UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS
E.A.P BIOLOGIA - MICROBIOLOGIA
INFORME DE LABORATORIO DE FISIOLOGIA BACTERIANA
“PRACTICA N. º 08”
DETERMINACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE LA ENVOLTURA CELULAR
BACTERIANA
DOCENTE: MSC. ROSA MARÍA LIÑÁN ABANTO
CURSO: FISIOLOGIA MICROBIANA
ALUMNOS:
CESAR RODRIGO LOPE FLORES 2018-118011
TACNA- 2021
DETERMINACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE LA ENVOLTURA CELULAR
BACTERIANA
I. INTRODUCION
Las bacterias presentan una alta capacidad adaptativa al medio donde se desarrollan, lo
que les permite ajustarse a condiciones adversas y garantizar así su sobrevivencia. Entre
estos fenómenos adaptativos se destaca la resistencia a los antimicrobianos y a otras
sustancias tóxicas como desinfectantes (Erickson et al., 2015).
La envoltura celular bacteriana comprende la membrana citoplasmática y la pared
celular más una membrana externa, en el caso que esta exista. La mayoría de las
envolturas celulares bacterianas caen en dos categorías importantes: Gram-positiva y
Gram-negativa. Estas se distinguen por su reacción a la tinción de Gram.
Como en otros organismos, la pared celular bacteriana proporciona integridad
estructural a la célula. En los procariontes, la función primaria de la pared celular es
proteger la célula contra la presión interna causada por las concentraciones mucho más
altas de proteínas y de otras moléculas dentro de la célula que en el medio exterior. La
pared celular bacteriana se diferencia de la del resto de los organismos por la presencia
de peptidoglicano (heteropolímero alternante de poli-N-acetilglucosamina y ácido N-
acetilmurámico) y está situada inmediatamente a continuación de la membrana
citoplásmica.
El peptidoglicano es responsable de la rigidez de la pared celular bacteriana y determina
la forma de la célula. La pared es relativamente porosa y no constituye una barrera para
los substratos pequeños. Aunque todas las membranas celulares bacterianas contienen
peptidoglicano (siendo excepciones algunos parásitos intracelulares, por ejemplo,
Mycoplasma), no todas las membranas celulares tienen la misma estructura. Esto se
refleja notablemente en la clasificación Gram-positiva y Gram-negativa de las bacterias.
Las micobacterias tienen una envoltura celular que no es típicamente Gram-positiva ni
Gram-negativa.
Además del peptidoglicano, algunas bacterias presentan en la parte más externa de su
envoltura celular una capa superficial paracristalina de proteína o glicoproteína,
denominada capa S, generalmente de simetría hexagonal. Adicionalmente, en el exterior
de la bacteria puede también formarse un glicocálix o cápsula con material secretado
por la bacteria, pero en este caso se considera que es una acumulación de material y no
parte de la célula.
II. OBJETIVO
Analizar el efecto de agentes químicos sobre la integridad de la envoltura celular.
Elaborar un protocolo para demostrar la acción de agentes químicos sobre la pared.
celular.
III. MATERIALES
Cultivo puro de Escherichia coli.
Ampicilina
Escala de McFarland
Buffer de lisis
Nevera a 4°C
Estufa a 37°C
Baño de incubación a 37°C
Portaobjetos y Cubreobjetos de cristal (18x18 mm9)
Micropipetas
Microscopio de fluorescencia (recomendable objetivo de inmersión)
Naranja de acridina
IV. PROCEDIMIENTO
A. Alteración de la pared celular: Las bacterias serán sometidas a cantidades crecientes
de agentes que actúan a nivel de la pared celular.
Procedimiento:
Se preparan seis tubos de ensayo con medio líquido Mueller-Hinton y se rotulan
con las concentraciones de 0, 2, 8, 16, 32 y 160 µg/mL del antimicrobiano
(Ampicilina).
Inoculan los tubos con 0.1 mL de una suspensión de E. coli e incuban a 37°C
por 60 minutos.
B. Alteración de la membrana citoplasmática: se utilizará un buffer de lisis que tiene
como función mantener el pH y lisar a la célula bacteriana.
Procedimiento:
Agregar el buffer de lisis a cada uno de los tubos y dejar actuar por 5 min.
Realizar la lectura de DO cada uno de los tubos a 600nm de longitud de onda.
C. Detección del nucleoide bacteriano: se inmoviliza las muestras resultantes de los
cultivos anteriores y se realiza la lectura en el microscopio de fluorescencia.
Preparar una suspensión de cada uno de los cultivos en agarosa al 1% (70 µL de
agarosa + 30 µL de muestra).
Colocar portaobjetos recubiertos con una película de agarosa sobre una
superficie fría (8°C).
Con una micropipeta agregar una gota de la suspensión bacteriana en los
portaobjetos preparados y colocar un cubreobjetos sobre la muestra.
Colocar los portaobjetos en la nevera (4°C), durante un periodo de tiempo
comprendido entre 2 y 30 minutos hasta que se produzca una gelificación
adecuada de la agarosa.
Dentro de la misma nevera retirar los cubreobjetos y evitando que se dañe el
microgel.
D. Para la visualización de los fragmentos de ADN por microscopía, es conveniente
estabilizar y adherir firmemente los fragmentos de ADN al portaobjetos ya que
pueden desprenderse.
Los portaobjetos secos se incuban en un horno microondas a una potencia
de 500 W, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 10 minutos.
Colorear con naranja de acridina.
Protocolo para demostrar la acción de agentes químicos sobre la pared celular.
Materiales y métodos:
Se utilizaron 6 placas de petri con medio de cultivo agar MullerHinton
Los microorganismos estudiados Esterichia coli, Pseudomona auruginosa y
Enterobacter.
Se emplearon discogramas Britania para bacterias Gram negativas.
Se procedió a su siembra con hisopo.
Luego se colocaron los discogramas o multidiscos en cada una de las cápsulas
sembradas por medio de una pinza esterilizada, ejerciendo una ligera presión sobre los
mismos y se incubaron, en forma invertida a 37 ° durante 12 a 18 horas.
V. RESULTADO
La Pseudomona aeruginosa es muy sensible a la ciprofloxacina,
La Esterichia coli es de sensibilidad intermedia a la cefalotina y amikacina
Las enterobacterias son muy sensibles a la ciprofloxacina.
VI. CONCLUSION
Con el empleo de los multidiscos, podemos determinar la resistencia, la sensibilidad
de diferentes antimicrobianos como elección para una terapéutica adecuada.
VII. BIBLIOGRAFIA
Da Silva, G. J. & Domingues, S. Insights on the horizontal gene transfer of
carbapenemase determinants in the opportunistic pathogen Acinetobacter
baumannii. Microorganisms, 4(3):E29, 2016.
Darmon, E. & Leach, D. R. Bacterial genome instability. Microbiol. Mol. Biol.
Rev., 78(1):1-39, 2014. Delcour, A. H. Outer membrane permeability and antibiotic
resistance. Biochim. Biophys. Acta, 1794(5):808-16, 2009.
Dönhöfer, A.; Franckenberg, S.; Wickles, S.; Berninghausen, O.; Beckmann, R. &
Wilson, D. N. Structural basis for TetM-mediated tetracycline resistance. Proc.
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Donné, J. & Dewilde, S. The challenging world of biofilm physiology. Adv.
Microb. Physiol., 67:235-92, 2015. Dzdic, S.; Suskcovic, J. & Kos, B. Antibiotic
resistance in bacteria.
