SESIONES PRÁCTICAS II UNIDAD (5 semanas)
Semana 6: Ejecución de TIF
Semana 7: Consumo de glucosa por levaduras en aerobiosis
Ejecución de TIF
Semana 8: Metabolismo de glucógeno en hígado.
Ejecución de TIF
Semana 9: Consumo de glucosa por levaduras en anaerobiosis
Ejecución de TIF
Semana 10:Determinación del efecto de aceptores, dadores e inhibidores de la cadena
respiratoria
Entrega del informe de avance de TIF
S7. Consumo de glucosa en aerobiosis por
Saccharomyces cerevisiae
MSc. Danitza Plasencia Cerna
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
La presente experiencia práctica de laboratorio, tiene como
finalidad la demostración del consumo de glucosa en aerobiosis
por Saccharomyces cerevisiae
Fundamentos teóricos
ETAPA I: Las grandes moléculas de los
alimentos se fragmentan hasta unidades
más pequeñas.
ETAPA II: Las unidades más pequeñas se
degradan hasta unas pocas unidades
simples: Acetil-CoA.
ETAPA III: Las unidades simples: Acetil-
CoA, sufren una oxidación completa para
forma ATP.
ATP
Molécula altamente energética que es sintetizada a partir del catabolismo de
moléculas como glucosa, lípidos, y rara vez proteínas. El ATP es la principal fuente de
energía para las diferentes funciones celulares como la síntesis de otras moléculas, el
transporte a través de las membranas celulares, entre muchas otras funciones.
Una persona de 70 Kg requiere
aprox. 2000 Kcal para realizar
actividades diarias.
Es decir requiere 83 Kg de ATP
Se cuenta con 250g
Reciclaje de ADP a ATP
(El ATP se recicla aprox. 300
veces por día)
ETAPA I: Las grandes moléculas de los
alimentos se fragmentan hasta unidades
más pequeñas.
ETAPA II: Las unidades más pequeñas se
degradan hasta unas pocas unidades
simples: Acetil-CoA.
ETAPA III: Las unidades simples: Acetil-
CoA, sufren una oxidación completa para
forma ATP.
Catabolismo: proceso orgánico mediante el
cual moléculas complejas se simplifican a sus
formas más sencillas, liberando energía que
luego es usada para diferentes tejidos u
órganos del organismo
Catabolismo
Respiración Fermentación
Oxidación total de la materia Oxidación parcial de la materia orgánica
orgánica Los productos de reacción contienen todavía energía
Los productos de reacción no Se libera poca energía
contienen energía El aceptor final de electrones es una molécula
Se libera toda la energía orgánica
Aerobia Anaerobia Alcohólica Láctica
Aceptor final el Aceptor final
O2 molécula
inorgánica
distinta del O2
Respiración anaerobia Fermentación
Proceso metabólico, en ausencia del oxígeno, Proceso biológico que ocurre en condiciones
donde ocurre la oxidoreducción de compuestos anaeróbicas donde se lleva a cabo una
como nitratos, sulfatos, dióxido de carbono, oxidorreducción de la molécula energética
entre otros diferentes al oxígeno NADH, la cual conllevará a la síntesis de ATP en
menor cantidad que la respiración aerobia. La
fermentación puede ocurrir en organismos
aerobios como anaerobios, solamente que no
se utilizará el oxígeno.
Glicólisis
ATP consumido = 2
Vía catabólica que inicia la degradación de la glucosa.
