Southern blot.
- Técnica analítica
utilizada en biología molecular para
detectar o identificar ADN de interés a
partir de una muestra compleja de
ADN. Es también conocida como
hibridación Southern o simplemente
Southern, debido al nombre de su
inventor, Edwin Southern, destacado
biólogo molecular inglés. Como
procedimiento de laboratorio, el
Southern blot se puede utilizar para
analizar el ADN total de un organismo,
también conocido como su genoma,
con el fin de identificar una secuencia
específica de interés.
ANTECEDENTES
La capacidad de las cadenas de ADN para hibridar proviene de su naturaleza
complementaria claramente representada en el modelo de estructura de ADN de
Watson-Crick. En un principio se llevaron a cabo experimentos para estudiar la
capacidad de renaturalización del ADN y la formación de híbridos de ADN / ARN para
comprender la expresión en tejidos o células específicas. A partir de entonces, la
hibridación entró en escena con el desarrollo de sondas que pueden detectar
secuencias específicas dentro de la diana y la inmovilización de las secuencias diana
sobre un soporte sólido como polvo de nitrocelulosa que luego dio lugar a membranas
de nitrocelulosa. La demostración de Southern de que los fragmentos de ADN
separados por electroforesis en gel se pueden transferir a una membrana, permitió la
caracterización del ADN por patrones de hibridación y por tamaños moleculares.
PROCEDIMIENTO
1. Extracción y purificación del ADN. Se realiza la purificación del ADN de interés
según los procedimientos estándar de aislamiento o utilizando kits comerciales
que permiten la extracción de fuentes variadas como células de mamíferos,
plantas, bacterias, hongos.
2. Digestión del ADN con endonucleasas de restricción. El ADN extraído de la
muestra se trata con endonucleasas de restricción, enzimas que cortan las
hebras de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Se
pueden usar una o más enzimas de restricción.
3. Electroforesis en gel de agarosa. Tras la digestión del ADN, los fragmentos de
ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles
de agarosa. Durante el proceso, las moléculas de ADN, que poseen carga
negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar, su velocidad de
migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas más
pequeñas se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor
tamaño. Como resultado se produce una separación continua de los
fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño.
4. Desnaturalización. Los fragmentos de ADN ya separados son bicatenarios por
naturaleza por lo que son tratados con una solución alcalina para
desnaturalizarlos, mientras permanecen en el gel de agarosa. Tras la
neutralización de esta, se obtienen los fragmentos de ADN monocatenario
adecuados para la hibridación con la sonda.
5. Transferencia. Los fragmentos desnaturalizados se transfieren luego a una
membrana de filtro de nailon o nitrocelulosa, lo que se hace colocando el gel
sobre un papel de filtro saturado con tampón y luego colocando la membrana
de filtro de nitrocelulosa en la parte superior del gel. Finalmente, se colocan
unos papeles de filtro secos encima de la membrana. Los fragmentos son
empujados hacia la membrana del filtro de nitrocelulosa por acción capilar y
dan como resultado la impresión de contacto del gel.
6. Hibridación. A continuación, la membrana se expone a una sonda de
hibridación que es un fragmento de ADN con una secuencia específica cuya
presencia en el ADN diana se va a determinar. El ADN de la sonda se marca
para que pueda detectarse, normalmente incorporando radiactividad o
marcando la molécula con un tinte fluorescente o cromogénico.
7. Lavado. Después de la hibridación, la membrana se lava a fondo con un
tampón para eliminar la sonda que está unida de forma inespecífica o cualquier
sonda no unida que esté presente.
8. Autorradiografía. Las regiones hibridadas se detectan colocando la membrana
de nitrocelulosa en contacto con una película fotográfica que muestra las
moléculas de ADN hibridadas. El patrón de hibridación se visualiza en una
película de rayos X por autorradiografía en el caso de que se use una sonda
radiactiva o fluorescente o por el desarrollo de color en la membrana si se usa
un método de detección cromogénico
APLICACIONES
Identificación de ADN específico en una muestra de ADN
Preparación de mapas RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción)
Detección de mutaciones, deleciones o reordenamientos de genes
Determinación de identidad en medicina legal y análisis de huellas genéticas
(VNTR o minisatélites)
Detección e identificación de genes en individuos transgénicos
Mapeo de sitios de restricción
Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Pronóstico del cáncer y diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas
Determinación del peso molecular de un fragmento de restricción y medida de
cantidades relativas en diferentes muestras
