0 0 0 0
T12 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0 0 0 0 0 0
T12.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0 0 0 0 0 0
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 1685 1503 1520 1422 1583 7713
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1587 1840 1729 1735 1569 8460
T13 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 155 148 113 120 142 678
T13.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 253 156 142 160 140 851
T14 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 247 306 276 246 336 1411
T14.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 484 342 341 382 343 1892
T15 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 822 546 539 670 572 3149
T15.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 101 68 114 127 146 556
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 1480 1350 1421 1328 1334 6913
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1293 1487 1503 1572 1561 7416
T16 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0 0 0 0 0 0
T16.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0 0 0 0 0 0
T17 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0 0 0 0 0 0
T17.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0 0 0 0 0 0
T18 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0 0 0 0 0 0
T18.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0 0 0 0 0 0
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 1752 1638 1735 1958 1942 9025
Testigo Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 2 1621 1825 1839 1720 1836 8841
Elaborado: Daquilema, J. (2016).
59
ANEXO 5: Inhibición del crecimiento radial de Fusarium spp 1

% de Inhibición Crecimiento Radial para Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.)

Tratamientos Hongo AE Concentración Repet. 48 h PROM % 96 h PROM. % 168 h PROM. %
T1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 91,67 92,45 94,05
T1.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 95,83 92,45 94,05
T2 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 100 96,23 97,62
T2.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 100 98,11 94,05
T3 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 100 100 95,24
T3.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 100 100 98,81
T4 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 8,33 5,66 0
T4.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 8,33 3,77 0
T5 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 20,83 11,32 11,90
T5.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 8,33 5,66 9,52
T6 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 62,50 54,72 23,81
T6.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 70,83 50,94 23,81
T7 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 100 100 100
T7.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 100 100 100
T8 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 100 100 100
T8.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 100 100 100
T9 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 100 100 100
T9.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 100 100 100
Testigo (SC) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) 1 0 0 0
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

60
ANEXO 6: Inhibición del crecimiento radial de fusarium spp 2

% de Inhibicion Crecimiento Radial para FUSARIUM spp 2 (Phaseolus vulgaris L.)

Tratamientos Hongo AE Concent. Repet. 48 h PROM % 96 h PROM. % 168 h PROM. %
T1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 84,62 87,04 80,26
T1.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 88,46 90,74 81,58
T2 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 100 94,44 93,42
T2.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 84,62 87,04 89,47
T3 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 92,31 92,59 90,79
T3.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 88,46 90,74 92,11
T4 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 50 5,56 22,37
T4.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 57,69 25,93 3,95
T5 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 73,08 44,44 15,79
T5.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 65,38 57,41 23,68
T6 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 69,23 46,30 13,16
T6.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 65,38 50 13,16
T7 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 100 100 88,16
T7.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 100 100 92,11
T8 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 100 100 89,47
T8.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 100 100 100
T9 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 100 100 100
T9.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 100 100 100
Testigo (SC) Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 0 0 0
Autora: Daquilema, J. (2016).

61
 ANEXO 7: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 1

CONCENTRACIÒN DEL INOCULO PARA Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.)

Tratamientos Hongo AE Concentracion Repeticion Conidias Total % de Inhibiciòn de esporas
T1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 0 100
T1.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0 100
T2 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0 100
T2.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0 100
T3 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0 100
T3.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0 100
T4 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 376000 93,14
T4.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 323000 94,10
T5 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 326000 94,05
T5.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 194500 96,45
T6 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 193500 96,47
T6.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 201000 96,33
T7 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0 100
T7.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0 100
T8 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0 100
T8.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0 100
T9 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0 100
T9.1 Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0 100
Testigo (SC) Fusarium spp 1 (Phaseolus vulgaris L.) - - 1 5479000 0
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

62
ANEXO 8: Inhibicion de germinación de esporas de Fusarium spp 2

CONCENTRACIÒN DEL INOCULO PARA Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.)

