CAPITULO V
Proteinas
Introducción
Las proteínas son los mayores constituyentes de cada célula viva, tienen una función
biológica asociada a las actividades vitales.
En los alimentos, además de la función nutricional, las proteínas tienen propiedades
organolépticas y de textura. Pueden estar combinadas con lípidos y carbohidratos.
𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 = 𝑁 × 6.25%
Origen Vegetal Porcentaje
Origen animal Porcentaje
Arroz integral 7.5 – 9.0%
Leche entera 3.5% Arroz pilado 5.2 – 7.6%
Carne asada 25% Harina de trigo 9.8 – 13.5%
Maiz 7.0 – 9.4%
Huevo entero 13%
Soya 33 – 42%
Almendras 25 – 28%
Papa 10 – 13%
manzana 0.3%
Metodología
El procedimiento mas común para la determinación de proteínas es a través de la
determinación de un elemento o un grupo perteneciente a la proteína. Para convertir en
términos de proteína es necesario un factor. Los elementos analizados generalmente es
carbono o nitrógeno y los grupos son aminoácidos y uniones peptídicas.
ANALISIS ELEMENTALES.
Análisis de carbono:
• Digestión mas fácil que para el nitrógeno.
• Menores errores en el resultado por causa de su mayor cantidad en relación al
nitrógeno.
• Factor de corrección mas constante que para el nitrógeno.
• Mayor dificultad en separar los carbonos pertenecientes a la proteina de los carbonos
de otros componentes.
Análisis de nitrógeno:
• Es la determinación mas utilizada.
• Considera que las proteínas tienen 16% de N en promedio (depende del tipo de
proteína).
• El factor general en la transformación de nitrógeno a proteína es de 6.25, sin embargo
este es diferente para algunos alimentos como: trigo 5.70, leche 6.38, gelatina 5.55.
Método de Kjeldahl: Determinación a
través del nitrógeno total
Propuesto por Kjeldahl en Dinamarca 1883, en un estudio de granos, a sufrido
varias modificaciones, sin embargo continua siendo muy utilizado en la
determinación de proteínas.
Este método determina N orgánico total ( proteico y no proteico). En la mayoría
de los alimentos el N no proteico representa muy poco del total.
Una razón entre el nitrógeno medido y la proteína estimada depende del tipo de
muestra y otros factores. Por ejemplo: en el trigo esta razón es afectada por la
variedad, condiciones de crecimiento, cantidad y tipo de fertilizante utilizado.
Para convertir el nitrógeno medido en proteína, debemos multiplicar el
contenido de nitrógeno por un factor arbitrario.
El procedimiento del método se basa en el calentamiento de la muestra con
acido sulfúrico para su digestión hasta que el carbono e hidrogeno sean
oxidados. El nitrógeno de la proteína es reducido y transformado en sulfato de
amonio. Se adiciona NaOH concentrado y se calienta para la liberación del
amonio dentro de un volumen conocido de una solución de acido borico,
formando borato de amonio, El borato de amonio formado es titulado con una
solución acida patrón (HCl).
Reacciones involucradas en el análisis.
DIGESTIÓN CON H2SO4, K2SO4 Y CATALIZADOR METÁLICO.
𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝒂𝑶𝑯 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑 𝑯𝑪𝒍
Muestra (N orgánico) 𝑵𝑯𝟒 𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝑯𝟑 𝑵𝑯𝟒 𝟑 𝑩𝑶𝟑 𝑵𝑯𝟒 𝑪𝒍 + 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑
ADICIÓN DE EXCESO DE H2SO4 ESTANDAR: CON EL ACIDO NO
REACCIONADO, HACEMOS UNA TITULACION CON NaOH PATRÓN.
𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝒂𝑶𝑯 𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝒂𝑶𝑯
Muestra (N orgánico) 𝑵𝑯𝟒 𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝑯𝟑 𝑵𝑯𝟒 𝟐 𝑺𝑶𝟒 + 𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝑵𝒂𝟐 𝑺𝑶𝟒 + 𝑯𝟐 𝑶
Cálculos:
En una titulación de neutralización, donde:
Número de miliequivalente de acido = número de miliequivalente de base
nº de meq de HCl = nº de meq de N
mL de acido x normalidad del acido = peso N (g) / meq de N
Peso de N (g) = mL de acido x normalidad del acido x 0.014
Peso de N (mg) = mL de acido x normalidad del acido x 14
% N x factor = % de proteína total
PROCEDIMIENTO DE KJELDAHL
𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 ,𝒄𝒂𝒍𝒐𝒓,𝒄𝒂𝒕𝒂𝒍. 𝟐𝑵𝒂𝑶𝑯 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑 𝑯𝑪𝒍
Muestra (N orgánico) 𝑵𝑯𝟒 𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝟐𝑵𝑯𝟑 + 𝑵𝒂𝟐 𝑺𝑶𝟒 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶 𝑵𝑯𝟒 + 𝑯𝟐 𝑩𝑶−
𝟑 𝑵𝑯𝟒 𝑪𝒍 + 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑜 14𝑔 𝑁
%𝑁 = 𝑁𝐻𝐶𝑙 × × × 0.1 %𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = %𝑁 × 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 × 1000 𝑚𝑜𝑙
Modificaciones del método de
Kjeldahl
Adición de catalizadores
• Óxidos metálicos (selenio > mercurio > cobre, hierro, etc.) aceleran la
digestión de la muestra.
Adición de sulfato de potasio
• Aumenta el punto de ebullición de la mescla en la digestión, un exceso
de este reactivo puede causar descomposición y perdida de amonio. La
temperatura de digestión debe estar entre 370 – 410 ℃.
Acido Bórico
• En el método original, el amonio liberado de la muestra es recogido en
acido estandarizado, en la modificación la recuperación se da en exceso
de acido borico. El borato de amonio formado será titulado con un acido
estandarizado, esta solución es ventajosa toda vez que solo será
necesario una solución estandarizada. No es necesario precisar ni la
cantidad ni la concentración de acido bórico.
Método de Dumas
Dumas (1831); Determina N total después de la combustión de la muestra a
700 – 800 ℃, por medida volumétrica de N gaseoso (N2). Es una medida
difícil y sujeta a errores, debido a que la cantidad de muestra es muy
pequeña y por tanto poco representativa, existen equipos que minimizan
los errores. Tamaño de muestra: 100 – 500 mg.
Componentes generales de un analizador de nitrógeno
Dumas. (A) El incinerador. (B) unidad de reducción de cobre para
convertir óxidos de nitrógeno en nitrógeno, columna de
cromatografía de gases (GC) y detector
Análisis por (- grupos)
Método Biuret
• Riegler (1914), basado en la observación de sustancias que contienen
dos o mas enlaces peptídicos forman un complejo de color purpura con
sales de cobre en soluciones alcalinas. La intensidad del color formado
es proporcional a la cantidad de proteína, y la medida es hecha en un
colorímetro a 540 nm.
Ventajas Desventajas
Es bastante especifico al no presentar La necesidad de una curva de calibración con
problemas de interferentes. un estándar conocido de proteína, ej. Proteína
determinada por Kjeldahl.
Es simple, rápido y barato. El color formado en el complejo no es idéntico
para todas las proteínas, sin embargo los
desvíos ocasionados son menores de los
producidos en otros métodos colorimétricos.
Debido a la formación de un complejo con el
enlace peptídico, el método determina proteína.
Método con fenol (Folin-Ciocalteau-Lowry)
• Realizada a partir de 1912, método muy utilizado, se basa en la
interacción de las proteínas con el reactivo fenol y cobre en condiciones
alcalinas, es una reacción colorimétrica producto de una oxidación
catalizada por cobre, de aminoácidos aromáticos por un reactivo
heteropolifosfato ( fosfotungstenico – fosfomolibdinico), produciendo
una coloración azul que se mide en un colorímetro a 650 nm y
comparado con una curva patrón a base de BSA.
Ventajas Desventajas
Es 10 a 20 veces mas sensible que la La intensidad del color puede variar en función a
determinación por UV, Y 100 veces mas sensible los aminoácidos presentes en la proteína y
que el método de Biuret. también de las condiciones analíticas.