ETAPA I:
Conversión de glucosa (6C) en fructosa 1,6 bifosfato (6C)
ETAPA II:
Ruptura de fructosa 1,6 bifosfato (6C) en dos fragmentos de tres
carbonos
ETAPA III:
Oxidación de los dos fragmentos de tres carbonos hasta 2
piruvato (3C) con la generación de 2 ATP neto y 2 NADH
Balance energético en la glicólisis:
ATP producido = 4
ATP producido - ATP Consumido = 2 ATP
1 GLUCOSA (6C)
2 ATP
2 ADP
2 NAD
2 NADH
4 ADP
4 ATP
2 PIRUVATO (3C)
Transportadores activados de e-: NADH = 2e-
FADH2 = 2e-
1 GLUCOSA (6C)
1 NADH → 2,5 ATP
NADH citoplasma = 2 1 FADH2 → 1,5 ATP
Más energética → 1 NADH = 2.5 ATP 2 NAD 1 GTP → 1 ATP
Menos energética → 1 NADH = 1.5 ATP
2 NADH NADH = 8 → 20 ATP
NADH = 2 → 5 ATP
FADH2 = 2 → 3 ATP
NADH = 2 → 3 ATP
2 ATP GDP = 2 → 2 ATP
-----------
2 PIRUVATO (3C) 25 ATP
2 NAD
2 NADH
• CONSUMO DE GLUCOSA EN 2 ACETIL COA (2C)
2 NAD
PRESENCIA DE O2 2 NAD
• AEROBIOSIS 2 NADH
2 NADH
• RESPIRACIÓN AERÓBICA
2 FAD
2 NAD
2 FADH2
2 NADH
Respiración
(30 -32 moléculas) 2 GDP
aerobia 2 GTP
Respiración aerobia
32 ATP
30 ATP
Respiración
(30 -32 moléculas)
aerobia
Saccharomyces cerevisiae
Es un microorganismo facultativo que
emplea la respiración aerobia al igual que
la fermentación alcohólica para
metabolizar la glucosa como fuente de
energía y de carbono.
Es la especie de levaduras utilizada por
excelencia para la obtención de etanol a
nivel industrial debido a que es un
microorganismo de fácil manipulación y
recuperación
Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae puede llevar a cabo un
metabolismo respiratorio o fermentativo de acuerdo
con concentración de oxígeno.
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
En condiciones aerobias: aumenta la biomasa y
produce poco alcohol
En condiciones anaeróbicas: el crecimiento celular es
lento y la producción de etanol es alta.
Por esta razón, la oxidación completa de la fuente de
carbono a CO2 y H2O presenta una producción celular
óptima, donde el oxígeno es el aceptor final de
electrones en la fosforilación oxidativa durante la
respiración.
Es así, que en concentraciones altas de oxígeno
disuelto la fermentación de azúcar a etanol es inhibida.
Esta situación fue observada por Pasteur en 1967, y se
denomina el efecto Pasteur .
Efecto Pasteur
El efecto Pasteur es un efecto de inhibición de la fermentación
alcohólica debido a la participación de oxígeno (O2).
En 1967, Pasteur fue el primero en observar que el azúcar es
convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y
que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol,
siendo el CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica.
Este efecto indica el mayor rendimiento energético de la
respiración sobre la fermentación.
Efecto Pasteur
El efecto Pasteur se produce en microorganismos facultativos capaces de realizar metabolismo
fermentador (si no hay O2 libre en su medio) y respiración aerobia (en presencia de O2)
Un gran número de levaduras pueden metabolizar los azucares en aerobiosis y en anaerobiosis. Para un
mejor rendimiento celular, se consume menos azúcar en aerobiosis que en anaerobiosis, o dicho de otro
modo, la aerobiosis implica una disminución del consumo de azúcar y una disminución de la
fermentación .
Se obtiene mucha más energía a partir de la oxidación completa de la glucosa que sólo a partir de la
glucólisis.
Cuando los cultivos anaerobios de levaduras que metabolizaban glucosa se exponían al aire, se reducía
drásticamente la tasa de utilización de glucosa.
CO2
Sacarosa
Glucosa + Fructosa Pepas, cáscara, etc
Piruvato
Alcohol
Procedimiento
+ O2
SUSTRATO
SISTEMA DE INCUBACIÓN
1 mL muestra (MUESTRA 1)
Introducir una manguera que esté conectada a una bomba de aire
Incubar a T ambiente x 60 minutos
1 mL muestra (MUESTRA 2)
TOMA DE MUESTRA
1 2
1 mL H2SO4 1 mL H2SO4
Muestra 1 (0 minutos) Muestra 2 (60 minutos)
x 2 minutos x 2 minutos
1 mL Tungstato de sodio 1 mL Tungstato de sodio
x 2 minutos x 2 minutos
7 mL Agua destilada 7 mL Agua destilada
Filtrar Filtrar
DETERMINACIÓN DEL AZÚCAR RESIDUAL
1 2
FILTRADO FILTRADO
Muestra 1 (0 minutos) Muestra 2 (60 minutos)
+ 0,5 mL + 0,5 mL
BLANCO
+ 1 mL Agua
destilada
+ Benedict + Benedict + Benedict Mezclar y colocar en baño de
agua hirviendo x 8 min
La reacción o prueba de Benedict (Solución cúprico alcalina)
La reacción o prueba de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos que
tienen su OH libre en el carbono anomérico), como el lactosa, la glucosa, la
maltosa, y celobiosa.