Tratamientos Hongo AE Concentracion Repeticion Conidias Total % de Inhibiciòn de esporas
T1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 1 170000 96,23
T1.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 150 ul 2 0 100
T2 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 1 0 100
T2.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 250 ul 2 0 100
T3 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 1 0 100
T3.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Hojas 350 ul 2 0 100
T4 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 1 339000 92,49
T4.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 150 ul 2 425500 90,57
T5 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 1 705500 84,37
T5.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 250 ul 2 946000 79,04
T6 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 1 1574500 65,11
T6.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Corteza 350 ul 2 278000 93,84
T7 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 1 0 100
T7.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 150 ul 2 0 100
T8 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 1 0 100
T8.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 250 ul 2 0 100
T9 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 1 0 100
T9.1 Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) Comercial 350 ul 2 0 100
Testigo (SC) Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) 1 4512500 0
Elaborado: Daquilema, J. (2016).

63
 ANEXO 9: Fotos de la fase experimental.

Extracción del aceite esencial de Citrus sinensis. (Hojas y Corteza)

Preparación de TWEEN 20

Tween 80 Dilución

Desinfección del frijol Canario (Phaseolus vulgaris)

Granos de frijol Canario sumergidos en solución de hipoclorito de sodio y agua destilada

64
 Muestras de frijol canario sembradas en cajas petri con PDA

Muestras de cajas madre del hongo Fusarium spp 1 y Fusarium spp 2

Aislamiento del Hongo

65
 Repique de hongos

Dilucion del aceite esencial de naranja en PDA

Hongos sembrados en cajas Petri diluidos con aceite esencial

66
 Muestras de Fusarium spp1 a los 7 días de medición.

Aceite esencial de naranja comercial en sus tres concentraciones.

Muestras de Fusarium spp1 a los 7 días de medición.

Control Fusarium spp1

T1 1,5% de AEs Hojas F. spp1 T2 2,5% de AEs Hojas F. spp1

T1.1 1,5% de AEs Hojas F. spp1 T2.1 2,5% de AEs Hojas F. spp1

67
 Muestras de Fusarium spp1 a los 7 días de medición.

T3 3,5% de AEs Hojas F. spp1 T3.1 3,5% de AEs Hojas F. spp1

Muestras de Fusarium spp2 a los 7 días de medición.

Control Fusarium spp2

T1 y T1.1 1,5% de AEs Hojas F. spp2

T2.1 21,5% de AEs Hojas F. spp2 T3 y T3.1 3,5% de AEs Hojas F. spp2

68
 Muestras de Fusarium spp1 a los 7 días de medición

T1.1 1,5% de AEs Corteza

F. spp 1
Tratamientos de AEs Corteza F. spp 1

T2.1 2,5% de AEs T3 3,5% de AEs Control Fusarium. spp 2

Corteza F. spp 1 Corteza F. spp 1

T1.1 1 1,5% de AEs Corteza F. spp 2 T2.1 2,5% de AEs Corteza F. spp 2

69
 Visualización de esporas posterior a los 7 días de medición.

T. 2 2,5% AEs Hojas F. sp2 T. 3 3,5% AEs Comercial F. sp2

T. 1.1 1,5% AEs Corteza F. sp2

70
ANEXO 10: Diagrama de bloques para la determinación de la concentración óptima de
aceite esencial de Citrus sinensis. (Naranja) en la inhibición de fusarium spp presente en
Phaseolus vulgaris l. (frijol canario).

39 g PDA Preparación de la solución

1 l Agua de Agar
destilada

Esterilización del PDA

Lavado y desinfectado del

NaClO al frijol canario
0.1%
Por 2
minutos
Esterilización de la cámara
de flujo laminar

Dispensación PDA en cajas

Petri

Ubicación de semillas de
frijol canario en PDA

Incubación y desarrollo de
los hongos

(7días) a 27°C

Identificación y repique de
los hongos en tubos de
ensayo

1
71
 1

Aislamiento de los hongos

(7días)

Dispensación de la
concentración de A.E con
PDA

Incubación y
almacenamiento 27°C

Evaluación del
crecimiento radial
7 días

72
ANEXO 11: TÉCNICA DE LABORATORIO PARA CRECIMIENTO RADIAL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

TECNICA PARA EL CRECIMIENTO RADIAL

 OBJETIVO

- Determinar el crecimiento radial de los hongos durante siete días

 INSTRUMENTAL

- Contador de colonia
- Marcador indeleble
- Incubadora

Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar;
además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un
laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas
(BPM).