Es muy especifico, pocas sustancias Es lento
interferentes, siendo la sacarosa en altas
concentraciones un interferente.
Destruye la muestra.
Múltiples operaciones
Necesita un periodo de reacción entre la adición
de reactivos.
Necesita una curva patrón con una proteína
conocida.
Método por espectrofotometría UV
La mayoría de las proteínas poseen absorción en el rango UV en 280 nm debido
a la presencia de tirosina, triptófano y fenilalanina (aminoácidos aromáticos), por
su anillo bencénico por lo tanto posee múltiples enlaces conjugados.
Ventajas Desventajas
Rápido Resultados no muy precisos, ya que
dependen de la concentración de
los tres aminoácidos dentro de la
proteína.
Simple No hay interferencia con las sales
de amonio, sin embargo los ácidos
nucleicos pueden ser interferentes.
No destructivo Preparación de la muestra muy
larga.
La fluorescencia del triptófano
puede generar interferencia.
Métodos turbidimétricos
Basada en la turbidez causada por la proteína precipitada por algún agente
precipitante ( acido tricloroacetico, ferricianuro de potasio, acido sulfosalicilico).
Ventajas Desventajas
Rápido No compensa su utilización con
muestras solidas, donde la proteína
debe ser extraída para estar en
solución.
Simple para muestras liquidas Los resultados varían según el tipo
(proteínas en solución) de proteína.
Interferencias ocasionadas por
sustancias precipitadas con las
proteínas.
Depende de la curva de calibración
con estándares determinados por
otros métodos.
Metodo Dye - Binding
1944, Una muestra tratada con exceso de colorante (tipo indicador), el colorante
y la proteína reaccionan cuantitativamente para formar un complejo insoluble que
puede ser separado por centrifugación y/o filtración.
El exceso de colorante que no reacciono presente en la solución es cuantificado
colorimétricamente y por diferencia, se obtiene indirectamente la cantidad de
proteína presente en la muestra.
Una relación entre la cantidad del colorante ligado y el contenido de proteína de
la muestra permite la construcción de una tabla de conversión para cada
alimento (ej. Para granos de cereales), existen equipos diseñados para este fin,
los colorantes mas utilizados son: Naranja G., Naranja 12, Rojo A, Negro bufalo y
negro amino 10B.
Este método tiene buena correlación con el método oficial de Kjeldahl.
Ventajas Desventajas
Simplicidad Depende del equipamiento.
Rapidez
Exactitud
Económico
Métodos físicos
Son varios métodos, sin embargo no son muy utilizados, por lo que solo serán
citados:
• Índice de refracción.
• Densidad especifica.
• Viscosidad.
• Tensión superficial
• Conductividad
• Polarización.
RESUMEN
• Los métodos de Kjeldahl y Dumas miden el nitrógeno.
• La espectroscopia infrarroja se basa en la absorción de una longitud de
onda de radiación infrarroja específica para el enlace peptídico.
• Las interacciones del enlace cobre-péptido contribuyen al análisis mediante
los métodos de biuret, Lowry y BCA.
• Los aminoácidos están involucrados en los métodos de Lowry, BCA, tintura
y UV de 280 nm. El método BCA también utiliza el poder reductor de las
proteínas en una solución alcalina. Los diferentes métodos difieren en su
velocidad y sensibilidad.
• Debido a la naturaleza compleja de los diversos sistemas alimentarios,
pueden encontrarse problemas en diferentes grados en el análisis de
proteínas mediante los métodos disponibles.
• Los métodos rápidos pueden ser adecuados para fines de control de
calidad, mientras que se requiere un método sensible para trabajar con una
cantidad mínima de proteína.
• Los métodos colorimétricos indirectos generalmente requieren el uso de un
estándar de proteínas cuidadosamente seleccionado o una calibración con
un método oficial.