En un medio alcalino (NaOH), el ion cúprico Cu²+ (otorgado por el sulfato
cúprico, de color azul ) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehído del
azúcar (CHO) a su forma de Cu+. . Este ion, precipita como Cu₂O (óxido
cuproso) de color rojo ladrillo.
AUSENCIA PRESENCIA
de azúcares de azúcares
reductores reductores
DETERMINACIÓN DEL AZÚCAR RESIDUAL
1 2
FILTRADO FILTRADO
Muestra 1 (0 minutos) Muestra 2 (60 minutos)
+ 0,5 mL + 0,5 mL
BLANCO
+ 1 mL Agua
destilada
+ Benedict + Benedict + Benedict Mezclar y colocar en baño de
agua hirviendo x 8 min
+ Solución fosfomolibdica + Solución fosfomolibdica + Solución fosfomolibdica
Mezclar y dejar en reposo x 3 min
Agua destilada Agua destilada Agua destilada
Mezclar, dejar en reposo x 10 min
Solución fosfomolíbdica
Empleado para medir la cantidad de un compuesto reductor como un azúcar
reductor (glucosa). Con la adición de un exceso de ácido fosfomolíbdico se logra
formar azul de molibdeno que se visualiza de color azul.
Cu+1 (red) Solución fosfomolibdica
OXIDADO - INCOLORO
Cu2O
AR (G)
Iones cúpricos → Cu2O + Sol. Fosfomolíbdica (Ox-incoloro) → Azul
Alcalino
Calor
Cu+2 (oxi) Solución fosfomolibdica
REDUCIDO - AZUL
Resultados
BLANCO
MUESTRA 1
(0 MINUTOS)
MUESTRA 2
(60 MINUTOS)
LEER EN EL
ESPECTROFOTÓMETRO
100% 60%
glucosa glucosa
A 420 nm
Consumo = GI – GF
Consumo = 100 – 60
Consumo = 40%
En 1 hora de incubación la levadura ha
consumido el 40% glucosa
¿Preguntas?
BALANCE ENERGÉTICO DE LA OXIDACIÓN COMPLETA DE UNA
MOLÉCULA DE GLUCOSA
AEROBIOSIS
Glucosa → 2 Piruvato (Glucólisis) ---- citoplasma
ATP netos = 02 ATP (04 ATP – 02 ATP)
NADH + H= 02 NADH
según la Lanzadera del NADH → electrones a mitocondria
Glicerol 3-Fosfato → 2 FADH2 mit → F.O. → 3 ATP a
Malato-Aspartato → 2 NADH mit → F.O. → 5 ATP
02 Piruvato → 2 Acetil – CoA ----- mitocondria
NADH + H= 02 → F.O. → 5 ATP
2 Acetil – CoA → 2 Ciclo de Krebs ---mitocondria
Por Ciclo = 10 ATP
NADH + H= 03 → F.O. → 7,5 ATP
Ciclo FADH2= 01 → F.O. → 1,5 ATP
01 GTP = 01 ATP Dos ciclos = 20 ATP
F.O.: Fosforilación Oxidativa TOTAL = 30 a 32 ATP
Balance de los procesos de la respiración aerobia
Proceso Sustancia inicial Sustancia final Coenzimas ATP totales
reducidas y ATP
Glucolisis Glucosa 2 ácido pirúvico 2 NADH 3 a 5 ATP (AER: F.O.)
2ATP 2ATP (a nivel de
sustrato)
Descarboxilación 2 ácido pirúvico 2 acetil Co- A 2 NADH 5 ATP (F.O.)
del ácido pirúvico 2 CO2
Ciclo de Krebs 2 Acetil Co-A 4 CO2 6 NADH 15 ATP (F.O.)
2 FADH2 3 ATP (F.O.)
2 GTP 2 ATP (Aerobiosis)
Balance global Glucosa 6CO2 30 a 32 ATP
6CO2 6H2O