 PROCEDIMIENTO

- Paso 1: Desinfectar las manos y el área de trabajo.

- Paso 2: Colocar el contador de colonia en un lugar amplio y estéril.
- Paso 3: Colocar las cajas en el contador de colonia y verificar su crecimiento
señalando con un marcador.
- Paso 4: Se aplica la fórmula correspondiente para verificar el porcentaje de
inhibición.
T - Tr / T * 100

Dónde:
T = Testigo
Tr = Tratamiento

73
ANEXO 12: TÉCNICA DE LABORATORIO PARA CRECIMIENTO DE ESPORAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

TECNICA PARA CONTAR ESPORAS

 OBJETIVO

- Determinar el número de esporas en los hongos después de los siete días.

 INSTRUMENTAL

- Contador de Neubauer
- Microscopio
- Micropipetas
- Puntas estériles
- Pipetas pasteur
- Vaso de precipitación
- Tween 80
- Gasa estéril
- Microtubos eppendorf
- Agitador Vórtex
- Varilla de agitación
- Mechero

Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar;
además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un
laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM).

 PROCEDIMIENTO
- Paso 1: Dependiendo del tipo de muestra medir, se ha de habrá de preparar una
muestra con una concentración apta para su recuento.
- Paso 2: Retirar con cuidado la tapa de la caja petri en donde se encuentran los
hongos.
- Paso 3: En una probeta de 10 ml colocar agua estéril, para adicionar sobre el
hongo.
- Paso 4: Con la varilla esparcir el micelio del hongo.

74
- Paso 5: Con la micropipeta absorber el líquido de la caja petri para colocar en el
microtubo eppendorf previamente colocado una gasa estéril para evitar filtrar
micelio.
- Paso 6: Sellar y colocar el microtubo eppendorf en el agitador Vórtex para tener
una solución homogénea.
- Paso 7: Finalmente la muestra se coloca en el contador de Neubauer para
observar en el microscopio la cantidad de esporas obtenidas del hongo.
- Paso 8: Para tener el porcentaje de esporas si se realizó el conteo en cuadros
grandes se multiplica por 2000 y en cuadros pequeños se multiplica por 50000,
aplicando la fórmula del crecimiento radial.

T - Tr / T * 100

Dónde:

T = Testigo

Tr = Tratamiento

75
ANEXO 13: Certificado de Laboratorio

76
 ANEXO 14: Resultados obtenidos a partir de los datos del porcentaje de inhibicion de
crecimiento radial y germinacion de esporas de Fusarium spp 1 y
Fusarium spp 2 (Phaseolus vulgaris L.) durante las primeras 48, 96 y 168
horas de incubación.

Summary Statistics for fusa1 48 horas

Desviación Coeficiente Stnd.
Tratam Count Promedio Mínimo Máximo Rango
Estandar de Variación skewness
1 3 94,4444 2,40563 2,55% 91,6667 95,8333 4,16667 -1,22474
2 3 100 0 0,00% 100 100 0
3 3 100 0 0,00% 100 100 0
4 3 8,33 0 0,00% 8,33 8,33 0
5 3 16,0556 6,75017 42,04% 8,33333 20,8333 12,5 -1,12389
6 3 66,1111 4,27633 6,47% 62,5 70,8333 8,33333 0,770952
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0

Summary Statistics for Fusarium 1 96 horas

Standard Coeff. of Stnd.