Mayor constituyente, con función
biológica, nutricional, organoléptica y
textural
PROTEINAS
CARBONO METODOS DE DETERMINACION
EN FUNCION A LOS ENLACES
EN FUNCION DE UN ELEMENTO EN FUNCION A LOS AMINOACIDOS
PEPTIDICOS
FOLIN
NITROGENO BIURET, 540 nm
CIOCALTEAU ESPECTROFOTOMETRIA UV, 280 nm
LOWRY, 650 nm
Es el mas utilizado, considera
que las proteínas tienen 16% N
KJELDAHL
𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒,𝒄𝒂𝒍𝒐𝒓,𝒄𝒂𝒕𝒂𝒍. 𝟐𝑵𝒂𝑶𝑯 𝑯𝟑𝑩𝑶𝟑 𝑯𝑪𝒍
Muestra (N orgánico) 𝑵𝑯𝟒 𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝟐𝑵𝑯𝟑 + 𝑵𝒂𝟐 𝑺𝑶𝟒 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶 𝑵𝑯𝟒 + 𝑯𝟐 𝑩𝑶−
𝟑 𝑵𝑯𝟒 𝑪𝒍 + 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑
DUMAS
Comparación de métodos de
análisis de proteínas
METODO BASE QUIMICA PRINCIPIO VENTAJAS DESVENTAJAS APLICACIONES
Kjeldahl Nitrógeno (orgánico Determina N por un Barato (si no es un Mide el N orgánico Aplicable a todos
total) método que sistema total, y no solo la los alimentos. Poco
implique digestión, automatizado). proteína N. utilizado ahora,
neutralización, Método Consume mucho debido a la
destilación y ampliamente tiempo. Utiliza disponibilidad de
titulación. Usa el utilizado y aceptado reactivos sistemas Dumas
contenido de N para durante más de un corrosivos. Menor automatizados
calcular el siglo. precisión que otros
contenido de métodos.
proteínas
Dumas Nitrógeno (total Se libera N tras la No requiere Equipo costoso. Aplicable a todos
orgánico e combustión de la productos químicos Mide el total de N los alimentos.
inorgánico) muestra a muy alta peligrosos. Rápido orgánico e Ampliamente
temperatura. El gas (pocos minutos). inorgánico, y no utilizado ahora, en
N se cuantifica por Los instrumentos solo el N de la comparación con el
cromatografía de automatizados proteína . método Kjeldahl,
gases utilizando un permiten analizar tanto para fines
detector de muchas muestras oficiales como de
conductividad sin atención control de calidad.
térmica. Utilice el
contenido de N para
calcular el
contenido de
proteínas.
Comparación de métodos de análisis de proteínas
METODO BASE PRINCIPIO VENTAJAS DESVENTAJAS APLICACIONE
QUIMICA S
Espectroscopia Enlace peptídico La presencia del Forma rápida de Equipo costoso. Solo Aplicable a una
infrarroja enlace peptídico en estimar el contenido de proporciona una amplia gama de
las moléculas de proteínas. Requiere estimación del contenido productos
proteína provoca la entrenamiento mínimo de proteínas. El alimenticios
absorción de instrumento debe (granos, cereales,
radiación a una calibrarse con los carne, lácteos). Se
longitud de onda resultados de los métodos utiliza como método
específica en la oficiales. rápido de control de
región del infrarrojo calidad.
medio o cercano
Colorante Residuos de Los residuos Rápido (15 minutos o No es tan sensible como Versión
aniónico aminoácidos identificados menos para el método algunos otros métodos automatizada
básicos (de reaccionan con el no automatizado; colorimétricos. Requiere utilizada para fines
histidina, arginina colorante aniónico de mucho menos para el una curva de calibración de control de
y lisina) y N- ácido sulfónico para método automatizado). para un producto calidad,
terminal de la formar un complejo Relativamente preciso. alimenticio dado, ya que especialmente
molécula de insoluble. El tinte Sin reactivos las proteínas difieren en el como un método
proteína soluble no unido se corrosivos. No mide la contenido de aminoácidos para comparar
mide por absorbancia no proteína N. Más básicos, por lo que difieren resultados con un
y se relaciona con la precisa que el método en la capacidad de unión método basado en
concentración de Kjeldahl. Se puede del colorante. No es nitrógeno (para
proteínas. usar para estimar adecuado para proteínas verificar la
cambios en el hidrolizadas debido a la adulteración
contenido de lisina unión del colorante a económica)
disponible, ya que el aminoácidos N-terminales.
