PRACTICA N°2

OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS: COLORACIÓN SIMPLE Y

COLORACIÓN COMPUESTA

I.- OBJETIVOS:

Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos

aplicando azul de metileno.

Observar el distinto comportamiento químico de la célula bacteriana frente a los colorantes

cristal violeta y safranina; que las clasifica en Gram (+) y Gram (-).

II.-REVISION BIBLIOGRAFICA

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al

microscopio de capo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno,

estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la

observación de la movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, inferencia

diferencial (DIC o la microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste,

empleándose para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras bacterianas.

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y

por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos

colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste.

En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos

extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite

preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por

calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de
bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana

extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la

morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química

con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para

preservar las estructuras celulares.

Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella

un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en

microbiología tienen en común la presencia de grupos cromófobos, grupos con dobles enlaces

conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por

enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más

frecuentes.

Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no penetran en las células

sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un

fondo negro.

Tinción negativa

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromófobos,

ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el

frotis se hace con una gota de solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos

particulados, insolubles, que formaran una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se

prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos

brillantes sobre un fondo oscuro.

Tinción simple

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de

las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.

Se denominan colorantes básicos si el cromófobo (porción coloreada) de la molécula está

cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos.

Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina,

fuchina básica y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de

los procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular

cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos rojo

Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromófobo cargado negativamente y son

utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.

Estructura química del azul de metileno

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y

tipo de agrupación de los microorganismos. Tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y

rápido.
 Tinción simple con safranina de Micrococcus luteus.
Tinción diferencial

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la

aplicación de dos colorantes que contrastan en intensidad o color y un paso intermedio que

provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células

dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico,

permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las

dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de Gram y la tinción de

ácido-alcohol resistencia.

Tinción de Gram

Esta tinción diferencial fue propuesta por el medica danés Christian Gram (1884) que ha

examinado tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria

Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como

marrón Bismarck, mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.

La tinción diferencial es prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de

cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, además de sobre la

forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las

bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared de Dominio Bacteria en dos

grandes grupos: bacterias de tipo Gram positiva y bacterias con pared de tipo Gram negativa.
 La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos

hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias Gram positivas

mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram negativas se

decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que

proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.

Se han puesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos a

esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física como a la composición

de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de peptidoglucano con abundantes

entrecruzamientos parece contribuir a la retención del colorante fundamental, cristal violeta,

mientras que en bacterias Gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la

abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por

ello, contribuyen a la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.

Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos Gram negativos)

Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos Gram positivos)

Láminas fijadas de microorganismos

Aceite de inmersión

Azul de metileno

Cristal violeta

Lugol.

Zafranina.

Alcohol cetona.

Mechero Bunsen

Pizeta de agua

Asa de Kholle.

Microscopio

IV.- METODOLOGÍA.

a) Coloración Simple.

Realizar un frotis delgado en las láminas porta objetos.

Fijar la muestra a la llama del mechero suavemente y colocar sobre el soporte para tinción.

Agregar 5 o 6 gotas de azul de metileno (1%) o carbolfucsina. con la finalidad de cubrir la

muestra fijada, dejar que actúe por 3-5 minutos

Lavar cada lámina con agua (chorro suave).

Dejar secar las láminas al aire.

Examine las preparaciones teñidas, con el objetivo de inmersión (100-150x) de un

microscopio compuesto.
b) Coloración Diferencial.

Realizar un frotis delgado en las láminas porta objetos.

Fijar la muestra a la llama del mechero suavemente y colocar sobre el soporte para tinción.

Cubrir el frotis con cristal violeta, dejar actuar 3-5 min. Luego lavar con un chorro suave de

agua.

Cubrir con gotas de lugol, dejar actuar durante 3-5 min., lavar con un chorro suave de agua.

Decolorar con alcohol cetona 1-5 segundos, lavar con un chorro suave de agua.

Aplicar Zafranina como colorante dejar actuar 3-5 min., lavar y secar al aire.

Colocar una gota de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión

(100X).

V.- RESULTADOS

Dibujar y rotular los microorganismos observados con la coloración de azul de metileno y la

coloración de Gram
 VI.- CONCLUCIONES

En esta experiencia pudimos observar que con la tinción de Gram (tinción diferencial) facilita

la diferencia de una bacteria Gram positiva y Gram negativa realizando cada uno de los pasos

fundamentales que nos facilitan tener un buen resultado teniendo en cuenta que para que se de

este tipo de tinción bacteriana, el peptidoglicano de las bacterias juega un papel importante ya

que esta nos permite diferencias el tipo de bacteria al momento de teñir la célula.

VII.-APORTES

Microscopia de Fluorescencia

Una alternativa para la observación bacteriana es la microscopia de fluorescencia. El

microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico capaz de iluminar la muestra con una luz

cuya longitud de onda puede variar debido a su paso por un filtro de excitación. Este filtro

transmite exclusivamente la luz de excitación de la muestra que presenta la longitud de onda

seleccionada. El microscopio de fluorescencia más utilizado es epifluorescencia, también

denominado de luz incidente. Este tipo de microscopia se puede utilizar para visualizar células

que posean moléculas capaces de excitarse y emitir fluorescencia cuando son iluminadas con una

luz de determinada longitud de onda. Entre moléculas que confieren autofluorescencia a las

células procariotas, cabe destacar la bacterioclorofila presente en bacterias fotosintéticas

anoxigenicas, la clorofila a y las ficobiliproteinas en las cianobacterias fotosintéticas oxigenicas.

Sin embargo, la mayoría de las aplicaciones de la microscopia de fluorescencia para el estudio

de bacterias se basan en teñir las muestras con determinados compuestos químicos, que reciben

el nombre de fluoroforos o fluorocromos. Estos son capaces de emitir fluorescencia cuando son

excitados con luz a una longitud de onda adecuada. Cada una de estas moléculas fluorescentes se
caracteriza por dos parámetros específicos: la longitud de onda optima de excitación o absorción

y la longitud de onda a la cual la emisión de su fluorescencia es máxima.

Los distintos fluoroforos presentan una serie de características que son importantes desde el

punto de vista de su aplicación:

Permeabilidad, una de las propiedades más relevantes de estas moléculas, algunas de ellas no

pueden atravesar la membrana citoplasmática de las células viables, mientras que otros

confunden fácilmente hacia el citoplasma celular, donde son detectados, incluso a

concentraciones muy bajas.

Interacciones específicas, otra característica propia de algunos fluoroforos es su interacción

especifica con alguna macromolécula celular. Así, por ejemplo, el naranja de acridina o el DAPI

(4,6-diamidino-2-fenilindol) interaccionan con los ácidos nucleicos.

Capacidad de retención de la célula, para elegir el fluoroforo más adecuado a nuestras

necesidades, es relevante atender a su mayor o menor capacidad para quedar retenido en el

citoplasma celular.

Fluorescencia en función del pH, para algunos fluoroforos la emisión de fluorescencia es

dependiente pH, por lo tanto es otra característica que se debe de considerar.

CUESTIONARIO:
 BIBLIOGRAFIA

(16 de Octubre, 2009) Hongos y Levaduras.

Covadonga Vásquez, Ana Martin; Mg. De Silóniz Isabel (2010). Técnicas básicas de

Microbiología. Observación de bacterias. Universidad Complutense, Madrid.

Autores varios. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Ciudad de

México.