Tratam. Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 92,4528 0 0,00% 92,4528 92,4528 0
2 3 96,7799 1,16024 1,20% 96 98,1132 2,11321 1,17248
3 3 100 0 0,00% 100 100 0
4 3 4,47799 1,03022 23,01% 3,77358 5,66038 1,88679 1,15853
5 3 8,32704 2,84433 34,16% 5,66038 11,3208 5,66038 0,361031
6 3 51,8868 2,49599 4,81% 50 54,717 4,71698 1,03086
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0

77
 Summary Statistics for fusa1 168 horas

Standard Coeff. of Minimu Maximu Stnd.

Trata Count Average Range
deviation variation m m skewness
1 3 92,6984 2,33689 2,52% 90 94,0476 4,04762 -1,22474
2 3 95,2222 2,07585 2,18% 94 97,619 3,61905 1,22402
3 3 95,6825 2,93015 3,06% 93 98,8095 5,80952 0,471538
4 3 0 0 % 0 0 0
5 3 10,4762 1,25988 12,03% 9,52381 11,9048 2,38095 1,03086
6 3 23,2063 1,04473 4,50% 22 23,8095 1,80952 -1,22474
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0
Total 30 61,7286 44,7679 72,52% 0 100 100 -1,06808

Summary Statistics for fusaiu1 conte de espora

Standard Coeff. of Stnd.

Trata Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 100 0 0,00% 100 100 0
2 3 100 0 0,00% 100 100 0
3 3 100 0 0,00% 100 100 0
4 3 93,4141 0,602096 0,64% 93 94,1048 1,10476 1,15335
5 3 94,5 1,76852 1,87% 93 96,4501 3,45008 0,757266
6 3 96,2666 0,240808 0,25% 96 96,4683 0,468334 -0,794804
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0
Total 30 88,4181 30,0835 34,02% 0 100 100 -6,19944

Summary Statistics for Fusa2 48 horas

Standard Coeff. of Stnd.
Trata Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 85,6923 2,41788 2,82% 84 88,4615 4,46154 1,1361
2 3 91,5385 7,80684 8,53% 84,6154 100 15,3846 0,602708
3 3 90,2564 1,93585 2,14% 88,4615 92,3077 3,84615 0,41407
4 3 53,8974 3,84718 7,14% 50 57,6923 7,69231 -0,0847699
5 3 69,4872 3,87171 5,57% 65,3846 73,0769 7,69231 -0,41407
6 3 66,8718 2,06597 3,09% 65,3846 69,2308 3,84615 1,10363
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0

78
 Summary Statistics for Fusa2 96 horas

Standard Coeff. of Stnd.

trata Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 89,2593 1,95982 2,20% 87,037 90,7407 3,7037 -1,03086
2 3 91,4938 3,92668 4,29% 87,037 94,4444 7,40741 -1,04095
3 3 91,1111 1,33539 1,47% 90 92,5926 2,59259 0,814636
4 3 13,4938 10,9034 80,80% 5,55556 25,9259 20,3704 1,08868
5 3 51,284 6,51108 12,70% 44,4444 57,4074 12,963 -0,345703
6 3 48,0988 1,85383 3,85% 46,2963 50 3,7037 0,169044
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0
Total 30 68,4741 36,6748 53,56% 0 100 100 -1,94608

Summary Statistics for fusa2 168 horas

Standard Coeff. of Stnd.

trata Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 80,614 0,845934 1,05% 80 81,5789 1,57895 1,09276
2 3 91,2982 1,99051 2,18% 89,4737 93,4211 3,94737 0,466064
3 3 90,9649 1,06354 1,17% 90 92,1053 2,10526 0,510608
4 3 14,1053 9,35555 66,33% 3,94737 22,3684 18,4211 -0,618
5 3 19,4912 3,97023 20,37% 15,7895 23,6842 7,89474 0,387673
6 3 13,1053 0,0911606 0,70% 13 13,1579 0,157895 -1,22474
7 3 90,0877 1,97515 2,19% 88,1579 92,1053 3,94737 0,141038
8 3 96,4912 6,07737 6,30% 89,4737 100 10,5263 -1,22474
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0
Total 30 59,6158 40,4864 67,91% 0 100 100 -0,975988

79
 Summary Statistics for fusaiu2 conte de espora

Standard Coeff. of Stnd.