tinte no se une a la Algunos componentes no
lisina alterada, no proteicos se unen a
disponible colorantes o proteínas para
causar errores
Comparación de métodos de
análisis de proteínas
METODO BASE PRINCIPIO VENTAJAS DESVENTAJAS APLICACIONES
QUIMICA
Ácido Enlace El enlace peptídico Buena sensibilidad, y el El color no es estable con Método
bicinconínico peptídico y está complejado con método micro-BCA es aún el tiempo. Cualquier ampliamente
aminoácido iones cúpricos en mejor (0.5-10 ug). Los compuesto capaz de utilizado para el
s condiciones alcalinas. detergentes no iónicos y reducir Cu+2 a Cu+ aislamiento y
específicos Los iones cuprosos las sales tampón no conducirá a la formación purificación de
(cisteína, son quelados por interfieren con la reacción, de color. Los azúcares proteínas. Ha
cistina, reactivo BCA para dar ni las concentraciones reductores y las altas reemplazado en
triptófano y color medido por medias de reactivos concentraciones de gran medida a otros
tirosina) espectroscopía. desnaturalizantes. sulfato de amonio métodos
interfieren. Obtener colorimétricos de
variación de color entre investigación
proteínas cuantitativa
Absorbancia Tirosina y Los aminoácidos Rápido. Relativamente Los ácidos nucleicos Se utiliza mejor en
a 280 nm. triptófano aromáticos, el sensible (se requieren 100 pueden absorber a 280 sistemas de
triptófano y la tirosina, ug de proteína). Sin nm. El contenido de proteínas
hacen que las interferencia del sulfato de aminoácidos aromáticos purificadas (por
proteínas se absorban amonio y otras sales en las proteínas varía ejemplo, detección
a 280 nm. La tampón. No destructivo entre las fuentes de postcolumna de
absorbancia se puede (por lo que las muestras se alimentos, por lo que los proteínas intactas)
usar para estimar el pueden usar después de la resultados son
contenido de proteínas determinación de cualitativos. Requiere
proteínas) muestras relativamente
puras, claras e incoloras
Comparación de métodos de
análisis de proteínas
METODO BASE PRINCIPIO VENTAJAS DESVENTAJAS APLICACIONES
QUIMICA
Absorbancia Enlace Los enlaces peptídicos Rápido. No destructivo Muchas otras cosas Se utiliza mejor con
a 220 nm. peptídico hacen que las (por lo que las muestras se además de los enlaces sistemas de
proteínas se absorban pueden usar después de la peptídicos absorben a proteínas
a 220 nm. La determinación de 220 nm. Requiere purificadas e
absorbancia se puede proteínas) muestras relativamente hidrolizadas (es
usar para estimar el puras, claras e incoloras decir, detección
contenido de proteínas postcolumna de
proteínas
hidrolizadas)
Biuret Enlace El enlace peptídico se Menos costoso, más
peptídico compleja con iones rápido y más simple que el
cúpricos en método Kjeldahl. No
condiciones alcalinas detecta fuentes de no
para dar un color que péptidos o no proteicas.
se cuantifica por Pocas interferencias
espectroscopía.
ACTIVIDAD
Se analizó un contenido de proteína cruda en una muestra de frijol pinto previamente
cocido y deshidratado utilizando el método Kjeldahl. Se registraron los siguientes datos:
• Contenido de humedad = 8.00%
• Peso de la muestra 1 = 1,015 g
• Peso de la muestra 2 = 1,025 g
• Normalidad del HCl utilizado para la titulación = 0.1142 N
• HCl utilizado para la muestra 1 = 22.0 mL
• HCl usado para la muestra 2 = 22.5 mL
• HCl usado para reactivo en blanco = 0.2 mL
• Calcular el contenido de proteína cruda tanto en húmedo y en base al peso seco del
frijol pinto,
• asumiendo que la proteína de frijol pinto contiene 17.5% nitrógeno.
