DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR NMP Y CONFIRMACIÓN DE E.
COLI
Estos microorganismos pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su
capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en
un período de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.
Son bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, móviles e
inmóviles, citocromo oxidasa negativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en
48 horas a 35ºC. Del grupo “coliformes” forman parte varios géneros:
- Escherichia
- Enterobacter
- Klebsiella
- Citrobacter
Se encuentran en el intestino del ser humano y de los animales pero también en otros ambientes:
suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como índice de
contaminación fecal por:
- Su frecuencia en heces.
- Su fácil detección en el laboratorio.
- Sus características semejantes, en algún aspecto, a las de algunos miembros patógenos de
la familia Enterobacteriaceae.
Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y por
consiguiente, los que más interesan en el análisis microbiológico de alimentos.
Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli.
Sus principales características son:
- Aptitud para desarrollase entre 43,5-45,5ºC
- Capacidad para crecer en presencia de sales biliares
- Facultad para producir indol en agua de peptona
- Se definen como bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
esporulados, móviles e inmóviles, citocromo oxidasa negativos, que fermenta la lactosa con
producción de ácido y gas en 48 horas a 44,5ºC
En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) indican
manipulación y elaboración deficientes de los alimentos.
Procedimiento
- Para preparar la dilución madre pesar 10 g de alimento y homogeneizar en 90 mL de agua
de peptona tamponada (dilución 1:10).
- Partiendo de la dilución problema preparar el resto de las diluciones.
1.- Recuento presuntivo de coliformes totales
- Inocular 3 tubos que contienen 10 mL de LST caldo (Lauril Sulfato Triptosa) con 1 mL de
cada dilución. Si se realizan 3 diluciones, se deben inocular ( sembrar) 9 tubos con caldo LST.
- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas (si alguno de los tubos a las 24 horas es negativo se
incuba otras 24 horas)
- Confirmar los tubos positivos (color turbio y presencia de gas en la campana Durham)
1A-Recuento confirmativo de coliformes totales por NMP
Hay que confirmar todos los tubos que muestran gas en LST en 48 horas
- Transferir una o dos asas a un tubo de BGBL (Caldo Lactosa-Bilis-Verde-Brillante)
- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas (si alguno de los tubos a las 24 horas es negativo se
incuba otras 24 horas)
- Confirmar los tubos positivos (color turbio y presencia de gas en la campana Durham)
- Calcular el recuento de coliformes. Para ello, se debe tomar la dilución más diluida que
tenga los 3 tubos positivos y las 2 siguientes diluciones. Mirar en la tabla de NMP y dar el resultado
como NMP/g.
1B.-Recuento de Coliformes fecales por NMP
Dentro del grupo coliforme se investiga la presencia de E. coli por ser el coliforme más
estrechamente ligado a contaminación fecal. Una de las características diferenciales de esta
bacteria es la capacidad de fermentar lactosa con producción de ácido y gas a 44ºC.
Se determinan los coliformes fecales a partir de los tubos positivos de LST de la anterior
determinación.
Procedimiento
- Agitar los tubos con gas de LST y transferir de cada tubo positivo un asa al tubo con el
medio EC (E. Coli Caldo)
- Incubar a 44ºC durante 24-48 horas en baño termorregulado.
- Confirmar los tubos positivos (aquellos en los que ha ocurrido la fermentación de la
lactosa, que se aprecia por la aparición de una burbuja en la campana de gas).
- Calcular el recuento de coliformes fecales. Para ello, se debe Tomar la dilución más diluida
que tenga los 3 tubos positivos y las 2 siguientes diluciones. Mirar en la tabla de NMP y dar el
resultado como NMP/g.
2.-Confirmación del NMP de E. Coli
Para confirmar que realmente se trata de E. coli se realiza un subcultivo en placa.
- Subcultivar los tubos de EC con gas en agar Levine (EMB)
- Incubar 24 horas a 37ºC
- Las colonias típicas en agar EMB pueden ser opacas o pigmentadas en rosa, azul o violeta
con o sin brillo metálico.
- Identificación bioquímica de las colonias
- Picar 2 colonias típicas de cada placa y sembrar sobre PCA.
- Incubar a 37ºC 24 horas
- Realizar la prueba del Indol (positiva)
Procedimiento alternativo:
- De los tubos EC positivos se siembran mediante un asa tubos con caldo de triptófano y se
incuban a 44ºC durante 24 horas
- A continuación, se siembran placas de EMB (Agar Levine) a partir de los tubos de caldo de
triptófano previamente incubados. Las placas de EMB se incuban a 44ºC durante 24 horas, al cabo
de las cuales, se observa la presencia de colonias típicas de [Link]
- Una vez realizadas las siembras en agar Levine, los tubos con caldo de triptófano se
pueden utilizar para realizar la prueba del indol