trata Count Average deviation variation Minimum Maximum Range skewness
1 3 98,0776 1,88485 1,92% 96,2327 100 3,76731 0,130718
2 3 100 0 0,00% 100 100 0
3 3 100 0 0,00% 100 100 0
4 3 91,0194 1,30307 1,43% 90 92,4875 2,48753 0,965853
5 3 79,8006 4,23491 5,31% 76 84,3657 8,36565 0,555732
6 3 79,3158 14,3683 18,12% 65,108 93,8393 28,7313 0,0699007
7 3 100 0 0,00% 100 100 0
8 3 100 0 0,00% 100 100 0
9 3 100 0 0,00% 100 100 0
10 3 0 0 % 0 0 0
Total 30 84,8213 30,1194 35,51% 0 100 100 -5,37666

ANEXO 15: Tablas de rangos múltiples para fusarium spp 1 durante las primeras
48, 96 y 168 horas.

Multiple Range Tests for fusa1 48 by trata Multiple Range Tests for Fu1 96 h by trata

Method: 95,0 percent Tukey HSD Method: 95,0 percent Tukey HSD
Homogeneous
Homogeneous trata Count Mean Groups
Tratam. Count Mean Groups 10 3 0 X
10 3 0 X
4 3 4,47799 X
4 3 8,33 X
5 3 8,32704 X
5 3 16,0556 X
6 3 51,8868 X
6 3 66,1111 X
1 3 94,4444 X 1 3 92,4528 X
7 3 100 X 2 3 96,7799 X
3 3 100 X 7 3 100 X
9 3 100 X 3 3 100 X
8 3 100 X 9 3 100 X
2 3 100 X 8 3 100 X

80
 Multiple Range Tests for fusa1 168 ho by trata Multiple Range Tests for fusa1 conteo de espo by trata

Method: 95,0 percent Tukey HSD Method: 95,0 percent Tukey HSD

Homogeneous
trata Count Mean Groups trata Count Mean Homogeneous Groups
10 3 0 X 10 3 0 X
4 3 0 X 4 3 93,4141 X
5 3 10,4762 X 5 3 94,5 X
6 3 23,2063 X 6 3 96,2666 X
1 3 92,6984 X 3 3 100 X
2 3 95,2222 X 7 3 100 X
3 3 95,6825 X 9 3 100 X
7 3 100 X 8 3 100 X
9 3 100 X 2 3 100 X
8 3 100 X 1 3 100 X

Multiple Range Tests for Fusa2 48 hor by trata Multiple Range Tests for Fusa2 96 horas by trata

Method: 95,0 percent Tukey HSD Method: 95,0 percent Tukey HSD

trata Count Mean Homogeneous Groups trata Count Mean Homogeneous Groups
10 3 0 X 10 3 0 X
4 3 53,8974 X 4 3 13,4938 X
6 3 66,8718 X 6 3 48,0988 X
5 3 69,4872 X 5 3 51,284 X
1 3 85,6923 X 1 3 89,2593 X
3 3 90,2564 X 3 3 91,1111 X
2 3 91,5385 XX 2 3 91,4938 X
7 3 100 X 7 3 100 X
9 3 100 X 9 3 100 X
8 3 100 X 8 3 100 X

81
 Multiple Range Tests for fusa2 168 hora by trata Multiple Range Tests for fusa1 conteo de espo by trata

Method: 95,0 percent Tukey HSD Method: 95,0 percent Tukey HSD

Homogeneous Homogeneous
trata Count Mean Groups trata Count Mean Groups
10 3 0 X 10 3 0 X
6 3 13,1053 X 4 3 93,4141 X
4 3 14,1053 X 5 3 94,5 X
5 3 19,4912 X 6 3 96,2666 X
1 3 80,614 X 3 3 100 X
7 3 90,0877 XX 7 3 100 X
3 3 90,9649 XX 9 3 100 X
2 3 91,2982 XX 8 3 100 X
8 3 96,4912 X 2 3 100 X
9 3 100 X 1 3 100 X

82