PRÁCTICA N° 02

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE

FITOPATÓGENOS

En el diagnóstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio es de suma importancia

debido a que ahí se efectúa la identificación del agente causal.

El proceso de identificación de un patógeno requiere el aislamiento del mismo, para lo que es

necesaria la elaboración de medios de cultivo que permitan el desarrollo de dicho patógeno.
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el aislamiento,
determinación, desarrollo, reproducción e identificación de aquellos organismos productores de
enfermedades de las plantas, que se comportan como parásitos facultativos. Para lograr el
desarrollo y reproducción de las diferentes especies fitopatógenas, los medios de cultivo deben
reunir características especiales, como nutrientes, humedad, pH, temperatura, asepsia.

I. OBJETIVOS
- Que el estudiante conozca la existencia de diferentes medios de cultivo, para el
aislamiento, multiplicación y conservación de microorganismos, especialmente de
bacterias y hongos.
- Que sea capaz de preparar medios de cultivos más usados en fitopatología.

II. PROCEDIMIENTO
2.1 Medios de cultivo para aislamiento de hongos

a. Agar Papa Dextrosa.

Composición:
- Papa pelada y partida 200 g
- Dextrosa (Glucosa) 20 g
- Agar agar 17 g
- Agua destilada hasta completar 1000 ml

Preparación del medio:

- Cocine las papas en 500 ml de agua destilada estéril por una hora; luego cuele el extracto
de papas a través de una tela de tocuyo o varias capas de gasa.
- En otros 500ml de agua disuelva los 17 gramos de agar agar.
- Mezcle el extracto obtenido de papas más el agar disuelto, completando a un litro con agua
destilada, enseguida disuelva la dextrosa, si es necesario con ayuda del calor.
- Repartir en matraces o balones de 500ml, 250ml. de medio preparado, para posterior
esterilización.
- Después de la esterilización proceder a plaquear o entubar el medio.

b. Agar Harina de Maíz.

Composición:
- Harina de Maíz amarillo 62 g
- Agua destilada 1000 ml

Blga. Ruth Huamán De La Cruz

Blgo. Pedro M. Delgadillo Coronado 1
 Preparación del medio:
a) Llevar por una hora a baño maría la harina de maíz (55-65°C).
b) Filtrar el extracto de maíz por varias capas de gasa.
c) Llevar a volumen de 1Lt. y agregar dextrosa 20g y agar agar 20g.
d) Disolver y autoclavar a 121°C por 15 minutos.

c. Agar Saboraud Dextrosa.

Composición:
- Dextrosa 20 g
- Peptona 10 g
- Agar agar 20 g
- Agua destilada 1000 ml
- ph 5.6 (+/- 0.2)
- Disolver y autoclavar a 121°C por 15 minutos

Preparación del antibiótico:

- Capsula de antibiótico cloranfenicol de 250 mg disolver en 10ml de alcohol 95 %.
- Después de esterilizar el medio de cultivo agregar el antibiótico preparado.

d. Agar Zapallo
Preparación
Se pica 250 g de zapallo, calabaza o cayote y se agrega 1 L de agua. Se calienta a ebullición
durante 30 minutos. Luego se filtra por gasa, se repone el agua perdida y se agrega 20 g de agar.
Se esteriliza 15 minutos a 120°C.

e. Agar Papa-Zanahoria
Preparación
Se rallan 150 g de papa sin pelar y 150 g de zanahoria. Se agrega 1 litro de agua y se cuece durante
una hora. Se cuela por un tamiz o gasa. Se repone el agua perdida y se agrega 20 g de agar. Se
esteriliza a 120ºC durante 15 minutos (Dade & Gunnell 1969).

f. Agar Agua
Preparación
Agua corriente 1 L agar 15 g Se esteriliza a 120ºC durante 15 minutos y se distribuye en placas.
Se colocan unos trozos de hojas de clavel u bananero previamente esterilizadas por vapores de
formaldehído.

