FACULTAD: NUTRICIÓN Y DIETÉTICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
CURSO: MICROBIOLOGÍA
PROFESOR: CARMEN MEDINA ESCUDERO
INFORME DE PRÁCTICAS
PRÁCTICA N°: 2
TÍTULO: TÉCNICAS DE TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM, TINCIONES ESPECIALES Y
TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE
INTEGRANTES:
- ALBÁN FERNÁNDEZ, SILVIA
- LIMO LAZARTE, FRANCESCA
- RIOS ESCALANTE, CRISTIAN
- VILCA SIERRA, VANESSA.
HORARIO DE PRÁCTICAS:
DIA: LUNES
HORA: 09:10AM – 11:00AM
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 10/04/17
LIMA – PERU
I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias son microorganismo procariotas que poseen una estructura
relativamente simple, es decir, sin membrana nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni
retículo endoplasmático que se reproducen por división asexual. La pared celular que
las rodea es compleja. Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su
ausencia sobreviviendo tan sólo en el interior de las células del organismo anfitrión o
en un ambiente hipertónico. Una de las formas de clasificarlas son por su tamaño; el
tamaño de la mayoría de estas células bacterianas son tan pequeñas que resultan
difíciles observarlas con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste entre la célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse también para localizar estructuras específicas en la célula o para
distinguir diferentes tipos de células.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia son
suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil
para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tiñe. El objetivo principal de todos los ejercicios es
poder conocer el tipo de tinción que se debe usar para cada tipo de microorganismo en
el laboratorio y comprender el por qué se usan estos. Como objetivos específicos
podremos diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas y evidenciar
estructuras específicas microbianas importantes como las esporas y cápsula.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
EJERCICIO N°1: Tinción Gram
- Cultivos de microorganismos (18-24 horas) de: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis.
- Colorantes Básicos: Cristal violeta, Safranina
- Decolorante: Alcohol-Acetona
- Láminas portaobjetos
- Mordiente: Lugol
- Papel Secante
- Piceta de agua.
- Soporte para tinción.
- Asa de Kölle
- Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
Como primer paso se preparó una lámina fija de cada uno de los cultivos
proporcionados, luego se Agregó la solución de Cristal Violeta y se dejó que actúe por 1
minuto, finalmente se enjuagó con agua el exceso de colorante.
(Nota: en este paso y en el resto de pasos de lavado o decoloración es esencial no
arrastrar parte de la preparación en el proceso). Como segundo paso se cubrió con Lugol
la muestra y se dejó que actúe por 30” a 1 minuto, para no acumular los líquidos
administrados, siempre se lavó con agua el exceso después de casa paso. Como tercer
paso se agregó el diferenciador alcohol-acetona hasta que se pudo observar que no
puede arrastrar más colorante de la muestra (entres unos 10-20 segundos). Luego de
lavar con agua los restos del disolvente alcohol-acetona, se agregó agregó el colorante de
contraste safranina por 1 minuto. Se lavó los restos del disolvente y se secó la lámina al
aire o dentro del papel secante. Finalmente se examinó en el microscopio compuesto
bajo un objetivo de 1000x con aceite de inmersión.
EJERCICIO N°2: Tinción de Espora
- Cultivos de 48 horas: Bacillus sp, Clostridiumsp.
- Aceite de inmersión
- Asa de Kölle
- Láminas portaobjeto
- Mechero de Alcohol
- Pinzas
- Soluciones Colorantes: Carbolfucsina, Verde Malaquita 5%
- Solución Decolorante: Alcohol ácido
PROCEDIMIENTO: Técnica de SCHAEFFER y FULTON:
Se preparó en un portaobjetos el microorganismo proporcionado, realizando el
extendido, secado y fijado. Una vez que se obtuvo la muestra esté fija, se le agregó
verde malaquita hasta cubrirla totalmente. Con ayuda de una pinza, luego se
calentó la lámina con el colorante haciéndola pasar ligeramente por la llama del
mechero para poder observar el desprendimiento de vapores buscado. Esta
condición se mantuvo durante tres minutos, evitando que el colorante seque o
entre en ebullición. A continuación se lavó con alcohol ácido hasta que éste resulte
incoloro para que sea enjuagado con agua. La preparación se mantuvo con unas
gotas de carlbolfucsina dejando que actúe por dos minutos, para luego ser
nuevamente enjuagada y secada al aire libre. Finalmente se observó la preparación
en el microscopio compuesto, bajo un objetivo de 1000x con ayuda del aceite de
inmersión.