Blga. Ruth Huamán De La Cruz

Blgo. Pedro M. Delgadillo Coronado 2
 2.2 Medios de cultivo para Aislamiento de Bacterias

a. Agar YCDA.
Este medio se emplea para el aislamiento de bacterias que atacan plantas. Ejem. Xanthomonas,
Pseudomonas, Erwinia,Agrobacterium. Etc.

Composición:
- Extracto de levadura 10 g
- CaCO3 5g
- Dextrosa 10 g
- Agar Agar 16 g
- Agua destilada 1000 ml

Preparación:
- Disolver el agar y luego agregar el extracto de levadura y la dextrosa, al final se agrega el
carbonato de calcio.
- Esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 15 Libras de presión.
- Al momento de plaquear mover el medio para que se distribuya uniformemente el
carbonato de calcio.

b. Agar YCA.
Es el mismo medio del punto 1 sin la dextrosa. Es un medio útil para conservar preservar cultivos
puros.

c. Agar Nutritivo.
Composición:
- Extracto de carne 3g
- Peptona de carne 5g
- Agar agar 15 g
- Agua destilada 1 litro
- ph final 6.8 +/- 0.2

Preparación:
Suspender los ingredientes en 1 L. de agua destilada y calentar por ebullición hasta disolver.
Esterilice en auto clave por 15 minutos a 15 libras de presión. Dispense como desee.

d. Medio MD1
Composición:
- Manitol 15 g
- NaNO3 5g
- LiCl 6g
- Ca(NO3)2.4H2O 0.002 g
- K2HPO4 2g
- MgSO4.H2O 0.2 g
- Azul de Bromotimol 0.1 g

Blga. Ruth Huamán De La Cruz

Blgo. Pedro M. Delgadillo Coronado 3
 - Agar agar 18 g
- Agua destilada 1000 ml

Preparación:
Suspender los ingredientes en 1 L. de agua destilada y calentar por ebullición hasta disolver.
Esterilice en auto clave por 15 minutos a 15 lbs de presión. Dispense como desee.

e. Medio HUGH Y LEIFSON ( Medio de OF)

El medio OF o de fermentación glucosa es un agar semi-sólido especialmente diseñado para el
estudio del metabolismo oxidativo y fermentativo de los carbohidratos en un grupo importante de
microorganismos diferente a las enterobacterias, denominados bacilos Gram negativos no
entéricos.

Preparación:
 Suspender los ingredientes y disolver en 1 litro de agua destilada. Calentar y agitar hasta
disolver en su totalidad.
 Distribuir asépticamente 5 ml del medio OF en tubos de ensayos con tapa de algodón y
autoclavar a 121 °C, a 15 libras de presión por 15 minutos.
 Dejar solidificar en posición vertical.
 El pH del medio debe quedar en 7, 1. El color del medio preparado es verde. Conservar en
nevera.

Entre los medios de cultivo de uso frecuente en Fitopatología están los siguientes

1. PDA (papa-dextrosa-agar) 10. HMA (harina de maíz-agar)

2. AN (agar nutritivo) 11. JFA (jugo de frijol-agar)
3. HFA (harina de frijol-agar) 12. JTA jugo de tomate-agar)
4. VM (Ougo Va agar) 13. MSA (malta-sal-agar)
5. AVA (avena-agar) 14. BA (Bonner Addoat)
6. TSA (jugo de tomate-sal-agar) 15. BK (medio King B)
7. MM (medio de Martin)
8. VFA (vainas de frijol-agar)
9. AA (agua-agar)

Blga. Ruth Huamán De La Cruz

Blgo. Pedro M. Delgadillo Coronado 4
 CUESTIONARIO

1. Con que finalidad se utiliza el medio APD, YCDA, Medio King B y AHM
2. Por qué se adiciona antibiótico al medio Saboraud y que otro antibiótico se puede
utilizar, fundamente.
3. ¿Cómo preparó APD y por qué se utiliza papa en la preparación?

Los cuestionarios deberán ser enviados mediante classroom en las fechas indicadas en
formato PDF.

Blga. Ruth Huamán De La Cruz

Blgo. Pedro M. Delgadillo Coronado 5