EJERCICIO N°3: Tinción de Cápsula
- Cultivos de 48 horas: Bacillus sp, Klebsiella pneumoniae.
- Aceite de inmersión
- Asa de Kölle
- Baño de Agua a 100°C
- Láminas portaobjeto
- Soluciones Colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina ó Tinta China
- Tubos con agua destilada estéril
PROCEDIMIENTO:
Se colocó en un extremo de una lámina portaobjetos una gota de tinta china
utilizando el asa de siembra, después se colocó una gota del cultivo sobre la tinta
china y se mezcló en la lámina portaobjetos.
• Se realizó el extendido utilizando otra lámina portaobjetos y se dejó que el
extendido seque naturalmente, que no se debe fijar en el calor del mechero.
Finalmente se colocó un cubreobjetos en la zona central del portaobjetos y se
observó en el microscopio compuesto a un objetivo de 1000x con aceite de
inmersión.
III. RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
1. TINCION GRAM:
Se obtuvo la tinción de la
pared celular de la capa
gruesa de peptidoglucano de
células bacterianas
“Escherichia coli“ color
morado violeta.
Se obtuvo la tinción de la
membrana interna de células
bacterianas “bacillus
subtilis“color rosado.
Discusión:
Esto se dio ya que las paredes de las bacterias gram + sufren una deshidratación al ser tratadas
con alcohol. Esto hace que sus poros se contraigan y el color básico (cristal violeta) no pueda
salir y así permanezca de un color morado y no pueda teñirse con el color contraste
(safranina). Sin embargo, en la Gram -, el alcohol hace que se desorganice la capa lipídica más
externa y lave el colorante básico C.V de la pared delgada y luego al colocar el colorante
contraste (safranina), esta sí quedará totalmente rosa.
2. TINCION DE ESPORAS
Se observó la tinción de
las esporas de color
verde, producto del color
de contraste (verde
malaquita).
Discusión
En esta tinción fue muy importante el uso del colorante verde malaquita y el mechero,
ya que gracias a estos las esporas se llegaron a teñir teniendo en cuenta de que estas
son resistes a factores ambientales adversos. El mechero por ser una fuente que
proporciona calor ayuda a que la bacteria pueda obtener una tinción del verde
malaquita. Las esporas principalmente está compuesto externamente por una capa
protéica, luego reside una capa grueso de polisacáridos compuestos, esta composición
principalmente la mantendrá con una resistencia química.
“La formación apropiada de la corteza es necesaria para la deshidratación de la base
de la espora, que ayuda en resistencia contra temperaturas altas”.
3. TINCION DE CAPSULAS
Se observa en contraste de
todo el fondo coloreado por
tinta china, quedando
totalmente blanco las
capsulas de las células (capa
gruesa de polisacáridos)
secretada por la bacteria.
Discusión
En esta tinción se da ya que la capsula no logró teñirse por las grandes partículas de la
tinta china y esto dificulta el poder fijarse y penetrar las células bacteriana, quedando
totalmente una tinción en negativo.
Al parecer esta estructura es innecesaria para el crecimiento de las bacterias, pero de
suma importancia para su supervivencia en el organismo anfitrión.
La capsula es poco antigénica y antifagocítica; además constituye un factor de
virulencia significativo (Streptococus pneumoniae). Puede actuar también como
barrera frente a moléculas hidrófobas toxicas (detergentes).
IV. CONCLUSIONES:
En conclusión, se pudo observar que dos tinciones lograron teñir las células (Tinción
diferencial Gram y tinción esporas) y otra solo el entorno de ellas (Tinción negativa) ya
que esta última tinción presentaba partículas grandes. También se pudo observar la
diferencia de una Gram + y una Gram – debido a que al final quedaron teñidas
diferente y en el caso de las esporas, siendo resistentes a factores ambientales
lograron teñirse por el verde malaquita.
V. BIBLIOGRAFÍAS
1. Murray P., Rosenthal K., Pfaller M. Microbiología Médica. 6ta edición. 2009. Pg
11-16.
2. Jawetz., Melnick., Adelberg. Microbiología Médica. 25ª edición.
3. Epulopiscium website. Departament of Microbiology. Coronelly
University.2017
